一種細菌纖維素膜組織工程化人工肌腱支架的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種細菌纖維素膜（BC膜）組織工程化人工肌腱支架的制備方法。技術方案如下：將木糖葡糖醋桿菌菌種接種到固體培養(yǎng)基活化后，在搖床的條件下培養(yǎng)24～32h制成木糖葡糖醋桿菌種子液。木糖葡糖醋桿菌種子液接入6 ?8%體積的接種量接入到酒糟降解液復合液中，28℃靜置培養(yǎng)4～6得到細菌纖維素膜。取細菌纖維素膜，沖洗后將細菌纖維素膜用蒸餾水浸24～28h，得到白色半透明的細菌纖維素膜。本發(fā)明的有益效果是以細菌纖維素膜（BC膜）作為支架材料，與傳統(tǒng)的高分子材料相比，孔隙率、持水性、復水性、力學性能符合要求，而且具有天然、細胞相容性好等特點，符合組織工程化人工肌腱支架的要求。
【專利說明】
一種細菌纖維素膜組織工程化人工肌腱支架的制備方法
技術領域
[0001]本發(fā)明涉及組織工程材料技術領域。具體而言，涉及一種細菌纖維素膜(BC膜)組織工程化人工肌腱支架的制備方法。
【背景技術】
[0002]肌腱受損的患者往往是運動員和從事體力勞動者，肌腱沒能及時修復而不能活動的情況，患者肢體和心理感覺痛苦，如果放棄治療，導致其殘疾。近年來，組織工程化肌腱為臨床肌腱缺損修復提供了更為理想的、符合生理特點的方法，其主要原理是提供一個能滿足肌腱力學性能的細胞生長支架，在體外或體內(nèi)植入種子細胞，通過調(diào)控形成肌腱樣組織，從而使肌腱缺損得到修復，但此方法要求技術難度較大且理想的肌腱組織工程支架材料是非常難選擇。理想的肌腱組織工程支架材料不僅應具備一定的孔隙率、吸水率、良好的生物相容性等一般支架材料所具有的特性，還應具備相應的力學強度、無免疫原性等特性。
[0003]細菌纖維素(Bacterial cellulose BC)是一種在自然環(huán)境下，微生物發(fā)酵產(chǎn)生的一種納米級纖維素。由單一的葡萄糖通過化學鍵形成。擁有良好的抗拉伸能力與韌性，優(yōu)良的生物相容性和生物可降解性。細菌纖維素本身就是在液體環(huán)境中發(fā)酵產(chǎn)生的，擁有良好的親水性和持水性。因此，BC在和以前出現(xiàn)的化工合成纖維材料相比，在力學性能和生物親和力上都更加接近天然肌腱，具有成為受損肌腱替代品的潛能。在近年的組織工程學研究中，BC膜作為熱門研究生物材料，已經(jīng)在眼睛的晶狀體的替換上取得了成功。所以，以BC膜作為組織工程化肌腱的支架材料是較好的選擇。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明采用木糖葡糖醋桿菌((Wucoace1/?acier us)制備細菌纖維素膜(BC膜)，組織工程化人工肌腱支架。所制備的組織工程化人工肌腱支架孔隙率、持水性、復水性、力學性能、細胞毒性和細胞相容性等技術指標符合組織工程化肌腱支架的要求。
[0005]為實現(xiàn)本發(fā)明的目的而采用技術方案如下:
一、BC膜的制備
(一)制備
1、將木糖葡糖醋桿菌(Glucoace tobacter xylinus)菌種接種到固體培養(yǎng)基進行常規(guī)的活化后，從固體培養(yǎng)基上挑選活化的菌種，接入裝有I OOml液體培養(yǎng)基的500ml錐形瓶，在28°C和160r/min搖床的條件下培養(yǎng)24?32h制成木糖葡糖醋桿菌種子液，備用。
[0006]2、木糖葡糖醋桿菌種子液以每升酒糟降解液復合液接入6 -8%體積的接種量，接入到酒糟降解液復合液中，充分震蕩，使菌液均勻后，放置于28°C培養(yǎng)箱中進行靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)4?6天后，可見液體培養(yǎng)基液面浮有細菌纖維素膜，此時細菌纖維素膜厚度為2.5?4.5 mm η
[0007]3、取出浮于培養(yǎng)基表面的細菌纖維素膜，用自來水多次沖洗后，放于0.1M的NaOH溶液中加熱并煮沸l(wèi)Omin，去除膜中的培養(yǎng)基和菌體等雜質(zhì)。取出，加蒸餾水漂洗10 min。再將細菌纖維素膜放于0.1M的NaOH溶液并再次煮沸1min，用蒸餾水多次漂洗細菌纖維素膜，直至洗滌水pH值為7.0為止。
[0008]4、將細菌纖維素膜用蒸餾水浸24?28h，得到白色半透明的細菌纖維素膜。此時，所制備的細菌纖維素膜由細小的纖維束交錯形成中間為大量納米級孔隙的纖維素膜。
[0009]所述的菌種為木糖葡糖醋桿菌(6^ucoace1/?acier，編號為I.1812，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。
[0010]所述的固體培養(yǎng)基制備配方為:3%葡萄糖，0.8%蛋白胨，0.8%酵母浸出物，0.1%檸檬酸，0.6%磷酸氫二鈉，0.2%硫酸鎂，2%瓊脂粉。按常規(guī)配制，滅菌備用。
[0011]所述的液體培養(yǎng)基，其配方為:2%葡萄糖，0.5%蛋白胨，0.5%酵母浸出物，0.1%檸檬酸，0.2%磷酸氫二鈉，0.1%硫酸鎂;液體培養(yǎng)基pH 6.0-6.5。
[0012]所述的酒糟降解液復合液，以酒糟降解液為母液，含有0.2%葡萄糖，0.05%蛋白胨，0.05%酵母浸出物，0.01%檸檬酸，0.02%磷酸氫二鈉，0.01%硫酸鎂；酒糟降解液復合液pH6.0?6.5，滅菌備用。
[0013]酒糟降解液的制備:將100重量份機榨黃酒酒糟中加入50?60重量份55 V熱水，攪拌混合，再加I重量份復合酶酶解5?6小時，酶解條件:品溫為45°C?50°C，pH 6.0?6.5。酶解后經(jīng)過濾機過濾的液體為酒糟降解液，滅菌備用。
[0014]所述的復合酶，其組分為中溫α-淀粉酶:糖化酶:中性蛋白酶=3:4:3。
[0015]所述的中溫α-淀粉酶、糖化酶、中性蛋白酶購自諾維信(中國)生物技術有限公司。
[0016](二)性能測試
1、將以上制備的BC膜，進行孔隙率、持水性、復水性、力學性能測試。經(jīng)測定本發(fā)明制備的BC膜孔隙率為96-98%;持水性為97-99%;復水性為52-55，具有相當高的親水性，能夠適用于生物體內(nèi)的液體環(huán)境。
[0017]2、力學性能測試:將以上制備的BC膜，進行極限拉伸強度測試。經(jīng)測試，極限拉伸強度為38Ν-42 N，斷裂伸長率24-26%。
[0018]3、以浸提液法檢測BC膜的細胞毒性為I級，說明BC膜對細胞生長無毒性。符合生物材料安全要求。
[0019]二、支架成型
(一)制備
采用基本符合天然肌腱外形和尺寸的二分開不銹鋼模具，將本發(fā)明制備的孔隙率、持水性、復水性、力學性能技術指標符合要求的BC膜，填充于模具內(nèi)，壓制定型成組織工程化人工肌腱支架，將壓制定型后支架放在高壓滅菌鍋中進行溫度121°C、15min的滅菌處理，滅菌處理后降到室溫后，放入4°C冰箱保存、備用。由于模具內(nèi)底部刻有單向凹凸淺花紋，因而壓制定型成組織工程化人工肌腱支架表面也具有單向淺花紋。
[0020](二)驗證試驗
將本發(fā)明制備的組織工程化人工肌腱支架浸泡入DMEM低糖培養(yǎng)基(含10%FBS)中24h，置于細胞培養(yǎng)箱中，使人工肌腱支架充分吸收DMEM低糖培養(yǎng)基；將骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)植到已充分吸收DMEM低糖培養(yǎng)基的組織工程化人工肌腱支架上。選用種子細胞為骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)，骨髓間充質(zhì)干細胞濃度為1-2 X 105/ml。經(jīng)過細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，經(jīng)觀察未感染雜菌，可用于下一步驗證實驗。
[0021](I)人工肌腱支架附上種子細胞培養(yǎng)的HE染色:
人工肌腱支架附上骨髓間充質(zhì)干細胞進行體外培養(yǎng)后，HE染色試驗。在2周開始，體外培養(yǎng)新生細胞在人工肌腱支架上附著并大量分裂。此時的細胞數(shù)量雖多，但是分布紊亂，沒有條理。經(jīng)6周后，細胞數(shù)量開始減少;8周后，細胞數(shù)量趨于穩(wěn)定，而細胞排布也開始向受力方向有條理地排列；在12周，體外培養(yǎng)新生細胞數(shù)量與天然肌腱細胞數(shù)量相近，細胞也顯現(xiàn)出向受力方向排列。
[0022](2)人工肌腱支架附上種子細胞培養(yǎng)的免疫組化:
人工肌腱支架附上骨髓間充質(zhì)干細胞進行體外培養(yǎng)后，免疫組化試驗。在4周膠原蛋白I型開始大量表達，并在12周達到天然肌腱水平。在12周，體外培養(yǎng)新生細胞的膠原蛋白I型程度已經(jīng)和天然肌腱相當接近。
[0023]體外培養(yǎng)新生細胞在4周開始，膠原蛋白m型有少量表達。到8周，膠原蛋白m型才開始大量表達。在12周，體外培養(yǎng)新生細胞的膠原蛋白m型表達高于對照組水平。
[0024]HE染色和免疫組化試驗證明:骨髓間充質(zhì)干細胞作為種子細胞能夠附著在植入的BC膜支架材料上，并生長分泌膠原蛋白。人工肌腱支架上種子細胞培養(yǎng)可以良好生長增值，本發(fā)明制備的BC膜可以作為組織工程化肌腱的支架材料。
[0025]所述的DMEM低糖培養(yǎng)基、骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)可從市場直接購得。
[0026]本發(fā)明的細菌纖維素支架材料功效是:1、微生物培養(yǎng)得到天然產(chǎn)物細菌纖維素膜(BC膜)作為支架材料，不存在材料來源限制。2、其作為生物支架材料具有孔隙率、持水性、復水性、力學性能好，而且具有良好細胞相容性等特點，符合組織工程化人工肌腱支架的要求。
【附圖說明】
[0027]圖1是12周BC膜人工肌腱支架的新生細胞HE染色圖。
[0028]圖2是12周BC膜人工肌腱支架新生細胞的膠原蛋白I免疫組化染色圖。
[0029]圖3是12周BC膜人工肌腱支架新生細胞的膠原蛋白ΙΠ免疫組化染色圖。
[0030]【具體實施方式】:
實施例1
一、BC膜的制備 (一)制備
1、將木糖葡糖醋桿菌(Gl ucoace tobacter xyl inus)菌種接種到固體培養(yǎng)基進行常規(guī)的活化后，從固體培養(yǎng)基上挑選活化的菌種，接入裝有I OOml液體培養(yǎng)基的500ml錐形瓶，在28°C和160r/min搖床的條件下培養(yǎng)24?32h制成木糖葡糖醋桿菌種子液備用。
[0031]2、木糖葡糖醋桿菌種子液以每升酒糟降解液復合液接入8%體積的接種量，接入到酒糟降解液復合液中，充分震蕩，使菌液均勻后，放置于28°C培養(yǎng)箱中進行靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)5天后，可見液體培養(yǎng)基液面浮有細菌纖維素膜，此時細菌纖維素膜厚度為3.1mm。
[0032]3、取出浮于培養(yǎng)基表面的細菌纖維素膜，用自來水多次沖洗后，放于0.1M的NaOH溶液中加熱并煮沸l(wèi)Omin，去除膜中的培養(yǎng)基和菌體等雜質(zhì)。取出，加蒸餾水漂洗10 min。再將細菌纖維素膜放于0.1M的NaOH溶液并再次煮沸1min，用蒸餾水多次漂洗細菌纖維素膜，直至洗滌水pH值為7.0為止。
[0033]4、將細菌纖維素膜用蒸餾水浸26h，得到白色半透明的細菌纖維素膜。此時，所制備的細菌纖維素膜由細小的纖維束交錯形成中間為大量納米級孔隙的纖維素膜。
[0034]所述的菌種為木糖葡糖醋桿菌(6^ucoace1/?acier，編號為I.1812，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。
[0035]所述的固體培養(yǎng)基制備配方為:3%葡萄糖，0.8%蛋白胨，0.8%酵母浸出物，0.1%檸檬酸，0.6%磷酸氫二鈉，0.2%硫酸鎂，2%瓊脂粉。按常規(guī)配制，滅菌備用。
[0036]所述的液體培養(yǎng)基，其配方為:2%葡萄糖，0.5%蛋白胨，0.5%酵母浸出物，0.1%檸檬酸，0.2%磷酸氫二鈉，0.1%硫酸鎂;液體培養(yǎng)基pH 6.0-6.5。
[0037]所述的酒糟降解液復合液，含有0.2%葡萄糖，0.05%蛋白胨，0.05%酵母浸出物，
0.01%梓檬酸，0.02%磷酸氫二鈉，0.01%硫酸鎂，調(diào)整pH 6.0-6.5，滅菌備用。
[0038]酒糟降解液的制備:將100重量份機榨黃酒酒糟中加入55重量份55V熱水，攪拌混合，再加I重量份復合酶酶解5小時，酶解條件:品溫為50°C，pH 6.0。酶解后經(jīng)過濾機過濾的液體為酒糟降解液，滅菌備用。
[0039]所述的復合酶，其組分為中溫α-淀粉酶:糖化酶:中性蛋白酶=3:4:3。
[0040]所述的中溫α-淀粉酶、糖化酶、中性蛋白酶購自諾維信(中國)生物技術有限公司。
[0041](二)性能測試
1、將以上制備的BC膜，進行孔隙率、持水性、復水性、力學性能測試。經(jīng)測定本發(fā)明制備的BC膜孔隙率為96%;持水性為97%;復水性為52，具有相當高的親水性，能夠適用于生物體內(nèi)的液體環(huán)境。
[0042]2、力學性能測試:將以上制備的BC膜，進行極限拉伸強度測試。經(jīng)測試，極限拉伸強度為41 N，斷裂伸長率26%。
[0043]3、以浸提液法檢測BC膜的細胞毒性為I級，說明BC膜對細胞生長無毒性。符合生物材料安全要求。
[0044]二、BC膜支架材料成型制備
(一)制備
采用基本符合天然肌腱外形和尺寸的二分開不銹鋼模具，將本發(fā)明制備的孔隙率、持水性、復水性、力學性能技術指標符合要求的BC膜，填充于模具內(nèi)，壓制定型成組織工程化人工肌腱支架，將壓制定型后支架放在高壓滅菌鍋中進行溫度121°C、15min的滅菌處理，滅菌處理后降到室溫后，放入4°C冰箱保存、備用。由于模具內(nèi)底部刻有單向凹凸淺花紋，因而壓制定型成組織工程化人工肌腱支架表面也具有單向淺花紋。
[0045](二)驗證試驗
將本發(fā)明制備的組織工程化人工肌腱支架浸泡入DMEM低糖培養(yǎng)基(含10%FBS)中24h，置于細胞培養(yǎng)箱中，使人工肌腱支架充分吸收DMEM低糖培養(yǎng)基；將骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)植到已充分吸收DMEM低糖培養(yǎng)基的組織工程化人工肌腱支架上。選用種子細胞為骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)，骨髓間充質(zhì)干細胞濃度為2 XlO5Ail。經(jīng)過細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，經(jīng)觀察未感染雜菌，可用于下一步驗證實驗。
[0046](I)人工肌腱支架附上種子細胞培養(yǎng)的HE染色:
人工肌腱支架附上骨髓間充質(zhì)干細胞進行體外培養(yǎng)后，HE染色試驗。在2周開始，體外培養(yǎng)新生細胞在人工肌腱支架上附著并大量分裂。此時的細胞數(shù)量雖多，但是分布紊亂，沒有條理。經(jīng)6周后，細胞數(shù)量開始減少;8周后，細胞數(shù)量趨于穩(wěn)定，而細胞排布也開始向受力方向有條理地排列；在12周，體外培養(yǎng)新生細胞數(shù)量與天然肌腱細胞數(shù)量相近，細胞也顯現(xiàn)出向受力方向排列，如圖1所示。
[0047](2)人工肌腱支架附上種子細胞培養(yǎng)的免疫組化:
人工肌腱支架附上骨髓間充質(zhì)干細胞進行體外培養(yǎng)后，免疫組化試驗。在4周膠原蛋白I型開始大量表達，并在12周達到天然肌腱水平。在12周，體外培養(yǎng)新生細胞的膠原蛋白I型程度已經(jīng)和天然肌腱相當接近，如圖2所示。
[0048]體外培養(yǎng)新生細胞在4周開始，膠原蛋白m型有少量表達。到8周，膠原蛋白m型才開始大量表達。在12周，體外培養(yǎng)新生細胞的膠原蛋白m型表達，如圖3所示。
【主權項】
1、一種細菌纖維素膜組織工程化人工肌腱支架的制備方法，其特征是: I)將木糖葡糖醋桿菌((Wucoace1/?acier ifius)菌種接種到固體培養(yǎng)基進行常規(guī)的活化后，從固體培養(yǎng)基上挑選活化的菌種，接入裝有I OOml液體培養(yǎng)基的500ml錐形瓶，在28°C和160r/min搖床的條件下培養(yǎng)24?32h制成木糖葡糖醋桿菌種子液，備用；2、木糖葡糖醋桿菌種子液以每升酒糟降解液復合液接入6?8%體積的接種量，接入到酒糟降解液復合液中，充分震蕩，使菌液均勻后，放置于28°C培養(yǎng)箱中進行靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)4?6天后，可見液體培養(yǎng)基液面浮有細菌纖維素膜，此時細菌纖維素膜厚度為2.5?4.5 mm ；3、取出浮于培養(yǎng)基表面的細菌纖維素膜，用自來水多次沖洗后，放于0.1M的NaOH溶液中加熱并煮沸l(wèi)Omin，去除膜中的培養(yǎng)基和菌體等雜質(zhì)，取出，加蒸餾水漂洗10 min。再將細菌纖維素膜放于0.1M的NaOH溶液并再次煮沸l(wèi)Omin，用蒸餾水多次漂洗細菌纖維素膜，直至洗滌水pH值為7.0為止； 4)將細菌纖維素膜用蒸餾水浸24?28h，得到白色半透明的細菌纖維素膜； 5)采用基本符合天然肌腱形狀和尺寸的不銹鋼模具，將本發(fā)明制備的BC膜，填充于模具內(nèi)，壓制定型得到本發(fā)明所述的天然肌腱組織工程化BC膜支架材料。 2.根據(jù)權利要求1所述的一種細菌纖維素膜組織工程化人工肌腱支架的制備方法，其特征是所述的菌種為木糖葡糖醋桿菌((Wt/coace1Aacier，編號為1.1812，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。 3.根據(jù)權利要求1所述的一種細菌纖維素膜組織工程化人工肌腱支架的制備方法，其特征是所述的固體培養(yǎng)基制備配方為:葡萄糖3%，蛋白胨0.8%，酵母浸出物0.8%，檸檬酸0.1%，磷酸氫二鈉0.6%，硫酸鎂0.2%，瓊脂粉2%按常規(guī)加水配制，滅菌備用。4.根據(jù)權利要求1所述的一種細菌纖維素膜組織工程化人工肌腱支架的制備方法，其特征是所述的液體培養(yǎng)基制備:葡萄糖2%，蛋白胨0.5%，酵母浸出物0.5%，梓檬酸0.1%，磷酸氫二鈉0.2%，硫酸鎂0.1%；液體培養(yǎng)基pH 6.0-6.5。5.根據(jù)權利要求1所述的一種細菌纖維素膜組織工程化人工肌腱支架的制備方法，其特征是所述的酒糟降解液復合液，以酒糟降解液為母液，含有0.2%葡萄糖，0.05%蛋白胨，0.05%酵母浸出物，0.01%檸檬酸，0.02%磷酸氫二鈉，0.01%硫酸鎂；酒糟降解液復合液pH6.0?6.5，滅菌備用。 6.根據(jù)權利要求5所述的一種細菌纖維素膜組織工程化人工肌腱支架的制備方法，其特征是所述的酒糟降解液的制備:將100重量份機榨黃酒酒糟中加入50重量份55°C熱水，攪拌混合，再加入I重量份復合酶酶解6小時，酶解條件:品溫為50°C ,pH 6.5,酶解后得到經(jīng)過濾機過濾的酒糟降解液。7.根據(jù)權利要求1所述的一種細菌纖維素膜組織工程化人工肌腱支架的制備方法，其特征是所述的復合酶，各組分重量比為中溫α-淀粉酶:糖化酶:中性蛋白酶=3:4:3。8.根據(jù)權利要求7所述的一種基于細菌纖維素膜制備組織工程化人工肌腱支架材料的方法，其特征是所述的中溫α-淀粉酶、糖化酶、中性蛋白酶購自諾維信(中國)生物技術有限公司。
【文檔編號】C12P19/04GK105963777SQ201610534635
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年7月8日
【發(fā)明人】黃鎮(zhèn), 黃祖新, 周文浩
【申請人】福建師范大學