參芪組合物及其制備方法與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種參芪組合物，該參芪組合物中包括：黨參炔苷0.54mg?1.28mg、毛蕊異黃酮7?O?β?D吡喃葡萄糖苷0.65mg?0.87mg、黃芪皂苷III 1.02mg?2.41mg、黃芪皂苷II 0.71mg?1.67mg、黃芪皂苷I 0.47mg?1.11mg、黃芪甲苷1.02mg?2.4mg、紅車軸草素?7?O?β?D?吡喃葡萄糖苷0.72mg?1.7mg、brachyoside B 0.055mg?0.13mg、蒼術(shù)內(nèi)酯III 0.36mg?0.86mg；本發(fā)明提供的參芪組合物有效成分含量高、質(zhì)量穩(wěn)定。
【專利說(shuō)明】
參芪組合物及其制備方法與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明是關(guān)于一種參芪組合物及其制備方法與應(yīng)用，特別是一種從中藥材黨參、 黃芪提取得到的組合物及其制備方法與其在制備提高免疫力，抗腫瘤等藥物制劑中的應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 從中藥材黨參、黃芪中提取有效成分制成的中藥制劑，其有效成分對(duì)有機(jī)體內(nèi)抗 體的生成有明顯的促進(jìn)作用，可增強(qiáng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能，能使血中白細(xì)胞及多核細(xì)胞 顯著增加；巨噬細(xì)胞吞噬百分率及吞噬指數(shù)顯著上升;對(duì)體液免疫及細(xì)胞免疫都有促進(jìn)作 用，同時(shí)黨參還有增加紅細(xì)胞和血色素的作用。
[0003] 在二十世紀(jì)70年代相關(guān)人員對(duì)黨參、黃芪的配比、劑型進(jìn)行研究，認(rèn)為按照黨參與 黃芪的比例為1:1進(jìn)行提取得到提取物并配制成靜脈用注射液(20ml)臨床療效最好，用于 消化道腫瘤術(shù)后放、化療的輔助治療，可使100%的患者順利地完成了放、化療全過(guò)程。參芪 組合物主要有以下作用:改善癥狀，延長(zhǎng)晚期腫瘤病者的生存期;維護(hù)造血功能，減少放、化 療過(guò)程中白細(xì)胞下降；提高吞噬細(xì)胞的吞噬功能;對(duì)腫瘤有一定的抑制作用;具有活血化瘀 作用。
[0004] 然而，早期傳統(tǒng)的黨參黃芪組合物(簡(jiǎn)稱參芪組合物)大多缺乏對(duì)其中有效成分的 定量分析，市面上的參芪制劑，如參芪丸劑、散劑、注射劑(含凍干粉)都無(wú)法控制其有效物 含量，不能說(shuō)明其主要成分總皂苷、多糖、黃酮的實(shí)際含量，只是簡(jiǎn)單定義為黨參水提取物 為多少量、醇提取物為多少量，從而在實(shí)際生產(chǎn)中導(dǎo)致上一批產(chǎn)品與下一批產(chǎn)品之間的差 異很大，部分產(chǎn)品達(dá)不到含量對(duì)病情達(dá)不到治療效果，而含量過(guò)高的產(chǎn)品則危害了患者的 健康。
[0005] 為了解決傳統(tǒng)的黨參黃芪組合物(簡(jiǎn)稱參芪組合物)對(duì)有效成分缺乏定量分析，主 要成分實(shí)際含量不名的問(wèn)題，為規(guī)范參芪藥物制劑中有效成分的含量，業(yè)界相關(guān)人員對(duì)參 芪提取物的化學(xué)成分進(jìn)行了大量的分析研究。
[0006] 部分研究是定性分離鑒定參芪組合物的各個(gè)化合物成分，例如《參芪扶正注射液 的化學(xué)成分研究》（古洪艷等，《中成藥》，2013年7期）中采用硅膠、0DS、Sephadex LH-20及 RP-HPLC等色譜方法分離參芪提取物產(chǎn)品一一參芪扶正注射液的化學(xué)成分，通過(guò)理化性質(zhì) 及波譜分析鑒定化合物的結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示從參芪扶正注射液原料藥浸膏中分離得到15個(gè)單 體化合物，分別鑒定為黃芪皂苷I、Π 、ΙΙΙ、異黃芪皂苷II、黃芪甲苷、6〃-0-乙酰基毛蕊異黃 酮等?！秴④畏稣⑸湟褐悬h參成分UHPLC-MS分析》(謝海燕，等.《中藥材》.第37卷第8期)公 開了麗珠集團(tuán)利民制藥廠生產(chǎn)的12批參芪提取物產(chǎn)品一一參芪扶正注射液中6種單體化合 物的含量。
[0007] 部分研究用參芪組合物的3種或4種特色成分及其含量如黃芪甲苷、毛蕊異黃酮和 總固體物等作為不同批次質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，如中國(guó)專利ZL 200510064551.5也公開了一種黨 參黃芪提取物，其中提取物每1克中含總固體物不少于0.325克，該總固體物每1克中含總糖 (以無(wú)水葡萄糖計(jì))〇 .08-0.15克，總阜苷（以黃苗甲苷計(jì))7-10毫克，黃酮苷5-8毫克。該專利 公開的技術(shù)中確定了黨參黃芪組合物中主要成分含量，在一定程度上解決了傳統(tǒng)參芪提取 物產(chǎn)品批次之間含量差異的問(wèn)題，從而使治療效果更加穩(wěn)定可靠。
[0008] 對(duì)于參芪組合物的化學(xué)成分定性和定量研究推進(jìn)了參芪藥物制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制 定，規(guī)范了不同參芪藥物制劑批次間的產(chǎn)品質(zhì)量，但是現(xiàn)有的參芪藥物制劑的參芪組合物 提取技術(shù)使得各化學(xué)成分提取效率偏低，造成了黨參和黃芪提取廢棄物中的部分化學(xué)成分 浪費(fèi);加上新制定的嚴(yán)格質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步限制了黨參和黃芪原材料藥材產(chǎn)地來(lái)源和生產(chǎn)年 限，造成了原材料藥材供應(yīng)緊張。因此需要優(yōu)化提取工藝，提高黨參和黃芪利用率;尋找更 加豐富的原材料藥材遼源，雙管齊下解決原材料供應(yīng)緊張的問(wèn)題。
[0009] 但是單純利用現(xiàn)代制備工藝的提高黨參和黃芪提取效率并不能直接解決中藥原 材料藥材的部分化學(xué)成分浪費(fèi)?，F(xiàn)代制備工藝與傳統(tǒng)工藝相比，對(duì)相關(guān)化學(xué)成分的針對(duì)性 強(qiáng)，如有機(jī)溶劑提取法、水蒸氣蒸餾法、超臨界流體萃取法、超濾法、酸堿處理法等，提取的 物質(zhì)成分組成與傳統(tǒng)的水煮提取或水提醇沉提取法相比已經(jīng)發(fā)生了較大的改變，如動(dòng)物藥 材海龍、海馬等，采取傳統(tǒng)水提工藝，提取的大部分成分為蛋白質(zhì)、氨基酸等，而采用有機(jī)溶 劑為溶媒進(jìn)行提取時(shí)，則能將脂肪酸類成分提取出來(lái)，與前者相比化學(xué)成分譜發(fā)生了較大 的改變。總體而言，現(xiàn)代中藥提取純化工藝的大多數(shù)化學(xué)成分提取效率遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)提取工 藝，而且會(huì)將以前無(wú)法提取出的化學(xué)成分也提取出來(lái)，提高了中藥原材料藥材的利用率，有 利于節(jié)約原材料藥材(高進(jìn)，盧鵬，戴卉卿，等.中藥現(xiàn)代制備工藝對(duì)不良反應(yīng)的影響及相關(guān) 對(duì)策[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014,20(14) :52-55)。
[0010] 現(xiàn)代中藥提取純化工藝提高提取效率時(shí)，也改變了中藥藥品中的化學(xué)成分組成， 可能是改變了原有中藥藥品中化學(xué)成分比例，可能增加了新的化學(xué)成分，這些改變可能會(huì) 提高中藥藥品的藥效，也可能會(huì)帶來(lái)提高中藥藥品的不良反應(yīng)。如根據(jù)劉沈林等報(bào)道采用 醇提取工藝的蛇床子復(fù)方制劑與采用傳統(tǒng)水提取工藝的相比，毒性不良反應(yīng)明顯增加(劉 沈林，熊寧寧，劉芳，等.復(fù)方蛇床子制劑臨床試驗(yàn)不良反應(yīng)的倫理審查[J].中國(guó)臨床藥理 學(xué)與治療學(xué)，2004,8(2):238)。
[0011]因此需要將現(xiàn)代制備工藝和藥理實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，篩選出高效和安全的制備工藝，以 獲得有效成分含量高、質(zhì)量穩(wěn)定的參芪組合物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明是在CN1686404A相關(guān)技術(shù)上的進(jìn)一步研究。發(fā)明人經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的研究，并通 過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)的反復(fù)驗(yàn)證，研究出一種有效成分含量高、質(zhì)量穩(wěn)定的參芪組合物。 [0013 ] -方面，本發(fā)明提供了一種參芪組合物，該參芪組合物中包括： 黨參炔苷 0. 54mg-l. 28 mg 毛蕊異黃酮7-0 - β - D吡喃葡萄糖苷 0· 65mg-0· 87 mg 黃苗阜苷ΙΠ I. 02mg-2. 41mg 黃芪皂苷 II 0. 71mg-l. 67mg
[0014] 黃芪皂苷 I 0.47mg-l. Ilmg 黃芪甲苷 1.02mg-2.4mg 紅車軸草素 -7-0-0-D-批喃葡萄糖苷 0.72 mg-1.7mg brachyoside B 0. 055rag~0. 13mg 蒼術(shù)內(nèi)酯 III 0. 36mg-0. 86mg
[0015] 更優(yōu)選的，本發(fā)明提供了一種參芪組合物，該參芪組合物中包括： 黨參炔苷 1.0 Omg-L 20 mg 毛蕊異黃酮7-0 - P - D吡喃葡萄糖0. 70mg-0. 80 mg 苷 黃芪皂苷m 2. 00mg-2. 40mg 黃苗塔苷 II 1.40mg-l. 60mg
[0016] 黃芪皂苷 I 0. 89rag-l. Olmg 黃芪甲苷 2. 00mg-2. 20mg 紅車軸草素 -7-O-0-D-吡喃葡萄糖1.40 mg-1.60mg 苷 brachyoside B 0. 099mg-0.1 lmg 蒼術(shù)內(nèi)酯 III 0. 65mg-0. 77mg
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的參芪組合物中還包括： 松柏苷 0. 023mg-0. 057mg 異黃苗阜苷 II 0. 019mg-0. 036mg。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的參芪組合物中還包括： 刺果甘草苷 D 0. 017mg-0. 035mg
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的參芪組合物中還包括丁香酸、（6aR，llaR)_ 3-羥基-9，10-二甲氧基紫檀烷、（310-7,2'-二羥基-3'，4~二甲氧基異黃烷、丁香脂苷中的 一種或多種。
[0020] 本發(fā)明所述的參芪組合物涉及的中藥原材料藥材為黨參和黃芪，所述的黨參 (Codonopsis Pilosula(Franch. )Nannf)為桔?？浦参锏母稍锔跋嚓P(guān)藥用部分，所述黃 苗為莢膜黃苗（Astraglus membranaceus(Fisch. )Bge.)或蒙古黃苗（Astraglus membranaceus (Fisch ·)Bge · Var · monghoI icus (Bge ·)Hs iao)的干燥根。
[0021] 中藥原材料藥材黨參由于人參蘆頭催吐的說(shuō)法，黨參與人參的藥效和藥用部位相 當(dāng)，常規(guī)用法是去掉黨參蘆頭后使用。但是現(xiàn)在有研究表明黨參蘆頭與黨參干燥根化學(xué)成 分相似，盡管藥用成分如總多糖和總皂苷含量低于根部，然而總氨基酸、脂溶性成分的含量 比根部高（秦蕾，?；埒P，王濤，等.黨參蘆頭與根化學(xué)成分比較分析[J].食品科學(xué).2015， 135(14): 135-139)。為了豐富黨參原材料藥材的來(lái)源，本發(fā)明將黨參的蘆頭加入到黨參干 燥根中，考察藥用部位改變對(duì)參芪組合物藥效的影響。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)不去除蘆頭的黨參制備 的參芪組合物的藥效比去除蘆頭的黨參制備的參芪組合物好，可能是黨參蘆頭中的成分一 方面影響了黃芪成分的提取效率，另一方面黨參蘆頭中的成分意外與其他參芪組合物成分 發(fā)生了正向的協(xié)同作用，共同提高了參芪組合物的藥效。
[0022] 黨參蘆頭與黨參干燥根的重量比大概為10%-20%，本發(fā)明不除去蘆頭，將黨參蘆 頭和黨參干燥根一起作為原材料藥材使用，實(shí)驗(yàn)證明所得的參芪組合物藥效被提高，可能 是黨參蘆頭中的成分與原參芪組合物的成分發(fā)生了正向協(xié)同作用。黨參蘆頭可以用于參芪 組合物的結(jié)果，擴(kuò)大了原材料藥材的來(lái)源，并且降低了原材料藥材的成本，具有重大的意 義。
[0023] 本發(fā)明所述的參芪組合物可以采用水提-醇沉、水提-殼聚糖沉、水提-樹脂分離等 方法提取制備參苗提取物，然后參苗提取物進(jìn)一步制備為參苗組合物。
[0024] 本發(fā)明所述的參芪組合物可以采用水提-醇沉的方法提取制備，水提2-3次，醇沉 2-3 次。
[0025] 本發(fā)明所述的參芪組合物可以采用水提-醇沉的方法提取制備，具體步驟為:取黨 參和黃芪，加水提取三次，提取時(shí)間分別為1小時(shí)、1小時(shí)、〇. 5小時(shí)。提取液濃縮至每1ml含生 藥約1.2g，加乙醇使含醇量達(dá)75 %，靜置，濾過(guò)，濾液回收乙醇并濃縮至每1ml含生藥約2g， 再加乙醇使含醇量達(dá)85%，靜置，濾過(guò)，濾液回收乙醇并濃縮至每1ml含生藥約2.5g，再加乙 醇使醇量達(dá)88%，靜置，醇沉液用碟式分離機(jī)離心分離，再用濾紙加微孔濾膜過(guò)濾，濾液回 收乙醇并濃縮至每1ml含生藥約1.0 g，得參芪提取物。
[0026] 本發(fā)明所述的參芪組合物可以采用水提-殼聚糖沉的方法提取制備，具體步驟為： 取黨參和黃芪，加水提取三次，提取時(shí)間分別為1小時(shí)、1小時(shí)、〇. 5小時(shí)。提取液濃縮至每1ml 含生藥約1.2g，加入殼聚糖17% (w/v)，溫度維持在80°C，攪拌10分鐘，靜置后用碟式分離機(jī) 離心分離，再用濾紙加微孔濾膜過(guò)濾，濾液并濃縮至每1ml含生藥約1.0 g，得參芪提取物。
[0027] 本發(fā)明所述的參芪組合物可以采用水提-樹脂分離的方法提取制備，具體步驟為： 取黨參和黃芪，加水提取三次，提取時(shí)間分別為1小時(shí)、1小時(shí)、〇 . 5小時(shí)。三次提取液過(guò)濾后 合并，濃縮至藥液濃度為生藥濃度0.5g/mL。藥液上DlOl大孔樹脂，用70%乙醇，5倍體積洗 脫，收集母液和洗脫液;母液上葡聚糖樹脂，用70 %乙醇，5倍體積洗脫，收集母液和洗脫液， 合并DlOl大孔樹脂和葡聚糖樹脂的洗脫液，濃縮至每1ml含生藥約l.Og，得參芪提取物。
[0028] 本發(fā)明所述的參芪組合物可以采用水提-樹脂分離的方法提取制備，具體步驟為： 取黨參和黃芪，加水提取三次，提取時(shí)間分別為1小時(shí)、1小時(shí)、〇 . 5小時(shí)。三次提取液過(guò)濾后 合并，濃縮至藥液濃度為生藥濃度0.5g/mL。藥液上DlOl大孔樹脂，用70%乙醇，5倍體積洗 脫，收集母液和洗脫液;母液濃縮至每1ml含生藥約1.2g，加乙醇使含醇量達(dá)75 %，靜置，濾 過(guò)，濾液回收乙醇并濃縮至每1ml含生藥約2g，再加乙醇使含醇量達(dá)85%，靜置，濾過(guò)，濾液 回收乙醇并濃縮至每1ml含生藥約2.5g，再加乙醇使醇量達(dá)88%，靜置，醇沉液用碟式分離 機(jī)離心分離，再用濾紙加微孔濾膜過(guò)濾，濾液回收乙醇并濃縮至每1ml含生藥約l.Og，得參 芪提取物。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0030] 實(shí)施例1
[0031] (I)取黨參400g和黃芪400g，用去離子水沖洗干凈，加入6400ml去離子水，加入提 取1小時(shí)后，放出提取液;再加入4800ml去離子水，加熱提取1小時(shí)后，放出提取液;再加入 4800ml去離子水，加熱0.5小時(shí)后，放出提取液。三次提取液過(guò)濾后合并，濃縮至1600ml，獲 得的藥液濃度為生藥濃度0.5g/mL。
[0032] (2)取步驟（1)藥液上D101大孔樹脂，用70 %乙醇，5倍體積洗脫，收集母液和洗脫 液；
[0033] (3)母液提取液濃縮至每1ml含生藥約1.5g，加乙醇使含醇量達(dá)75%，靜置，濾過(guò)， 濾液回收乙醇并濃縮至每1ml含生藥約3g，再加乙醇使含醇量達(dá)85%，靜置，濾過(guò)，濾液回收 乙醇并濃縮至每1ml含生藥約3. Sg，再加乙醇使醇量達(dá)88%，靜置，醇沉液用分離機(jī)離心分 離，將濾液與步驟(2)所得的洗脫液合并，再用濾紙加微孔濾膜過(guò)濾，濾液回收乙醇并濃縮 至每1ml含生藥約5g。
[0034] (4)步驟（3)所得的藥液加注射用水使每1ml含生藥約2g，加熱，加入總生藥量 0.35%-0.45% (g/g)的針用炭，煮沸，過(guò)濾，濾液冷藏，經(jīng)分離機(jī)離心分離后，經(jīng)0.2μπι微孔 過(guò)濾器過(guò)濾，再經(jīng)過(guò)超濾系統(tǒng)過(guò)濾，濃縮至每1ml含生藥約80mg(40mg黨參和40mg黃芪），得 參苗提取合物。
[0035] (5)參芪提取物加注射用水適量，煮沸20分鐘，加入針用炭0.15g，煮沸10分鐘，冷 卻，濾過(guò)，濾液備用。取氯化鈉6.5g，加適量注射用水使溶解，加入針用炭0.25g，煮沸，冷卻， 濾過(guò)，濾液與上述備用濾液合并，加依地酸二鈉0.2g、焦亞硫酸鈉0.5g溶解，加注射用水調(diào) 整總量至1000 ml，調(diào)節(jié)pH值至6.0-6.4，加針用炭0.15g-0.30g，濾過(guò)，灌裝，每瓶250ml，滅 菌，即得生藥含量為20g( (IOg黨參和40g黃芪）的參芪組合物。
[0036] 分別取不去除蘆頭和去除蘆頭的黨參作為步驟（1)中原材料藥材，制備得到參芪 組合物1和參芪組合物2。
[0037] 分別取IOml參芪組合物1和2,分別定量檢測(cè)參芪組合物1和2中的黨參炔苷、毛蕊 異黃酮7-〇-i3-D吡喃葡萄糖苷、黃芪皂苷III、黃芪皂苷II、黃芪皂苷I、黃芪甲苷、紅車軸草 素-7-0-?Η)_吡喃葡萄糖苷、brachyoside B和蒼術(shù)內(nèi)酯III的含量，結(jié)果見表格1。
[0038] 表格1:參芪組合物組分
[0040]結(jié)論:不去除蘆頭的參芪組合物1與去除蘆頭的參芪組合物2的成分相比，含量存 在一定的差異。由于黨參蘆頭中的黨參炔苷的含量比黨參干燥根中的黨參炔苷含量低，因 此參苗組合物1中的該組分比參苗組合物2中的低，與現(xiàn)有文獻(xiàn)公開的數(shù)據(jù)相符合。參苗組 合物1中紅車軸草素-7-0-?Η)_吡喃葡萄糖苷、brachyoside B、蒼術(shù)內(nèi)酯III含量顯著高于 參芪組合物1中含量。黃芪皂苷III、黃芪皂苷II、黃芪皂苷I和黃芪甲苷在參芪組合物1和2 中含量變化沒(méi)有明顯的規(guī)律。說(shuō)明不去除蘆頭與去除蘆頭的黨參會(huì)影響黃芪一些成分的提 取，結(jié)果造成參芪組合物1和2的組分含量差異。
[0041] 實(shí)施例2藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)：
[0042] 實(shí)驗(yàn)：本發(fā)明的黨參黃芪組合物和中國(guó)申請(qǐng)0 3 1 2 3 0 4 5 . 8、中國(guó)申請(qǐng) 200510064551.5中的黨參黃芪提取組合物抗腫瘤作用對(duì)比
[0043] 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:BALB/C小鼠56只，SP F級(jí)，雄性，體重18~20g，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物研究所提供。
[0044] 瘤株:S180細(xì)胞株，中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所提供。
[0045] 實(shí)驗(yàn)藥物:藥物A:本發(fā)明的黨參黃芪提取組合物，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例1制備的參芪 組合物1;
[0046] 藥物B:根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例1制備的參芪組合物2;
[0047]藥物C:中國(guó)申請(qǐng)03123045.8實(shí)施例1中中的黨參黃芪提取組合物；
[0048] 藥物D:中國(guó)申請(qǐng)200510064551.5實(shí)施例1中的黨參黃芪提取組合物；
[0049] 藥物E:參芪糖漿(江西濟(jì)民可信藥業(yè)有限公司生產(chǎn)）；
[0050] 實(shí)驗(yàn)方法：
[0051] 1)腫瘤細(xì)胞懸液的制備:取生長(zhǎng)良好的S180傳代小鼠，無(wú)菌條件下抽取小鼠腹水， 用生理鹽水稀釋，1500r · HiirT1離心5min，重復(fù)2次，然后將細(xì)胞吹散至單個(gè)細(xì)胞，在顯微鏡 下計(jì)數(shù)并將細(xì)胞調(diào)I X ΙΟ%!/1。
[0052] 2)分組及給藥:將小鼠隨機(jī)分為6組，每組8只，分別為對(duì)照組、組藥物A實(shí)驗(yàn)組、藥 物B實(shí)驗(yàn)組、藥物C實(shí)驗(yàn)組、藥物D實(shí)驗(yàn)組、藥物E實(shí)驗(yàn)組。
[0053] 荷瘤對(duì)照組給予無(wú)菌生理鹽水，按照0.02mL/g腹腔注射給藥，連續(xù)14天，每天一 次；
[0054]分別取藥物A、藥物B、藥物C、藥物D和藥物E，加生理鹽水稀釋，過(guò)濾，制備得到每 Iml含生藥約40mg的藥物A、藥物B、藥物C、藥物D和藥物E實(shí)驗(yàn)組的藥物，按照0.02mL/g腹腔 注射給藥，連續(xù)14天，每天一次；
[0055] 3)于第3次注射藥物后12h，右腋部皮膚常規(guī)消毒，皮下接種S180瘤細(xì)胞液0.2mL 只。末次給藥后24h，將小鼠稱重，脫頸處死，立即進(jìn)行解剖，取出腫瘤，吸去血液，去除脂肪、 筋膜，用電子天平稱取其濕重，按下列公式計(jì)算腫瘤指數(shù)及抑瘤率：
[0056] 腫瘤指數(shù)（％ )=腫瘤重量/體重X 100% ;
[0057] 抑瘤率（％ )=(對(duì)照組瘤重-實(shí)驗(yàn)組瘤重)/對(duì)照組瘤重X 100%。
[0058]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:見表格2
[0059 ] 表格2:藥物A、藥物B、藥物C、藥物D和藥物E實(shí)驗(yàn)組小鼠荷瘤數(shù)據(jù)
[0062] 結(jié)論:表格2的數(shù)據(jù)顯示，藥物A、藥物B、藥物C和藥物D實(shí)驗(yàn)組的瘤重顯著低于荷瘤 對(duì)照組(P<〇.05)，藥物E實(shí)驗(yàn)組的瘤重低于荷瘤對(duì)照組不具有顯著意義(p>0.05)。并且藥 物A實(shí)驗(yàn)組的瘤重顯著低于其他藥物實(shí)驗(yàn)組(p<0.05)，說(shuō)明藥物A的抑制腫瘤效果優(yōu)于其 他組的藥物;藥物B實(shí)驗(yàn)組的瘤重顯著低于藥物C、藥物D實(shí)驗(yàn)組和藥物E實(shí)驗(yàn)組（(p<0.05)， 藥物B的抑制腫瘤效果優(yōu)于藥物C、藥物D和藥物E。
[0063] 因此本發(fā)明實(shí)施例1制備的不去除蘆頭的參芪組合物1抑制腫瘤的效果優(yōu)于去除 蘆頭的參芪組合物2現(xiàn)有技術(shù)公開的以黨參和黃芪等作為原材料藥材的產(chǎn)品。
[0064] 實(shí)施例3參芪組合物大鼠長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)
[0065] 實(shí)驗(yàn):本發(fā)明的黨參黃芪提取組合物大鼠長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)
[0066] 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)SD種大鼠144只，雌雄各半，體重80~120g，鼠齡5~7周，由中國(guó)醫(yī) 學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供。
[0067]實(shí)驗(yàn)藥物:本發(fā)明的黨參黃芪提取組合物，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例1制備的參芪組合物 1;
[0068]實(shí)驗(yàn)方法：
[0069] 1)分組及給藥:按性別和體重分別隨機(jī)分為生理鹽水組、高劑量組:33.6g生藥/kg 參苗組合物組，中劑量組：16.8g生藥/kg參苗組合物組，低劑量組:8.4g生藥/kg參苗組合物 組，每組36只大鼠，試驗(yàn)前雌雄分籠飼養(yǎng)，每籠3只，適應(yīng)性觀察7天后開始采用腹腔注射給 藥，每7天停藥1次，連續(xù)給藥90天，停藥14天。
[0070]取本發(fā)明實(shí)施例1制備的參芪組合物1，加生理鹽水稀釋，過(guò)濾，制備得到每1ml含 生藥約336mg、168mg和84mg的藥物。
[0071] 33.6g生藥/kg參芪組合物組，16.8g生藥/kg參芪組合物組，8.4g生藥/kg參芪組合 物組相當(dāng)于擬定臨床人用劑量的90、60、40倍。
[0072]在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間觀察大鼠外觀攝食體重增長(zhǎng)行為活動(dòng)等一般癥狀分別在給藥90 天(每組20只）和停藥14天(每組16只）檢測(cè)大鼠血清生化學(xué)、臟器系數(shù)指標(biāo)，并進(jìn)行系統(tǒng)尸 檢，進(jìn)行臟器系數(shù)檢測(cè)和臟器組織病理學(xué)檢查。
[0073] 2)檢測(cè)指標(biāo)：
[0074]血清生化學(xué)指標(biāo)：白蛋白（ALB)、總蛋白（TP)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)。
[0075]臟器系數(shù)和組織病理學(xué)檢測(cè)指標(biāo):腎、腎上腺、睪丸、附睪、子宮、卵巢。
[0076] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0077] 1)對(duì)一般癥狀的影響：給藥期和恢復(fù)期，各組大鼠未見因給予黨參組合物引起的 毒性反應(yīng)，大鼠全部存活，外觀體征、毛發(fā)行為、活動(dòng)腺體、分泌呼吸、排泄等未見明顯異常。 [0078] 2)與對(duì)照組比較大鼠攝食量變化未見明顯起伏，見表格3;雄雌性大鼠各劑量組在 第4周到第8周內(nèi)體重出現(xiàn)較快增長(zhǎng)(見表格4)，與對(duì)照組比較具有明顯增加(p<0.05)。推 測(cè)與黨參黃芪組合物具有補(bǔ)益作用相關(guān)。
[0079] 表格3:參芪組合物對(duì)大鼠攝食量的影響(單位:g/100gBW/天，3? ±幻
[0084] 3)肝功能檢查:給藥90天，可見雄性和雌雄全部大鼠低劑量組AST極顯著降低(p< 0.001 )，但無(wú)臨床意義。雄性大鼠高劑量組TP，A LB顯著降低(P<0.001 )，且表現(xiàn)出劑量依 賴性。中劑量組及其以下劑量未見明顯肝功能異常。停藥14天檢查:未見異常。結(jié)果見表格 5〇
[0085]表格5:參芪組合物90天給藥后對(duì)大鼠血清生化學(xué)指標(biāo)的影響

[0087] 4)系統(tǒng)尸解及臟器系數(shù)檢查：給藥90天后：未見異常；臟器系數(shù)檢查停藥14天檢 查:未見異常。結(jié)果見表格6、7。
[0088] 表格6:參苗組合物90天給藥后對(duì)大鼠臟器系數(shù)的影響(g/100gBW/天，i 土·s)
[0093] 5)病理組織學(xué)檢查：給藥90天后:檢查對(duì)照組和高劑量組各發(fā)現(xiàn)1例肺局部炎癥， 高劑量組與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>〇.05);高劑量組出現(xiàn)1例腎盂局部炎癥，與對(duì)照 組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>〇.〇5):
[0094] 對(duì)照組和高劑量組各發(fā)現(xiàn)2例和1例氣管局部炎癥，但高劑量組和對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義(P>〇.05);其余組織無(wú)病理性改變。
[0095]停藥14天檢查:對(duì)照組發(fā)現(xiàn)1例肺局部炎癥:對(duì)照組發(fā)現(xiàn)1例氣管局部炎癥:其余組 織無(wú)病理性改變。說(shuō)明參芪組合物停藥14天對(duì)大鼠無(wú)毒性損傷。
[0096]長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)結(jié)論:參芪組合物大鼠長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)主要表現(xiàn)為血常規(guī)和肝功能部 分指標(biāo)出現(xiàn)生理性波動(dòng)，以及體重增長(zhǎng)較快，停藥后恢復(fù)正常，未見延遲性毒性反應(yīng)。
[0097] 實(shí)施例4現(xiàn)有技術(shù)中已有黨參黃芪組合物產(chǎn)品的組分含量
[0098] 實(shí)驗(yàn)藥物:藥物1:按照張來(lái)華，等.殼聚糖對(duì)參芪水煎液成分純化的影響，時(shí)珍國(guó) 醫(yī)國(guó)藥，2010,21(6) :1316-1318制備的黨參黃芪提取組合物；
[0099] 藥物2:按照Z(yǔ)L200710065396.5實(shí)施例8制備的黨參黃芪組合物；
[0100]藥物3:按照楊昊，等.參芪扶正粉針劑精制純化工藝研究.中國(guó)新藥雜志，2009，18 (18) :1771-1776的方法制備黨參黃芪組合物；
[0101] 結(jié)果見表格8。
[0102] 表8.現(xiàn)有技術(shù)黨參黃芪組合物類制品的對(duì)比表(均以20g生藥計(jì)）
[0105]上表中所有產(chǎn)品的組方(折成每克)均為黨參:黃芪=1:1。
[0106] 結(jié)論:本實(shí)施例中涉及的參芪丸、藥物1、藥物2和藥物3參考實(shí)施例2方法進(jìn)行藥效 學(xué)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，藥物A實(shí)驗(yàn)組的瘤重顯著低于參芪丸、藥物1、藥物2、藥物3和荷瘤對(duì) 對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組(P < 0.05 )，說(shuō)明藥物A的抑制腫瘤效果優(yōu)于參芪丸、藥物1、藥物2和藥物3。
[0107] 實(shí)施例5
[0108] (1)取黨參(不去除蘆頭)400g和黃芪400g，用去離子水沖洗干凈，加入6400ml去離 子水，加入提取1小時(shí)后，放出提取液;再加入4800ml去離子水，加熱提取1小時(shí)后，放出提取 液;再加入4800ml去離子水，加熱0.5小時(shí)后，放出提取液。三次提取液過(guò)濾后合并，濃縮至 1600ml，獲得的藥液濃度為生藥濃度0.5g/mL。
[0109] (2)取步驟（1)藥液上DlOl大孔樹脂，用70%乙醇，5倍體積洗脫，收集母液和洗脫 液；
[0110] (3)母液提取液濃縮至每1ml含生藥約1.5g，加乙醇使含醇量達(dá)75%，靜置，濾過(guò)， 濾液回收乙醇并濃縮至每1ml含生藥約3g，再加乙醇使含醇量達(dá)85%，靜置，濾過(guò)，濾液回收 乙醇并濃縮至每1ml含生藥約3. Sg，再加乙醇使醇量達(dá)88%，靜置，醇沉液用分離機(jī)離心分 離，將濾液與步驟(2)所得的洗脫液合并，再用濾紙加微孔濾膜過(guò)濾，濾液回收乙醇并濃縮 至每1ml含生藥約5g。
[0111] (4)步驟（3)所得的藥液加注射用水使每1ml含生藥約2g，加熱，加入總生藥量 0.35%-0.45% (g/g)的針用炭，煮沸，過(guò)濾，濾液冷藏，經(jīng)分離機(jī)離心分離后，經(jīng)0.2μπι微孔 過(guò)濾器過(guò)濾，再經(jīng)過(guò)超濾系統(tǒng)過(guò)濾，加注射用水得每1ml含生藥Ig的得參芪提取物。
[0112] (5)參芪提取物加注射用水適量，煮沸20分鐘，加入針用炭0.15g，煮沸10分鐘，冷 卻，濾過(guò)，濾液備用。取氯化鈉6.5g，加適量注射用水使溶解，加入針用炭0.25g，煮沸，冷卻， 濾過(guò)，濾液與上述備用濾液合并，加依地酸二鈉0.2g、焦亞硫酸鈉0.5g溶解，加注射用水調(diào) 整總量至1000 ml，調(diào)節(jié)pH值至6.0-6.4,加針用炭0.15g-0.30g，濾過(guò)，灌裝，每瓶120ml，滅 菌，即得生藥含量為20g( (IOg黨參和40g黃芪）的參芪組合物。
[0113] 取一份參芪組合物，定量檢測(cè)參芪組合物的相關(guān)物質(zhì)，含量如下：黨參炔苷 〇.5411^、毛蕊異黃酮7-〇-0-〇吡喃葡萄糖苷〇.6511^、黃芪皂苷1111.6211^、黃芪皂苷11 0.7Img、黃芪皂苷I 0.47mg、黃芪甲苷1.02mg、紅車軸草素-7-(H3-D-吡喃葡萄糖苷0.72mg、 brachyoside B 0.055mg和蒼術(shù)內(nèi)酯III 0.36mg。
[0114] 注:樹脂的預(yù)處理與裝柱稱取干燥的DiOl大孔樹脂，用95%乙醇浸泡24h后裝柱， 然后用95%乙醇反復(fù)洗脫，洗至洗脫液與水（1:2)混合不產(chǎn)生渾濁，再用水反復(fù)洗脫，至洗 脫液無(wú)乙醇味，并且樹脂不再下降即刻。
[0115] 實(shí)施例6
[0116]取IOml實(shí)施例5中參芪提取物，加注射用水適量，加入氯化鈉2.25g，用注射用水調(diào) 整體積至125ml，加入適量注射用炭，煮沸20分鐘，放冷，濾過(guò)，消毒，按Iml體積分灌于低硼 玻璃安瓶中，冷卻干燥，得凍干粉針劑，即得生藥含量為20g((10g黨參和40g黃芪)的本發(fā)明 所述參苗組合物。
[0117]取一份參芪組合物凍干粉針，定量檢測(cè)參芪組合物的相關(guān)物質(zhì)，含量如下:黨參炔 苷0.54mg、毛蕊異黃酮7-〇-i3-D吡喃葡萄糖苷0.87mg、黃芪皂苷III2.41mg、黃芪皂苷 II1.67mg、黃芪皂苷I 0.47mg、黃芪甲苷1.53mg、紅車軸草素-7-〇-i3-D-吡喃葡萄糖苷 0.7211^、1^&(3]17〇8丨(16 13 0.1311^和蒼術(shù)內(nèi)酯1110.8611^。松柏昔0.02311^、異黃苗阜昔11 0.019mg、刺果甘草苷D 0.017mg。
[0118] 實(shí)施例7
[0119] 取實(shí)施例5中參芪提取物減壓濃縮成浸膏，相對(duì)比重為1.28-1.30(60°C測(cè)），置于 真空干燥箱中，50-80 °C減壓干燥48-96小時(shí)，取出，粉碎，過(guò)60-80目篩;將藥粉與輔料混合 均勻，過(guò)60-80目篩，用70-90 %乙醇制成軟材，20-30目篩制粒，50-80°C烘干，20-30目篩整 粒，加入0-1.0%的硬脂酸鎂混合均勻，填充膠囊，控制每粒膠囊的生藥含量為20g，既得本 發(fā)明所述參芪組合物。
[0120] 取一粒參芪組合物膠囊，定量檢測(cè)參芪組合物的相關(guān)物質(zhì)，含量如下：黨參炔苷 1.28mg、毛蕊異黃酮7-〇-i3-D吡喃葡萄糖苷0.87mg、黃芪皂苷III 2.41mg、黃芪皂苷II 1.67mg、黃苗阜苷I I. llmg、黃苗甲苷2.4mg、紅車軸草素-7-〇-β-?-吡喃葡萄糖苷1.7mg、 brachyoside B 0.13mg、蒼術(shù)內(nèi)酯III 0.86mg、松柏昔0.057mg、異黃苗阜昔II 0.036mg、刺 果甘草苷D 0.035mg。
[0121] 實(shí)施例8
[0122] 取實(shí)施例5中參芪提取物減壓濃縮成浸膏，相對(duì)比重為1.28-1.30(60°C測(cè)），置于 真空干燥箱中，50-80 °C減壓干燥48-96小時(shí)，取出，粉碎，過(guò)60-80目篩;將藥粉與輔料混合 均勻，置于制粒機(jī)中，加入6 %粘合劑，制粒，沖旋轉(zhuǎn)壓片機(jī)壓片，分裝，每片的含量大概為 20g生藥，既得本發(fā)明所述參芪組合物。
[0123] 取一片參芪組合物片劑，定量檢測(cè)參芪組合物的相關(guān)物質(zhì)，含量如下：黨參炔苷 l.OOmg、毛蕊異黃酮7-〇-i3-D吡喃葡萄糖苷0.70mg、黃芪皂苷III 2.00mg、黃芪皂苷II 1.40mg、黃苗阜苷I 0.89mg、黃苗甲苷2.00mg、紅車軸草素-7-〇-β-?-吡喃葡萄糖苷1.40mg、 brachyoside B 0.099mg和蒼術(shù)內(nèi)酯III 0.65mg。
[0124] 實(shí)施例9
[0125] (1)取黨參400g和黃芪400g，用去離子水沖洗干凈，加入6400ml去離子水，加入提 取1小時(shí)后，放出提取液;再加入4800ml去離子水，加熱提取1小時(shí)后，放出提取液;再加入 4800ml去離子水，加熱0.5小時(shí)后，放出提取液。三次提取液過(guò)濾后合并，濃縮至1600ml，獲 得的藥液濃度為生藥濃度0.5g/mL。
[0126] (2)取步驟（1)藥液上DlOl大孔樹脂，用70%乙醇，5倍體積洗脫，收集母液和洗脫 液；
[0127] (3)母液提取液濃縮至每1ml含生藥約1.5g，加乙醇使含醇量達(dá)75%，靜置，濾過(guò)， 濾液回收乙醇并濃縮至每1ml含生藥約3g，再加乙醇使含醇量達(dá)85%，靜置，濾過(guò)，濾液回收 乙醇并濃縮至每1ml含生藥約3. Sg，再加乙醇使醇量達(dá)88%，靜置，醇沉液用分離機(jī)離心分 離，將濾液與步驟(2)所得的洗脫液合并，再用濾紙加微孔濾膜過(guò)濾，濾液回收乙醇并濃縮 至每1ml含生藥約5g。
[0128] (4)步驟（3)所得的藥液加注射用水使每1ml含生藥約2g，加熱，加入總生藥量 0.35%-0.45% (g/g)的針用炭，煮沸，過(guò)濾，濾液冷藏，經(jīng)分離機(jī)離心分離后，經(jīng)0.2μπι微孔 過(guò)濾器過(guò)濾，再經(jīng)過(guò)超濾系統(tǒng)過(guò)濾，濃縮至每1ml含生藥約80mg(40mg黨參和40mg黃芪），得 參苗提取合物。
[0129] (5)參芪提取物加注射用水適量，煮沸20分鐘，加入針用炭0.15g，煮沸10分鐘，冷 卻，濾過(guò)，濾液備用。取氯化鈉6.5g，加適量注射用水使溶解，加入針用炭0.25g，煮沸，冷卻， 濾過(guò)，濾液與上述備用濾液合并，加依地酸二鈉0.2g、焦亞硫酸鈉0.5g溶解，加注射用水調(diào) 整總量至1000 ml，調(diào)節(jié)pH值至6.0-6.4，加針用炭0.15g-0.30g，濾過(guò)，灌裝，每瓶250ml，滅 菌，即得生藥含量為20g( (IOg黨參和40g黃芪）的參芪組合物。
[0130]取1瓶參芪組合物片劑，定量檢測(cè)參芪組合物的相關(guān)物質(zhì)，含量如下：黨參炔苷 1.20mg、毛蕊異黃酮7-〇-i3-D吡喃葡萄糖苷0.80mg、黃芪皂苷III 2.40mg、黃芪皂苷II 1.60mg、黃苗阜苷I I .Olmg、黃苗甲苷2.20mg、紅車軸草素-7-〇-β-?-吡喃葡萄糖苷1.60mg、 brachyoside B 0· Ilmg和蒼術(shù)內(nèi)酯III 0.77mg〇
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種參巧組合物，該參巧組合物中包括； 覺(jué)參快巧 0. 54mg-1. 28 mg 毛蕊異黃麗7-0 - β - D化喃葡萄糖昔 0. 6加 g-0. 87 rag 黃庚皂巧邁 L02mg-2.41mg 黃苗皂巧日 0. 71田g-1. 67mg 黃巧皂巧 1 0.47mg-l.llmg 黃巧甲昔 1.02mg-2. 4mg 紅車軸草素 -7-0- β -D-批喃葡萄糖昔 0. 72 mg-1. 7mg brachyoside B 0· 055mg-0· 13mg 蒼術(shù)內(nèi)醋 III 0· 36用g-0. 86mg。2. 如權(quán)利要求1所述的參巧組合物，其特征在于所述組合物包括： 黨參快巧 1. OOmg-1. 20 mg 毛蕊異黃醜7-0 - β - D晰喃葡萄糖巧0. 70mg-0. 80 mg 黃常皂昔田 2. OOmg-2. 40mg 黃茂皂巧 II 1.40mg~1.60mg 黃苦皂巧 I 0. 89mg-1. Olmg 黃諾甲巧 2. OOrag-2. 20mg 紅車軸草素 -7-0-目-D-化喃葡萄糖巧 1. 40 mg-1. 60mg brachyoside Β 0. 099mg-0. llmg 蒼術(shù)內(nèi)醋 III 0. 65rag-0. 77mg〇3. 如權(quán)利要求1所述的參巧組合物，其特征在于所述組合物還包括： 松柏巧 0.023mg-〇 .057mg 異黃巧皂巧 II 0.019mg-0.036mg。4. 如權(quán)利要求1或3所述的參巧組合物，其特征在于所述組合物還包括： 刺果甘草巧 D 0.017mg-〇 .035mg〇5. 如權(quán)利要求1所述的參巧組合物，其特征在于所述組合物還包括：下香酸、（6aR， llaR)-3-^基-9,10-二甲氧基紫檀燒、（3R)-7,2/-二徑基-3/，少-二甲氧基異黃燒、下香脂 巧中的一種或多種。6. 如權(quán)利要求1~5任一項(xiàng)所述的參巧組合物，其特征在于所述參巧組合物的制備方法 包括:取黨參和黃巧，加水提取立次，提取時(shí)間分別為1小時(shí)、1小時(shí)、0.5小時(shí)。立次提取液過(guò) 濾后合并，濃縮至藥液濃度為生藥濃度0.5g/mL。藥液上D101大孔樹脂，用70%乙醇，5倍體 積洗脫，收集母液和洗脫液;母液濃縮至每1ml含生藥約1.2g，加乙醇使含醇量達(dá)75 %，靜 置，濾過(guò)，濾液回收乙醇并濃縮至每1ml含生藥約2g，再加乙醇使含醇量達(dá)85 %，靜置，濾過(guò)， 濾液回收乙醇并濃縮至每1ml含生藥約2.5g，再加乙醇使醇量達(dá)88%，靜置，醇沉液用碟式 分離機(jī)離屯、分離，再用濾紙加微孔濾膜過(guò)濾，濾液回收乙醇并濃縮至每1ml含生藥約l.Og， 得參巧提取物。7. 如權(quán)利要求1~5任一項(xiàng)所述的參巧組合物，其特征在于所述參巧組合物的制備方法 包括:取黨參和黃巧，加水提取立次，提取時(shí)間分別為1小時(shí)、1小時(shí)、0.5小時(shí)。立次提取液過(guò) 濾后合并，濃縮至藥液濃度為生藥濃度0.5g/mL。藥液上D101大孔樹脂，用70%乙醇，5倍體 積洗脫，收集母液和洗脫液;母液上葡聚糖樹脂，用70 %乙醇，5倍體積洗脫，收集母液和洗 脫液，合并D101大孔樹脂和葡聚糖樹脂的洗脫液，濃縮至每1ml含生藥約l.Og，得參巧提取 物。8.如權(quán)利要求1~5任一項(xiàng)所述的參巧組合物，其特征在于所述參巧組合物的制備方法 包括:取黨參和黃巧，加水提取立次，提取時(shí)間分別為1小時(shí)、1小時(shí)、0.5小時(shí)。提取液濃縮至 每1ml含生藥約1.2g，加入殼聚糖17% (w/v)，溫度維持在80°C，攬拌10分鐘，靜置后用碟式 分離機(jī)離屯、分離，再用濾紙加微孔濾膜過(guò)濾，濾液并濃縮至每1ml含生藥約l.Og，得參巧提 取物。
【文檔編號(hào)】A61K31/365GK106074586SQ201610406676
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月4日
【發(fā)明人】陸文岐, 孔祥生, 劉東來(lái), 黃文華, 劉學(xué)華, 陳斌
【申請(qǐng)人】麗珠集團(tuán)利民制藥廠, 麗珠醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司