專利名稱：檢測樣品中的分析物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及用于檢測樣品中的分析物的方法。本方法是基于 以多核苷酸為底物的聚合酶活性，其中多核苷酸底物連接于結(jié)合分析物 的分子，例如抗體。通過摻入適當標記的核苷酸，和/或摻入半抗原偶聯(lián) 核苷酸，可檢測聚合酶的活性，其中半抗原偶聯(lián)核苷酸能夠結(jié)合半抗原 的適當標記的配體。
背景技術(shù)：
低水平的靶分析物的檢測、計數(shù)和鑒定，是常規(guī)醫(yī)療、工業(yè)和環(huán)境 診斷法的基礎(chǔ)。例如，對樣品進行分析，以檢測來自感染體、癌細胞、
激素、生產(chǎn)雜質(zhì)、污染物和用于生物恐怖主義(bioterrorism)的介質(zhì)的分 子。
許多不同類型的所述檢測方法被廣泛用于生物醫(yī)學(xué)研究和臨床實驗 醫(yī)學(xué)中。已經(jīng)證實在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中，用于檢測特異大分子種類(例如 蛋白質(zhì))的方法是很有價值的分析技術(shù)，特別是用于鑒定正常和異常組 織樣品的分子組分。所述檢測方法的實例包括免疫測定法、用于鏡檢 的免疫化學(xué)染色法、熒光激活細胞分選法(FACS)等等。
通常，檢測方法使用至少一種結(jié)合特異靶分析物并產(chǎn)生可檢測信號 的分析試劑。這些分析試劑通常具有兩種組分(1)探針大分子，例 如，可通過高度特異性和親合性結(jié)合靶分析物的抗體，和(2)可檢測標 記，例如放射性同位素或共價連接的可檢測分子。通常，探針大分子的 結(jié)合特性限定了檢測方法的特異性，相關(guān)標記的檢測能力決定了檢測方
法的靈敏性。檢測法的靈敏性反過來涉及所用標記的類型和用于檢測標 記的現(xiàn)有設(shè)備的質(zhì)量以及類型。
在個體中，癌癥的診斷仍然是難以實現(xiàn)的任務(wù)。盡管可以使用從血
液或組織樣品中獲得的一些診斷性標記，例如癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋 白(AFP)或前列腺特異抗原(PSA)，但迄今為止，對于這些個體中的癌癥 存在，根據(jù)其它臨床診斷的證實，使用這些標記的分析法并不具有顯著 的靈敏性和/或特異性。
免疫學(xué)檢測、或免疫測定法，廣泛用于醫(yī)療診斷中。以抗體和相應(yīng) 的靶分析物的相互作用為基礎(chǔ)，免疫測定法用于檢測從小尺寸(如，濫 用的藥物)到大尺寸(如，HIV蛋白)范圍的寬范圍的分子。血清學(xué)檢 測是檢測宿主對預(yù)先暴露抗原的免疫反應(yīng)、而不是直接測試抗原的免疫 測定法，即它們檢測針對抗原的宿主抗體的存在。從大型自動化中心實 驗室系統(tǒng)到非處方(over-the-counter, OTC)妊娠測試均可獲得許多的免疫 測定系統(tǒng)。檢測覆蓋各種形式，包括乳膠凝集試驗、沉淀試驗、酶聯(lián)免 疫測定、直接熒光分析、免疫組織學(xué)測試、補體結(jié)合試驗、血清學(xué)試 驗、免疫電泳分析、快速"試紙"檢測(如，側(cè)向橫流測試(lateral flow test)和流動測試(flow through test))。許多免疫學(xué)檢測的一個缺 點是它們相對不敏感。更具體地說，許多免疫測定法，例如酶聯(lián)免疫測 定(ELISA)，僅僅導(dǎo)致單個標記部分與分析物的結(jié)合。結(jié)果，樣品中分 析物水平較低時，所述的方法不產(chǎn)生足夠強的信號來提供樣品中分析物 的量的精確讀數(shù)，并因此容易產(chǎn)生假陰性結(jié)果。
在已經(jīng)發(fā)展的試圖改進免疫測定法靈敏性的方法中，至少一種方 法是"免疫PCR" (Sano等，1992; Adler等，2003; Joerger等，1995; Sperl等，1995)。該方法以形成分析物-抗體復(fù)合體為基礎(chǔ)，其中抗體偶 聯(lián)于多核苷酸。然后，將多核苷酸作為模板用于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR》 擴增產(chǎn)物作為測試樣品中分析物水平的指示物。然而，眾所周知，該方 法的主要問題是PCR指數(shù)擴增靶多核苷酸的缺陷，和由此引起的在靈敏
性與準確性之間獲得合適平衡以提供樣品中分析物水平的真實指示的困 難。
Zhang等人(2001)描述了已經(jīng)研發(fā)的、試圖改進免疫測定法的靈敏 性的另一方法。Zhang等人(2001)設(shè)計了涉及包含RNA聚合酶啟動子的 多核苷酸的方法，而不是依賴于偶聯(lián)抗體的多核苷酸的PCR擴增。 RNA聚合酶結(jié)合啟動子之后，轉(zhuǎn)錄互補于多核苷酸的RNA。然而，該 方法的缺點在于所產(chǎn)生的產(chǎn)物是RNA，而RNA在許多生物樣品中非 常易于降解。
需要可用于檢測樣品中的分析物的另外的分析方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人設(shè)計了用于在樣品中檢測分析物的分析方法。本發(fā)明的分 析方法導(dǎo)致形成可檢測的復(fù)合體，其包含超過一種與分析物結(jié)合的標記 部分。
在第一個方面中，本發(fā)明提供用于篩查樣品中存在或不存在分析物 的方法，該方法包括-
i) 將樣品暴露于結(jié)合分析物的第一化合物，以形成分析物-第一化合 物復(fù)合體，
ii) 將分析物-第一化合物復(fù)合體暴露于結(jié)合分析物-第一化合物復(fù)合 體的第二化合物，以形成分析物-第一化合物-第二化合物復(fù)合體，其中 第二化合物包含多核苷酸，
iii) 在下列條件下將分析物-第一化合物-第二化合物復(fù)合體暴露于聚 合酶，其中所述的條件是a)能容許聚合酶延長多核苷酸，或b)能容許聚 合酶合成多核苷酸的互補鏈，和
iv) 檢測步驟iii)中的a)或b)部分的產(chǎn)物，
其中步驟iii)的部分b)不包括使用互補鏈作為模板進一步合成多核 苷酸。
在第二個方面中，本發(fā)明提供用于篩査樣品中存在或不存在分析物 的方法，該方法包括
i) 將樣品暴露于結(jié)合分析物-第二化合物復(fù)合體的第二化合物，以形 成分析物-第二化合物復(fù)合體，其中第二化合物包含多核苷酸，
ii) 將分析物-第二化合物復(fù)合體暴露于結(jié)合分析物的第一化合物，以 形成分析物-第一化合物-第二化合物復(fù)合體，
iii) 在下列條件下將分析物-第一化合物-第二化合物復(fù)合體暴露于聚
合酶，其中所述的條件是a)能容許聚合酶延長多核苷酸，或b)能容許聚
合酶合成多核苷酸的互補鏈，和
iv) 檢測步驟iii)中的a)或b)部分的產(chǎn)物，
其中步驟iii)的部分b)不包括使用互補鏈作為模板進一步合成多核 苷酸。
檢測到分析中所產(chǎn)生的聚合酶產(chǎn)物，表明存在所分析的分析物。還 可測定產(chǎn)物的量，并且產(chǎn)物的量與被分析的分析物的量有關(guān)。因此，本 發(fā)明的方法可用于檢測、或用于檢測并定量測試樣品中的分析物。
在特別優(yōu)選的實施方案中，聚合酶延長單鏈多核苷酸或部分雙鏈多 核苷酸的單鏈突出端(single stranded overhang)。
上述實施方案不但具有不需要加入引物的優(yōu)點，而且額外的優(yōu)點在 于連接于(例如)抗體的多核苷酸相對較短。因此，在另外的優(yōu)選實施 方案中，多核苷酸長度小于約100個核苷酸、更優(yōu)選長度小于約75個 核苷酸、更優(yōu)選長度小于約50個核苷酸、更優(yōu)選長度小于約40個核苷 酸、更優(yōu)選長度小于約30個核苷酸、更優(yōu)選長度小于約20個核苷酸。
在另一個實施方案中，該方法不包括使用雜交多核苷酸的引物。
延長單鏈多核苷酸或部分雙鏈多核苷酸的單鏈突出端的聚合酶的實 例，包括但不限于，poly(A)聚合酶、T4RNA連接酶、端粒酶以及末端 轉(zhuǎn)移酶。優(yōu)選地，聚合酶為端粒酶或末端轉(zhuǎn)移酶。端粒酶可分離自天然來源或重組產(chǎn)生。此外，端粒酶可來自產(chǎn)生所 述分子的生物體，或其具有端粒酶活性的變體/衍生物/突變體。
本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)癌細胞、特別是人癌細胞，可提供用于本發(fā)明方 法的端粒酶的便利來源。因此在優(yōu)選的實施方案中，通過裂解產(chǎn)生端粒 酶的癌細胞來獲得端粒酶。值得注意的是，現(xiàn)己確定在被用于本發(fā)明方 法之前，不必從細胞裂解物其它成分中純化端粒酶。因此，優(yōu)選不必實 施任何過程來從被裂解細胞的其它成分中純化端粒酶。
如上指出的，優(yōu)選地，聚合酶能夠在缺少合適引物時延伸多核苷酸
或合成多核苷酸的互補鏈。然而，在一些利用酶(例如Taq聚合酶)的 實施方案中，需要有合適的引物，所述的引物在反應(yīng)條件下可雜交多核 苷酸并起到引發(fā)互補鏈的合成的作用。根據(jù)多核苷酸序列，很容易設(shè)計 合適的引物。所述的引物通常較小，長度至少約12個核苷酸、長度至 少約15個核苷酸、長度至少約18個核苷酸、長度至少約21個核苷酸、 或長度至少約24個核苷酸。在特別優(yōu)選的實施方案中，引物是線性 的。在另一特別優(yōu)選的實施方案中，引物是非環(huán)狀的。
在另一個實施方案中，聚合酶是DNA聚合酶。合適的DNA聚合酶 包括但不限于，Taq聚合酶、噬菌體T4聚合酶、噬菌體T7聚合酶以及 大腸桿菌(Eco/Z)DNA聚合酶I的Klenow片段。
在另外的實施方案中，其中在聚合酶是RNA聚合酶的情況下，多 核苷酸不包含被RNA聚合酶用來引發(fā)RNA轉(zhuǎn)錄的啟動子區(qū)。
優(yōu)選地，第一化合物和/或第二化合物附著在固相支持物上?？墒褂?技術(shù)人員已知的任何合適的固相支持物。實例包括但不限于，磁珠、生 物傳感器芯片、微量滴定板的孔、浸染棒以及微陣列玻片。
在另一個實施方案中，在存在至少一種以可檢測方式標記的核苷酸 的情況下，實施步驟iii)?？墒褂眉夹g(shù)人員已知的任何適當標記的核苷 酸。實例包括但不限于，放射性同位素、熒光標記、化學(xué)發(fā)光標記、生 物發(fā)光標記以及酶標記。
在另外的實施方案中，在存在至少一種半抗原偶聯(lián)的核苷酸的情況 下，實施步驟iii)，其中半抗原能結(jié)合配體。合適半抗原的實例包括但 不限于，半胱氨酸、賴氨酸、絲氨酸、生物素、抗生物素蛋白以及鏈霉 抗生物素蛋白。
優(yōu)選地，以可檢測方式標記配體?？墒褂眉夹g(shù)人員已知的任何合適 的可檢測標記。實例包括但不限于，放射性同位素、熒光標記、化學(xué)發(fā) 光標記、生物發(fā)光標記以及酶標記。
優(yōu)選地，步驟iii)還包括將聚合酶活性的產(chǎn)物暴露于以可檢測方式 標記的配體。
優(yōu)選地，可檢測的標記是酶?？墒褂眉夹g(shù)人員已知的任何合適的標
記的酶。實例包括但不限于，e-半乳糖苷酶、螢光素酶、堿性磷酸酶、 神經(jīng)氨酸酶以及辣根過氧化物酶。優(yōu)選地，步驟m)的聚合酶活性的產(chǎn) 物是至少包含多核苷酸和摻入其中的半抗原偶聯(lián)的核苷酸的復(fù)合體，其
中至少部分半抗原結(jié)合于酶標配體，并且步驟iv)包括將步驟iii)的產(chǎn)物
暴露于可允許酶產(chǎn)生可檢測信號的條件。
優(yōu)選地，通過酶與底物反應(yīng)來產(chǎn)生可檢測信號。用于本發(fā)明方法的
合適底物是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的。實例包括但不限于，魯米諾或9，10-
二氫化吖啶(acridan)。還需要用于酶活的輔因子，例如在包含魯米諾 作為底物的反應(yīng)中所存在的過氧化氫。此外，提供可增強可檢測信號的 分子。所述的分子在本領(lǐng)域中是已知的，并且包括但不限于對碘酚或?qū)?苯基苯酚。
優(yōu)選地，可檢測信號是發(fā)光或熒光。
本發(fā)明的每種方法都極有可能包括除去未結(jié)合的分析物、化合物、 底物等等的步驟。所述步驟的實例包括但不限于
，第一方面的步驟i)還包括洗滌分析物-第一化合物復(fù)合體，以除去 未結(jié)合的第一化合物，
，第二方面的步驟i)還包括洗滌分析物-第二化合物復(fù)合體，以除去 未結(jié)合的第二化合物，
*步驟ii)還包括洗滌分析物-第一化合物-第二化合物復(fù)合體，以除去 未結(jié)合的第一和/或第二化合物，
，除去未摻入的以可檢測方式標記的核苷酸、和/或
，除去未摻入的以可檢測方式標記的配體。
第一化合物是特異結(jié)合樣品中的分析物的任何化合物。在優(yōu)選的實 施方案中，第一化合物是蛋白質(zhì)。更優(yōu)選地，第一化合物是抗體。
第二化合物包含多核苷酸，特異結(jié)合分析物和/或第一化合物-分析 物復(fù)合體。優(yōu)選地，第二化合物是蛋白質(zhì)-多核苷酸偶聯(lián)物。更優(yōu)選地， 第二化合物是抗體-多核苷酸偶聯(lián)物。此外，優(yōu)選第二化合物結(jié)合分析 物。
在優(yōu)選的實施方案中，分析物是疾病狀態(tài)的標記。更優(yōu)選地，疾病 狀態(tài)選自但不限于，癌癥和感染。
使用本發(fā)明方法可檢測的合適分析物，包括有機和無機分子，所述 分子包括生物分子。在優(yōu)選的實施方案中，分析物是蛋白質(zhì)、肽或小分 子，例如有機小分子。
在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述方法包括
i) 將樣品暴露于結(jié)合分析物的第一化合物，以形成分析物-第一化合 物復(fù)合體，其中第一化合物附著于固相支持物，
ii) 將分析物-第一化合物復(fù)合體暴露于結(jié)合分析物的第二化合物，以
形成分析物-第一化合物-第二化合物復(fù)合體，其中第二化合物包含可被 端粒酶延伸的多核苷酸，
iii) 在允許端粒酶延伸多核苷酸的條件下，在存在至少一種半抗原 偶聯(lián)的核苷酸的情況下，將分析物-第一化合物-第二化合物復(fù)合體暴露 于端粒酶，
iv) 在允許半抗原結(jié)合配體的條件下，將端粒酶活性的產(chǎn)物暴露于酶
標記的配體，
v) 在存在酶的底物的情況下，溫育多核苷酸-半抗原-配體-酶復(fù)合
體，以及
vi) 檢測由酶對底物的活性產(chǎn)生的可檢測信號。 在另一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述方法包括
i) 將樣品暴露于結(jié)合分析物的第一化合物，以形成分析物-第一化合 物復(fù)合體，其中第一化合物附著于固相支持物，
ii) 將分析物-第一化合物復(fù)合體暴露于結(jié)合分析物的第二化合物，以 形成分析物-第一化合物-第二化合物復(fù)合體，其中第二化合物包含可被 末端轉(zhuǎn)移酶延伸的多核苷酸，
iii) 在允許末端轉(zhuǎn)移酶延伸多核苷酸的條件下，在存在至少一種半 抗原偶聯(lián)的核苷酸的情況下，將分析物-第一化合物-第二化合物復(fù)合體 暴露于末端轉(zhuǎn)移酶，
iv) 在允許半抗原結(jié)合配體的條件下，將末端轉(zhuǎn)移酶活性的產(chǎn)物暴露 于酶標記的配體，
V)在存在酶的底物的情況下，溫育多核苷酸-半抗原-配體-酶復(fù)合 體，以及
vi)檢測由酶對底物的活性產(chǎn)生的可檢測信號。
在另一方面中，本發(fā)明提供了用于篩査樣品中存在或不存在分析物
的方法，該方法包括
i) 將樣品暴露于結(jié)合分析物的第一化合物，以形成分析物-第一化合 物復(fù)合體，
ii) 將分析物-第一化合物復(fù)合體暴露于結(jié)合分析物-第一化合物復(fù)合 體的第二化合物，以形成分析物-第一化合物-第二化合物復(fù)合體，
iii) 將分析物-第一化合物-第二化合物復(fù)合體暴露于結(jié)合第二化合物 的第三化合物，其中第三化合物包含多核苷酸，
w)在下列條件下將分析物-第一化合物-第二化合物-第三化合物復(fù)合
體暴露于聚合酶，其中所述的條件是a)能容許聚合酶延長多核苷酸，或 b)能容許聚合酶合成多核苷酸的互補鏈，禾口 v)檢測步驟iv)中的a)或b)部分的產(chǎn)物，
其中步驟iii)的部分b)不包括使用互補鏈作為模板進一步合成多核 苷酸，并且其中將第一和/或第二化合物附著于固相支持物。
在本發(fā)明的該方面中，"第三化合物"被認為是可用于任何分析物 的檢測方法的"通用"試劑。在該方面中，優(yōu)選第二化合物是抗體，第 三化合物包含抗體，其中第二化合物(抗體)來自于第一動物物種，第 三化合物的抗體結(jié)合第二化合物(抗體)并來自于不同的動物物種。所 述的抗體及其制備方法是本領(lǐng)域中眾所周知的。例如，第二化合物(抗 體)來源于用分析物免疫的小鼠，第三化合物包含抗小鼠抗-IgG兔抗 體。在另一個實例中，第二化合物(抗體)來源于用分析物免疫的兔， 第三化合物包含抗兔抗-IgG山羊抗體。
使用"通用"試劑的測定法所具有的優(yōu)點，在于不需要生成用于檢 測不同分析物的多核苷酸偶聯(lián)物。例如，可從小鼠制備兩種分別獨立地 結(jié)合已知癌標記CEA和PSA的不同抗體，然而，相同的多核苷酸偶聯(lián) 的抗-小鼠抗-IgG兔抗體可用于檢測這些分析物的不同方法。
在應(yīng)用聚合酶后，可從復(fù)合體解離出所合成或延伸的多核苷酸鏈， 然而在本發(fā)明的任何方面中，不需要實施解離步驟即可容易地進行所合 成或延伸的鏈的檢測。
通過改變關(guān)鍵因子的濃度(例如結(jié)合分析物的化合物濃度、核苷酸 前體濃度、標記的核苷酸前體與未標記的核苷酸前體的比例、聚合酶量 以及檢測方法)，實施者可將本發(fā)明方法的靈敏性控制在某種程度上。 通過所屬領(lǐng)域技術(shù)人員己知的方法，可優(yōu)化具體的分析法。
還提供了蛋白質(zhì)-DNA偶聯(lián)物，其中DNA包含可結(jié)合端粒酶并被其 延伸的序列，蛋白質(zhì)共價連接于DNA。所述的偶聯(lián)物可用于本發(fā)明的 方法中。優(yōu)選地，蛋白質(zhì)是抗體。
在另一個方面中，本發(fā)明提供包含了本發(fā)明的蛋白質(zhì)-DNA偶聯(lián)物 的試劑盒。
顯而易見的是，本發(fā)明的一個方面的優(yōu)選特征和特性可適用于本發(fā) 明的許多其它方面。
貫穿說明書的用語"包括"，或其變體，例如"包含"或"含 有"，可被理解為暗示包括了所述的要素、整體或步驟，或包括了所述 的要素、整體或步驟的集合，但不排除任何其它的要素、整體或步驟， 或不排除任何其它的要素、整體或步驟的集合。
在下文中通過下列非限制性實施例并參照附圖，來描述本發(fā)明。
圖l一本發(fā)明第一個方面的方法的實施方案的示意圖。在該實例 中，第一化合物是結(jié)合磁珠的抗體。磁珠使得在洗滌步驟中使用磁選機 容易地將磁珠上形成的復(fù)合體與未結(jié)合成分分離。將包含分析物的樣品 與可使得分析物結(jié)合其上的第一化合物一起溫育，而后通過第二化合物 進行溫育步驟。在該實例中，第二化合物是抗體-DNA偶聯(lián)物，其與第 一化合物在不同的位置結(jié)合分析物。多核苷酸包括能結(jié)合人端粒酶并被 其延伸的序列。然后，在存在合適的核苷酸前體(包括生物素標記的 dUTP)的情況下，將分析物-第一化合物-第二化合物復(fù)合體與人端粒酶 一起溫育。然后，將摻入到延長的多核苷酸中的生物素標記的dUTP， 與抗生物素蛋白標記的辣根過氧化物酶(HRP)—起溫育。然后，在存在 過氧化氫、魯米諾和碘酚的情況下，通過溫育分析物-第一化合物-第二 化合物-生物素dUTP-抗生物素蛋白-HRP復(fù)合體，并在光度計中檢測光 信號，以將HRP活性作為樣品中分析物的量的指示物。
圖2—NY-ESO與兩種抗NY-ESO-l抗體(ES121和E978)的同時 結(jié)合的BIAcore分析。
圖3—通過使用抗-NY-ESO-l抗體偶聯(lián)的珠和作為抗原的NY-ESO-1陽性黑素瘤細胞系的裂解物，基于磁珠的夾心法ELISA表明與黑素瘤 細胞數(shù)目直接相關(guān)的線性響應(yīng)。
圖4一通過使用抗-EGFR抗體偶聯(lián)的珠和作為抗原的純化的 EGFR，基于磁珠的夾心法ELISA表明與重組蛋白濃度直接相關(guān)的線性 響應(yīng)。
圖5—在Superdex75柱(Amersham Bioscience)上可將交聯(lián)劑修飾 的抗體與未修飾的抗體分離，這表明使用兩種不同的抗體的偶聯(lián)反應(yīng)是 成功的，并且根據(jù)表觀分子大小可純化這些試劑。
圖6—在與還原的寡核苷酸偶聯(lián)后進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。這些 數(shù)據(jù)證實在圖5中所報道的觀測結(jié)果，其中當用溴化乙錠染色時，結(jié)合 寡核苷酸的抗體產(chǎn)生強的帶。
圖7—在Superose12柱(30/10)(Amersham Bioscience)上，使用空間 排阻層析法，從過量寡核苷酸分離的偶聯(lián)抗體的分布型。這些數(shù)據(jù)支持
了圖5中所作的預(yù)測使用標準色譜法，可實施結(jié)合寡核苷酸的抗體的 純化。
圖8 — 1.5%瓊脂糖凝膠，其顯示了通過空間排阻層析法，在 Superose12柱(30/10)(Amersham Bioscience)上進行純化后的寡核苷酸偶 聯(lián)抗體。顯示了每種抗體的峰值洗脫餾分8、 9、 10。
圖9一偶聯(lián)之前的抗體(泳道l&3)和純化的偶聯(lián)抗體(泳道 2&4)的SDS-PAGE (3-8% Tris-乙酸)，表明寡核苷酸結(jié)合抗體的復(fù)合 體具有合適的和預(yù)期的分子量。
圖IO—在Superose 12層析后，偶聯(lián)抗體的Mono Q洗脫曲線。峰 值不均一性表明多個寡核苷酸可偶聯(lián)抗體，進一步提供適于延伸反應(yīng) 的時機，并因此增強了本發(fā)明的測定法的檢測能力。
圖11 —在離子交換分離層析(MonoQ柱)后，寡核苷酸-偶聯(lián)抗體的 1.5%瓊脂糖凝膠。獨立地證實某些寡核苷酸-偶聯(lián)抗體具有多個附著的 核酸部分。
圖12—使用端粒酶，延伸結(jié)合抗體的寡核苷酸。增強的發(fā)光表明 在存在端粒酶的情況下，所摻入的生物素化UTP增加。
圖13—通過放大發(fā)光法(amplified luminescence)檢測NY-ESO-1 的測定結(jié)果(n-3)。
圖14一在使用末端轉(zhuǎn)移酶而放大信號后，檢測磁珠結(jié)合寡核苷酸。
圖15—顯示偶聯(lián)抗體的端粒酶識別序列的延伸反應(yīng)的基于磁珠的分 析。將末端轉(zhuǎn)移酶與作為底物的熒光素-dUTP —起用于延伸反應(yīng)。HI= 熱失活。
圖16 —放大的蛋白發(fā)光分析，其中顯示在存在末端轉(zhuǎn)移酶和熒光
素-dUTP的情況下，通過LMH42-寡核苷酸偶聯(lián)物對可溶性EGFR (殘 基1-621)的特異檢測。
圖17—基于磁珠的端粒酶分析，其中顯示在衍生于膀胱癌細胞系 (LAR41)的粗提取物和預(yù)凈化的提取物中的酶活性。HI-熱失活。
具體實施例方式
常規(guī)技術(shù)和定義
除非另外特別定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)的術(shù)語具有對 于所屬領(lǐng)域(如，細胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、免疫學(xué)、免疫組織化學(xué)、蛋 白質(zhì)化學(xué)以及生物化學(xué)領(lǐng)域)的普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。
除非另外指出，本發(fā)明中所用的重組蛋白質(zhì)、細胞培養(yǎng)以及免疫技 術(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是眾所周知的標準方法。所述的技術(shù)在下列 來源的文獻中已經(jīng)得到全部描述和說明，例如J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning,John Wiley禾口 Sons (1984); J. Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989); T.A. Brown (編者)，Essential Molecular Biology: A Practical Approach,第1巻和第2巻，IRL Press (1991); D.M. Glover和 B.D. Hames (編者)，DNA Cloning: A Practical Approach,第1-4巻，IRL Press (1995年禾卩1996年)；禾Q F.M. Ausubel等(編者)，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988年，包括迄今為止的所有更新版)；Ed Harlow和David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988);和J.E. Coligan等(編者)Current Protocols in
Immunology, John Wiley & Sons (包括迄今為止的所有更新版)，并且以 引用的方式并入本文。
"樣品"指疑似含有目的分析物的物質(zhì)?？墒褂脧膩碓粗苯荧@得的 樣品，或在至少一個步驟后，使用至少部分純化來自從來源直接獲得的 樣品的目的分析物。所述的樣品包括，例如，人、動物、植物、微生物 或人造樣品。可在不干涉分析的任何便利的介質(zhì)中制備樣品。通常，樣 品是如下更詳述的水性溶液或生物流體。樣品可來源于任何來源，例如 生理流體，包括血液、血清、血漿、唾液、痰液、眼晶狀體液、汗液、 糞便、尿液、乳液、腹水、粘液、滑液、腹膜液、皮膚分泌液、咽分泌 液、支氣管肺泡灌洗液、氣管吸痰液、腦脊髓液、精液、子宮頸粘液、 陰道分泌液或尿道分泌液、羊水，等等。本文中，細胞組織的流體勻漿 液，例如毛發(fā)、皮膚和指甲碎屑、肌肉的提取液，以及水果和堅果的皮 也被認為是生物流體。預(yù)處理包括從血液、稀釋的粘性流體等等制備血 漿。處理方法包括過濾、蒸餾、分離、濃縮、干擾組分的失活以及加入 試劑。除了生理流體之外，可使用適于工業(yè)、環(huán)境或食品生產(chǎn)分析以及 診斷分析的其它樣品，例如水、食品、土壤浸出液等等。另外，疑似含 有分析物的固體物質(zhì)可作為測試樣品，只要將其改變以形成液體介質(zhì)或 釋放分析物。在測試之前，生物、工業(yè)以及環(huán)境樣品的選擇和預(yù)處理， 在本領(lǐng)域中是眾所周知的，并不需要另外說明。
術(shù)語"分析物"指通過本發(fā)明方法而被檢測或分析的物質(zhì)。典型分 析物包括但不限于，有機分子、無機分子、蛋白質(zhì)、肽、細胞、微生物 及其片段和產(chǎn)物，或用于研究附著位點、結(jié)合元件或受體(例如抗體) 的任何物質(zhì)。
如本文中所用的，"核苷酸"指堿基-糖-磷酸酯組合。核苷酸是核 酸序列(DNA和RNA)的單體單元。術(shù)語核苷酸包括脫氧核糖核苷三 磷酸，例如dATP、 dCTP、 dITP、 dUTP、 dGTP、 dTTP或其衍生物。所 述的衍生物包括，例如，7-脫氮-dGTP和7-脫氮-dATP。根據(jù)本發(fā)明，
"核苷酸"可以是未標記的，或者通過眾所周知的技術(shù)進行可檢測標 記。然而，本發(fā)明方法中所用的至少一種核苷酸是可被檢測標記的，或 被偶聯(lián)于合適的半抗原。
術(shù)語"半抗原"指可連接于核苷酸并被聚合酶摻入多核苷酸的任何 分子。此外，半抗原能結(jié)合至少一種分子(本文中通常是指"半抗原" 的"配體")，也就是說連接于合適的可檢測標記，例如本文中所述的 標記。正如技術(shù)人員理解的，用語"半抗原"和"配體"僅僅作為限定 本發(fā)明實施方案的便利術(shù)語。具體地說，半抗原和配體是結(jié)合對的成 員，然而，究竟結(jié)合對的哪一個成員連接于例如核苷酸并不重要。例如 在一個實施方案中，半抗原可以是生物素，配體是鏈霉抗生物素蛋白， 然而在另一個實施方案中，半抗原是鏈霉抗生物素蛋白，而配體是生物 素。用于本發(fā)明方法的合適半抗原和配體("結(jié)合對")是本領(lǐng)域中眾 所周知的。
多核苷酸偶聯(lián)物
本發(fā)明方法需要包含多核苷酸的偶聯(lián)化合物和結(jié)合目的靶的分子 (例如蛋白質(zhì)，如抗體)。在許多實施方案中，目的靶是待測分析物。 然而，本發(fā)明也提供使用"通用"偶聯(lián)化合物，這是針對可直接結(jié)合分 析物的分子(例如抗體)。
多核苷酸可以是DNA或RNA或其組合。多核苷酸可以是單鏈或雙 鏈或其組合。
如本文中所用的，術(shù)語"多核苷酸"也指還能被延伸或作為多核苷 酸合成的模板的DNA和/或RNA衍生物。所述衍生物的實例是肽核酸 (PNA)。 PNA通常具有由肽鍵連接的重復(fù)N-(2-氨乙基)-甘氨酸單元組成 的骨架，而不是具有核糖骨架。通過甲叉羰基鍵，各種嘧啶和嘌呤堿基 連接于骨架。與DNA/DNA雙螺旋相比，PNA對降解較不敏感，并且與 DNA可形成更加穩(wěn)固的雙螺旋。
通過本領(lǐng)域中任何已知的技術(shù)，將多核苷酸偶聯(lián)于結(jié)合目的靶的分 子上。實例包括但不限于，使用生物素-抗生物素蛋白的相互作用、二硫
鍵的形成、胺偶聯(lián)(參見，例如，Hendrickson等人，1995年)、硫醇 偶聯(lián)(參見，例如，Niemeyer等人，2003年)、或醛-肼的相互作用 (參見，例如，Kozlov等人，2004年)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它偶 聯(lián)劑，包括間-馬來酰亞胺苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯或相關(guān)化合物、 碳二亞胺(例如l-乙基-3-(3-二乙氨基丙基)碳二亞胺(EDC))、琥珀酰亞 胺基4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)乙垸-l-羧酸酯(SMCC)、戊二醛交聯(lián)劑。
如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的是，可將超過一種的多核苷酸偶聯(lián)于單個 分子(例如抗體)上。這可增強分析的靈敏性。
例如，將多核苷酸偶聯(lián)于抗生物素蛋白，優(yōu)選是鏈霉抗生物素蛋白 或中性抗生物素蛋白，然后連接于生物素化抗體。另外，例如，可使用 類似于Chu等人(1986)描述的方法，其中生物素通過二硫鍵連接于多核 苷酸的5'末端，并且生物素化的多核苷酸與抗生物素蛋白結(jié)合以形成多 核苷酸-生物素-抗生物素蛋白加合物，于是這可偶聯(lián)于生物素化抗體。 對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，用于將抗生物素蛋白連接于多核苷酸的其它 方法是已知的，例如使用蛋白A(Sano等人，1992)的方法、使用結(jié)合目的 靶的分子(例如蛋白質(zhì)，如抗體)的方法
本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解，在一些情況中，將多核苷酸偶聯(lián)于可結(jié)合 目的靶的分子(例如蛋白質(zhì)，如抗體)，可引起空間位阻，導(dǎo)致聚合酶 的減少。通過使用合適接頭(例如在文獻中以前描述的那些接頭，包括 Kwon等人(2004)、 Arora等人(2002)以及Ansari等人(2001)論述的接 頭)，可防止這種情況。
聚合酶
通常，在本發(fā)明方法中，可使用任何能延伸多核苷酸、和/或合成多 核苷酸互補鏈的聚合酶。
本發(fā)明方法中所用的合適的依賴DNA的DNA聚合酶實例包括，但 不限于Tth DNA聚合酶、VentDNA聚合酶、Pwo聚合酶、來自細菌例 如大腸桿菌(五.co/Z)的DNA聚合酶I的K.lenow片段，以及T4 DNA聚合酶。
本發(fā)明方法中所用的合適的依賴RNA的DNA聚合酶實例包括，但 不限于AMV逆轉(zhuǎn)錄酶和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Superscript III和Tth聚合酶。
本發(fā)明方法中所用的合適的依賴DNA的RNA聚合酶實例包括，但 不限于T7RNA聚合酶、SP6RNA聚合酶和T3RNA聚合酶。
本發(fā)明方法中所用的合適的依賴RNA的RNA聚合酶實例包括，但 不限于Q|3復(fù)制酶、丙型肝炎RdRp、水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus)dRp 、蕪菁黃花葉病毒(turnip yellow mosaic virus)復(fù)制酶和RNA噬 菌體phi 6的依賴RNA的RNA聚合酶。
在特別優(yōu)選的實施方案中，聚合酶延伸單鏈多核苷酸或部分雙鏈多 核苷酸的單鏈突出端。所述聚合酶的實例包括但不限于，poly(A)聚合 酶、T4RNA連接酶、端粒酶和末端轉(zhuǎn)移酶。
本發(fā)明方法中所用的端粒酶可分離自永生性人細胞。通過在低滲緩 沖液中或非離子型去垢劑中進行提取，可純化端粒酶。還可通過DEAE 柱和后續(xù)純化技術(shù)，來進行純化。然而，通過僅僅裂解合適的細胞而不 需要實施任何純化步驟，可獲得端粒酶。含有端粒酶的細胞來源可以是 人腫瘤細胞系，例如LIM 1215(Whitehead等，1985)、 Hela細胞、HEK 293細胞(Graham等,1977)以及T-75細胞(vanBokhoven等，2001)。
端粒酶還可分離自許多其它來源，例如酵母或四膜蟲(Bryan 等,199S)。或者，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的重組方法制備端粒酶。
通過人端粒酶而延伸的合適的多核苷酸序列實例包括，但不限于 TTAGGGTTAGGGTTAGGG (SEQ ID NO :1) 、 TTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTT (SEQ ID NO 2)、TTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTTAGGGTTAGGGTTAG (SEQ ID NO :3)以及TTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTTAG (SEQ ID NO :4)。如 技術(shù)人員應(yīng)當理解的，上述核酸可以是截短的或延長的，并還可用于本 發(fā)明方法。
四膜蟲可合成端粒重復(fù)序列5' TTGGGG 3' (SEQ ID NO:5)。克隆編 碼序列上的模板，并可改變其序列，以編碼人端粒重復(fù)序列5'TTAGGG 3' (SEQ ID NO:6)。然后通過改變RNA序列重組四膜蟲酶，以制備合成 人端粒序列的端粒酶。可從四膜蟲獲得大量的這種酶，純化，并加入細 胞。
在本領(lǐng)域中，已知通常通過癌細胞生產(chǎn)端粒酶。因此，在本發(fā)明方 法中，當使用端粒酶(特別是哺乳動物端粒酶)作為用于檢測癌分析物 的酶時，優(yōu)選所述分析物與可內(nèi)源性包含在來自受檢對象的樣品中的任 何端粒酶是分離的。
末端轉(zhuǎn)移酶是催化單核苷酸dNTP反復(fù)添加到多核苷酸底物末端的 3'-OH上的聚合酶。適于這種酶的許多優(yōu)選的底物是突出的3'端，但所 述底物也可將核苷酸添加到DNA片段的平末端和3'凹末端上。通常鈷 是適于這種酶活性的必需輔因子，這些酶在某些情況下，可被引入分 析。末端轉(zhuǎn)移酶是在淋巴細胞中表達的哺乳動物酶類。可商業(yè)上購買 酶，也通?？赏ㄟ^?；蛟诖竽c桿菌中的表達來進行生產(chǎn)。商業(yè)來源的 實例是Promega(麥迪遜，威斯康星,美國)。
poly(A)聚合酶以不依賴序列的模式將腺苷添加到RNA的3'末端 上。通常使用距polyA位點約10-30個核苷酸的共有序列AAUAAA (SEQ ID NO:7)和該位點3'端的富GU和/或富U元件。如果AAUAAA 信號位于分子末端的合適距離，該信號通常對于聚腺苷酸化起始和延伸 反應(yīng)是足夠的。技術(shù)人員很容易制備可作為poly(A)聚合酶底物的RNA 分子。如本文中概述，酶可用于將標記ATP添加到RNA分子的3'端，
以生成標記RNA?？芍亟M制備poly(A)聚合酶，或通過從基本上任何真 核細胞進行純化而獲得poly(A)聚合酶。本發(fā)明方法中所用的poly(A)聚 合酶商業(yè)來源包括Ambion公司(Austin,得克薩斯，美國)、 Invitrogen(Carlsbad,加利福尼亞，美國)以及USB公司(Cleveland,俄亥俄， 美國)。
多核苷酸合成及其檢測
在一個實施方案中，偶聯(lián)多核苷酸作為用于聚合酶合成互補鏈的模 板。在另一個實施方案中，通過聚合酶的作用，來延伸偶聯(lián)的多核苷 酸。
在一個實施方案中，通過將合適引物退火到偶聯(lián)多核苷酸區(qū)來引發(fā) 聚合酶活性。只要能特異退火到多核苷酸區(qū)，引物可以是任何長度或堿 基組成。在存在一種或多種核苷三磷酸的情況下，并且如果需要，還可 在存在輔助結(jié)合蛋白的情況下，實施延伸反應(yīng)。
優(yōu)選通過分析與摻入的核苷酸相結(jié)合的半抗原的存在，測定dNTP 的摻入。在優(yōu)選的實施方案中，通過測量連接于特異dNTP的生物素分 子的存在，來檢測合成的多核苷酸鏈。通過酶聯(lián)鏈霉抗生物素蛋白分子 和例如化學(xué)發(fā)光的底物，顯示與多核苷酸鏈相關(guān)的生物素的存在。
在一個實施方案中，通過聚合酶，將半抗原標記的核苷酸(例如生 物素、地高辛配基)摻入不斷延伸的多核苷酸鏈。然后加入與半抗原結(jié) 合蛋白(配體)偶聯(lián)的酶以標記多核苷酸。加入適于酶(例如堿性磷酸 酶、辣根過氧化物酶或e-半乳糖苷酶)的化學(xué)發(fā)光底物，來發(fā)光(由檢 測器記錄)。
用于將底物轉(zhuǎn)變成光的合適酶，包括螢光素酶，例如昆蟲螢光素 酶。螢光素酶產(chǎn)生作為催化終產(chǎn)物的光。最著名的發(fā)光酶是螢火蟲 (P/^i"^ (鞘翅目)的發(fā)光酶(參見，例如，美國專利
5,618,722)。另外，已經(jīng)克隆了許多來自牙買加叩頭蟲(尸;;rop/onw
<formula>formula see original document page 29</formula>鞘翅目)的螢光素酶基因。在存在螢光素、5'三磷酸腺 苷(ATP)、鎂離子和氧的情況下，螢火蟲螢光素酶催化生物發(fā)光，得到 0.88的量子產(chǎn)率。個別螢光素酶有時可產(chǎn)生不同波長的光，這使得能夠 同時監(jiān)測不同波長的發(fā)光。
螢光素酶可直接水解dATP，同時伴隨釋放光子。這產(chǎn)生假陽性信 號，因為水解發(fā)生獨立于由于聚合酶活性引起的dATP的摻入。為了避 免這種問題，可使用被摻入DNA中的dATP類似物，B卩，dATP類似物 是DNA聚合酶的底物而不是螢光素酶的底物。 一種所述的類似物是a-硫代-dATP。因此，使用a-硫代-dATP避免了假性光子的產(chǎn)生，其中當 dATP被水解而沒有被摻入生長的核酸鏈時，可出現(xiàn)假性光子的產(chǎn)生。
具有市售化學(xué)發(fā)光底物的酶的實例，包括e-半乳糖苷酶、堿性磷酸
酶、神經(jīng)氨酸酶和辣根過氧化物酶。
堿性磷酸酶常常偶聯(lián)于被用作二級檢測試劑的鏈霉抗生物素蛋白、 抗生物素蛋白或抗體。這些檢測試劑廣泛地用于各種應(yīng)用，包括 ELISA、和Northem、 Southern以及Western印跡技術(shù)?？墒褂蔑@色底物 (例如產(chǎn)生深藍色沉淀的BCIP)、熒光磷酸酶底物以及化學(xué)發(fā)光底 物。堿性磷酸酶的CDP-Star 和CSPDTM (購自 Applied Biosystems,Foster City,力卩利福尼亞,美國)的化學(xué)發(fā)光底物，能相對靈 敏、快速、簡易地檢測堿性磷酸酶和堿性磷酸酶標記的分子。
NA-Star 化學(xué)發(fā)光底物(Applied Biosystems)能靈敏地檢測神經(jīng)氯酸 酶活性。這種底物為廣泛應(yīng)用的熒光底物甲基傘形基N-乙酰神經(jīng)氨酸的 高靈敏度的替代物。通過產(chǎn)生用膜或儀器檢測的可見光，1,2-二氧環(huán)丁 烷化學(xué)發(fā)光底物能極敏感地檢測生物分子。酶誘導(dǎo)分解時，化學(xué)發(fā)光底 物放射可見光，提供低本底發(fā)光伴隨著高強度光輸出。
辣根過氧化物酶(HRP)的化學(xué)發(fā)光底物可購自幾家制造商，包括 Alpha Diagnostic International，Inc.(San Antonio,Tex.) 禾卩 Pierce Biotechnology Inc.(Rockford，IL，USA)。 Alpha Diagnostic International's Nu
-Glo底物以穩(wěn)定的兩種組分溶液提供，且為基于魯米諾的溶液。在存在 過氧化氫的情況下，HRP將魯米諾轉(zhuǎn)換成激發(fā)態(tài)二階陰離子，它們在恢 復(fù)成其基態(tài)時發(fā)光?？赏ㄟ^使用暗室光度計或X光膠片測量所得的信 號，以提供永久記錄。
使用各種檢測裝置，如膠片、光電倍增管、CCD、 CMOS、消光光 度計、光度計、電荷注入器件(CID)、或其它固態(tài)檢測器，以及本文中 所述的裝置，可檢測和量化發(fā)光。在一個實施方案中，通過使用配備熔 合光導(dǎo)纖維束，進行確定放射的光子量。在另一個實施方案中，通過 使用配備了微通道板增強器的CCD相機，實現(xiàn)了放射的光子的定量。 可使用薄型背照式CCD(back-thinned CCD)來提高靈敏性。Bronks等人 (1995)描述了CCD檢測器。
示例性CCD系統(tǒng)是配備了 Lockheed-Martin LM485 CCD芯片和單 根纖維直徑6-8pm的1-1光纖連接器(束)的Spectral Instruments, Inc. (Tucson, Arizona,美國)系列的600 4-端口相機。這種系統(tǒng)具有超過1600 萬像素，并具有10%至大于40%的量子效率。因此，根據(jù)波長，在 CCD傳感器上成像的差不多40%的光子被轉(zhuǎn)變成可檢測的電子。
在其它實施方案中，熒光部分可用作標記，并可使用共聚焦掃描顯 微鏡來檢測反應(yīng)事件。另外，可使用掃描隧道顯微鏡和原子力顯微鏡。
在本發(fā)明方法中，可利用其它可通過放射的光子而被檢測的底物 (標記)的實例。9,10-二氫化吖啶底物與酶的反應(yīng)，產(chǎn)生可發(fā)光的激發(fā) 態(tài)中間體。例如，反應(yīng)可發(fā)生在Pierce Lumi-Phos WB底物和堿性磷酸 酶之間，然而可根據(jù)被其上的9,10-二氫化吖啶分子所取代的可裂部分而 改變所用的酶。魯米諾底物與過氧化物酶的反應(yīng)，產(chǎn)生不穩(wěn)定中間體， 該中間體發(fā)光可發(fā)光并被轉(zhuǎn)化成3-aminophtalate 二階陰離子。這種反應(yīng) 出現(xiàn)在Pierce SuperSignal ELISA Femto最高靈敏度的底物中。此外， 1,2-二氧環(huán)丁烷底物與酶的反應(yīng)，會產(chǎn)生不穩(wěn)定中間體，該中間體斷裂 產(chǎn)生兩種產(chǎn)物分子，即能發(fā)光的金剛烷酮和化學(xué)激發(fā)的熒光團。例如，
反應(yīng)可發(fā)生在Lumigen PPD和堿性磷酸酶之間。根據(jù)基于1,2-二氧環(huán)丁 烷的底物上取代的可裂部分，所用的酶可以不同。
對于大多數(shù)應(yīng)用而言，需要洗去未摻入的試劑，例如，用洗滌緩沖 液洗去未摻入的dNTP?？墒褂貌环恋K復(fù)合體的形成/穩(wěn)定性、和/或其檢 測的任何洗滌緩沖液。所述的洗滌緩沖液為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
固相支持物
通常，本發(fā)明方法中所用的至少一種試劑需要被附著于合適的固相 支持物。在特別優(yōu)選的實施方案中，將第一化合物附著在固相支持物 上。然而，在某些情況中，通過與載體的非特異性相互作用(例如，在 蛋白質(zhì)和聚苯乙烯之間的疏水性相互作用)而被直接吸收，分析物可起 到俘獲試劑的作用。
在本領(lǐng)域中，本發(fā)明方法中所用的合適的固相支持物是常規(guī)的和眾 所周知的。可考慮各種可能的載體。例如，合適的固定化支持物包括但 不限于，合成聚合物支持物，例如聚苯乙烯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸縮 水甘油酯(polyglycidylmethacrylate)、取代的聚苯乙烯(如，氨化 (animated)或羧化的聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚酰胺、聚氯乙烯，等 等)，玻璃，金，瓊脂糖，硝酸纖維素，和尼龍。這些材料可作為薄 膜、微量滴定板、加樣孔、珠、玻片、粒子、針(pin)、釘(peg)、試管、 膜或生物傳感器芯片?；蛘?，載體包括磁性和非磁性粒子。優(yōu)選的磁性 粒子是磁珠，例如購自Dynal Biotech (Oslo，挪威)、Polymer Labs Lodestar Beads (Shropshire ，英國)或Millipore CPG Beads (Millipore ,Lane Cove,澳大利亞)的磁珠。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，用于將各種分子附著到各種金屬、玻 璃、塑料等等的許多方法和接頭分子以及底物都是眾所周知的(參見， 例如，EP188,256 ; US,671,958 ; US4,659，839 ; US4,414，148 ; US4,699，784; US4，680,338; US4,569,789; US4,589,071以及H, Weetall,
Immobilized Enzymes, Antigens, Antibodies and Peptides, Marcell Dekker， Inc.,紐約(1975))。例如，"接頭"可用于將合適分子附著到固相支持 物上。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，合適的接頭是眾所周知的，包括但不 限于，直鏈或支鏈碳接頭、雜環(huán)碳接頭或肽接頭。
具有與表面基團反應(yīng)的一種官能團和與期望分子(例如第一化合 物)反應(yīng)的另一種官能團的雙功能接頭，可用于形成所需的偶聯(lián)物?；?者，衍生化作用可包括化學(xué)處理。例如，將二氧化硅或玻璃基板進行硅 垸化，以構(gòu)建官能團。類似地，例如，通過將連接于蛋白抗體的糖部分 與過碘酸酯進行二元醇裂解(glycol cleavage)以產(chǎn)生游離醛基，可將蛋 白質(zhì)或糖蛋白進行衍生化。在抗體或蛋白質(zhì)或糖蛋白上的游離醛基可與 表面的游離胺基或肼基反應(yīng)，以結(jié)合其上面的結(jié)合配偶體(參見 US4,671,95S)。用于在多肽(例如抗體或抗體片段)上產(chǎn)生游離巰基的 方法，也是已知的(參見US4,659,839)。
在水性環(huán)境中，可使用陣列來實施獨立平行的普通反應(yīng)。陣列具有 至少l，OOO個離散的反應(yīng)室的基片，其中反應(yīng)室含有能與試劑反應(yīng)的原 料，測量每個反應(yīng)室的容積，以便當將含有至少一種試劑的一種或多種 流體輸送到每個反應(yīng)室中時，試劑溢出加樣孔的擴散時間超出原料與試 劑反應(yīng)以形成產(chǎn)物所需的時間。通過在基片上形成多個空腔，可形成反 應(yīng)室。通過蝕刻、鑄?；蛭⑶邢骷庸ぃ稍诨行纬啥鄠€空腔?？涨?具有平底或凹底。在優(yōu)選的實施方案中，基片是光導(dǎo)纖維束。在另外的 實施方案中，通過在平面表面上形成不連續(xù)的膜片(patch)，可形成反應(yīng) 室。與周圍的平表面相比，膜片具有不同的表面化學(xué)。
抗體
出于本發(fā)明目的，除非相反規(guī)定，術(shù)語"抗體"包括保持對靶分析 物的結(jié)合活性的所有的抗體片段。所述的片段包括Fv、 F(ab')、 F(ab')2
和dAb片段，以及單鏈抗體(scFv)。此外，抗體及其片段可以是人源化 抗體，例如EP-A-239400中所述的抗體。
用于本發(fā)明方法的抗體可以是單克隆或多克隆的。然而，為了降低 與本底信號相關(guān)的任何問題，優(yōu)選抗體是單克隆的。
術(shù)語"特異性結(jié)合"指抗體結(jié)合樣品中的特殊分析物但不是其它分 子和/或非靶分析物的能力。
如果期望是多克隆抗體，可用目的分析物(例如免疫原性多肽) 來免疫所選的哺乳動物(如，鼠、兔、羊、馬，等等)。收集來自免疫 動物的血清，并根據(jù)已知方法進行處理。如果含多克隆抗體的血清含有 其它抗原的抗體，可通過免疫親和層析來純化多克隆抗體。在本領(lǐng)域 中，用于制備和加工多克隆抗血清的技術(shù)是已知的。
本領(lǐng)域技術(shù)人員還可容易地生產(chǎn)直接針對目的分析物的單克隆抗 體。通過雜交瘤來制備單克隆抗體的常規(guī)方法是眾所周知的。通過細胞 融合，也可通過其它方法，例如用致癌性DNA直接轉(zhuǎn)化B-淋巴細胞、 或用Epstein-Barr病毒轉(zhuǎn)染，可構(gòu)建生產(chǎn)永生化抗體的細胞系。根據(jù)各 種性質(zhì)，即，同種型和表位親合力，來篩選所生產(chǎn)的單克隆抗體組。
可選擇的技術(shù)包括篩選噬菌體展示文庫，其中，例如噬菌體在其衣 殼的表面上表達scFv片段與大量不同的互補決定區(qū)(CDR)。這種技術(shù)也 是本領(lǐng)域中眾所周知的。
用途
通過本發(fā)明方法可檢測的合適分析物，包括有機和無機分子，所述 分子包括生物分子。在優(yōu)選的實施方案中，分析物可以是環(huán)境污染物
(包括農(nóng)藥、殺蟲劑、毒素，等等)、化學(xué)品(包括溶劑、有機材料， 等等)、治療性分子(包括治療性和濫用的藥物、抗生素，等等)、生 物分子(包括激素、細胞因子、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物、細胞膜抗 原和受體(神經(jīng)、激素、營養(yǎng)物以及細胞表面受體)或其配體，等
等)、全細胞(包括原核細胞(例如病原菌)和真核細胞(包括哺乳動 物腫瘤細胞))、病毒(包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、腺病毒、慢病 毒，等等)、可用于生物恐怖主義的因子(例如炭疽)和孢子，等等。 特別優(yōu)選的分析物是環(huán)境污染物、核酸、蛋白質(zhì)(包括酶、抗體、抗 原、生長因子、細胞因子，等等)、治療性和濫用的藥物、細胞、以及 病毒。
特別優(yōu)選的靶分析物包括蛋白質(zhì)和核酸。如本文中所用的"蛋白 質(zhì)"，包括蛋白質(zhì)、多肽和肽。蛋白質(zhì)可由天然存在的氨基酸和肽鍵、
或合成的多肽模擬物結(jié)構(gòu)而組成。側(cè)鏈可以是(R)構(gòu)型或(S)構(gòu)型。
待檢的分析物包括激素，例如生長激素、胰島素、促腎上腺皮質(zhì) 激素(ACTH)、甲狀腺剌激激素(TSH)、促黃體生成素(LH)，以及胃腸激 素，如胰高血糖素樣肽；生長因子，例如表皮生長因子(EGF)、血管內(nèi) 皮細胞生長因子例如VEGF、 VEGF-B、 VEGF-C、 VEGF-D以及VEGF-E、神經(jīng)生長因子(NGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)以及相關(guān)分子、 成纖維細胞生長因子(FGF)、胰島素樣生長因子(IGF)以及肝細胞生長因 子；細菌毒素；細菌代謝物及其抗體；外生孢子成分；病毒殼體成分； 酶，例如堿性磷酸酶(ALP)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、乳 酸脫氫酶(LDH)、凝血因子；脂蛋白，例如極低密度脂蛋白(VLDL)、高 密度脂蛋白(HDL)以及低密度脂蛋白(LDL);受體，例如激素受體，如胰 島素受體、生長激素受體、EGF受體，和神經(jīng)受體，如乙酰膽堿受體； 癌標記，例如下述癌標記；細胞表面抗原，例如組織相容性抗原；自身 抗體；C-反應(yīng)蛋白；以及其它生理活性的物質(zhì)，例如肽酶抑制劑，如巨 球蛋白；以及補體，例如載體蛋白、IGF-結(jié)合蛋白以及轉(zhuǎn)鐵蛋白。
本發(fā)明可用于檢測樣品中腫瘤抗原(分析物)的存在。使用本發(fā)明 方法，可檢測的腫瘤抗原實例，包括但不限于，AFP (適于肝細胞癌和 生殖細胞腫瘤的標記)、CA 15-3 (適于眾多癌的標記，包括乳腺 癌)、CA 19-9 (適于眾多癌的標記，包括胰腺癌和膽道腫瘤)、CA
125 (適于各種癌的標記，包括卵巢癌)、降鈣素(適于各種腫瘤的標 記，包括甲狀腺髓樣癌)、苯鄰二酚胺和代謝物
(phaeochromoctoma) 、 CEA (適于各種癌的標記，包括結(jié)腸直腸癌及 其他胃腸道癌)、上皮生長因子(EGF)和/或上皮生長因子受體(EGFR)
(兩者都與各種上皮癌相關(guān)，包括結(jié)腸癌)、A33結(jié)腸上皮抗原(結(jié)腸 癌)、hCG/phCG (適于各種癌的標記，包括生殖細胞腫瘤和絨毛膜 癌)、尿中的5HIAA (類癌瘤綜合征)、PSA (前列腺癌)、血清素
(類癌瘤綜合征)、甲狀腺球蛋白(甲狀腺癌)、和CT抗原(Scanlan 等，2002)例如NY-ESO-l (食道癌和膀胱癌以及黑素瘤的標記)、 LAGE 、 MAGE (與許多肝癌以及黑素瘤相關(guān))、GAGE (肝癌)、 SSX2 (肉瘤)分化抗原(例如Melan A/MART1 ， GP100和酪氨酸 酶)、突變抗原(例如CDK4、 P-連環(huán)蛋白)、擴增抗原(例如P53和 Her2)、以及剪接變體抗原(例如ING1)。
本發(fā)明還可用于檢測樣品中微生物和/或其產(chǎn)生的分析物的存在。耙 可以是但不限于，病毒、細菌、真菌或原生動物。可用于本發(fā)明的具體 的非限制實例包括細菌，例如結(jié)核分枝桿菌(M;;cok^m'a wZ^cm/。^ )、立克次氏體(WcA:eto/a n'cfe咖7)、萊姆病螺方定體(5。/7^//0 6wgdor/er/)、鼠疫耶爾森氏菌(y^s/"/a pes泡)、梅毒螺旋體(7Vepowema j7"〃/(iww)、沙目艮衣原體(C7j/a附y(tǒng)c//(2 frvac/zo附a他)、月巿炎衣原體(C7z/awj^/a p"ewmo"/ae)、 月巿炎支原體(Afyco; /asma / "ewmow'ae)、 支原體屬 (Afyco/ /osm(3 s/ .)、嗜月巿軍團菌(丄6《/0恥//0/ "6"附0; / 7(3)、杜莫夫軍團菌 (Z^g/o"6//a <^mwo#0、 發(fā)酵支原體(Afyco/ /as7W0！ ybvw6"^ww)、 埃立克體 0E/w7z'c/z/a ■ / .)、流感嗜血桿菌(i7ae附o; /H71^/"y/we"z(3e)、腦膜炎奈瑟氏球 菌(iVe&sen'a mew."g7Y/fifc)、肺炎鏈球菌(5" re/ tococcM51 /wewwow/a)、 無乳 鏈球菌CS.aga/"W^)以及單核細胞增生性李斯特菌(Z^敏/a wo"oc"ogewes);病毒，例如1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)、 1型人T細 胞嗜淋巴細胞病毒(HTLV-1)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、單純
性皰疹、皰疹病毒6、皰疹病毒7、 Epstein-Barr病毒、巨細胞病毒、水 痘帶狀皰疹病毒、JC病毒、細小病毒...—B 19、流感病毒A、 B和C、 輪 狀病毒、人腺病毒、風(fēng)疹病毒、人腸道病毒、生殖器人乳頭瘤病毒 (HPV)、以及漢坦病毒；真菌，例如新型隱球菌(Co^toco"^ "e。ybr附flra)、 卡氏月市囊蟲(戶"gw/woc^sto can'"")、 莢膜組織胞槳菌 (///stop/os附(2 ca/wzJafw附)、皮炎芽生菌(丑/ostomyces cfer附""ricfts)、孝且球抱 子菌(Cocc/c /ozV/as /m腦Y/s)以及紅色毛癬菌(7Wc/zo/ 一o" rw6r謂)；和原 生動物，例如克魯斯氏錐體蟲(7b;;^"osowfl craz/)、利什曼原蟲屬 (Le/s/z附(2mV3！ s; .)、 癥原蟲屬(尸/aswcxi/M附痢疾P可米巴(五ma附oe6" ///加/Wco)、 田鼠巴貝蟲(5a6as/a附/cro")、 蘭氏賈第鞭毛蟲(GV"Wa /am6"a)、環(huán)孢子蟲(C^c/ospora )以及艾美耳球蟲屬(五/wen'a s/ )。 本發(fā)明方法也可用于檢測隱孢子蟲屬(07p加/7onA'"m sp.)卵囊；用于鑒 定細菌毒素，例如來自霍亂弧菌(F/6n》c/zo/erae 01)、產(chǎn)腸毒素大腸桿 菌、志賀氏桿菌屬CS/2/^化平)、腸侵染性大腸桿菌、幽門螺桿菌 (//e//cofeac^ / ;z/on')、產(chǎn)毒素難辨梭菌(C7o欲W謂d驕"7e)、金黃葡萄 球菌OSto; /^/ococcws aw/"eus)以及化膿性鏈球菌(iS/re/ tococc船/jyogewas)夕卜 毒素。
試劑盒
公開的檢測方法所需要的至少部分材料和試劑可一起組裝在試劑盒 中。本公開的試劑盒通常至少包括為實施請求保護的方法所必需的聚合 酶和核苷酸。在優(yōu)選的實施方案中，試劑盒包含蛋白質(zhì)-DNA偶聯(lián)物， 其中DNA包含可結(jié)合端粒酶并被其延伸的序列。在另一優(yōu)選實施方案 中，試劑盒也包含用于檢測樣品中的分析物的說明書。試劑盒還可包含 用于檢測聚合酶活性的工具。
試劑盒可還包含以不同的濃度提供的對照樣品，以使使用者你能繪
制合適的標準曲線。例如，用于檢測NY-ESO-l的試劑盒包含濃度為 25、 50、 100、 250以及500ng/ml的重組NYESO-l。
在每種情況中，優(yōu)選試劑盒具有適于每種單個試劑和聚合酶的不同 容器。通常將每種生物制劑在它們各自的容器中進行適宜地等分。試劑 盒的容器工具通常包括至少一種小瓶或試管。裝有試劑并對其進行等分
的培養(yǎng)瓶、瓶及其它容器工具也是可以的。優(yōu)選嚴格限制地保持試劑盒 的單個容器，以備商業(yè)銷售。
實施例
實施例1—NY-ESO-l與兩種抗NY-ESO-l抗體(ES121和E978)的同時結(jié) 合
通過胺偶聯(lián)化學(xué)作用，將小鼠抗人-NY-ESO-l mAb ES121(Jungbluth等，2001)固定化在CM5 BIACore表面等離子共振(SPR) 生物傳感器表面上。以流速5pl/min，將重組抗原NY-ESO-l (40mM尿 素/DDW中含15(Hig/ml) (Murphy等，2005)注射在ES121固定化表面 上。以流速5^il/min，注射抗體ES121，以確保沒有非特異性結(jié)合，然后 將小鼠抗人-NY-ESO-l mAb E978(Jungbluth等，2001)(Invitrogen Carlsbad, California,美國)注射在表面上。
結(jié)果表明抗原NY-ESO-l以相對較高的親合力與固定化ES121 mAb的表面結(jié)合，而且當再次將ES121 mAb注射在抗體-抗原表面上 時，幾乎看不到非特異性結(jié)合(圖2) 。 mAbE978的最后注射，顯示它 通過高親合力和特異性可識別和結(jié)合表面上所捕獲的NY-ESO-l。以抗 體結(jié)合的相反順序?qū)嵤┰搶嶒?，具有相似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。
實施例2—一級抗體偶聯(lián)和鑒定
將M270 Carboxylic Acid Dynal⑧珠偶聯(lián)于抗NY-ESO-l抗體(E978) 或抗EGFR抗體。根據(jù)制造商的說明書，使用l-乙基-3-(3-二甲基氨基 丙基)碳二亞胺(EDC)/N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)試劑，通過胺偶聯(lián)化學(xué)作 用，將各種抗體(25mM MES pH5)共價偶聯(lián)于M270羧酸珠。使用 Superose 12柱(10/30)，通過空間排阻層析(SEC)來監(jiān)測偶聯(lián)效率。
為了測定有效的mAb偶聯(lián)，和為了證實mAb仍然具有生物活性， 將基于珠的自動化夾心ELISA分析進行顯色。將偶聯(lián)于磁珠(300pg/ml 的偶聯(lián)珠)的抗體與其各種抗原(細胞裂解物或純化蛋白)進行溫育， 然后將該復(fù)合體與另一種已被生物素化的抗NY-ES0-1或抗EGFR抗體 (含2昭/ml的PBS/3%BSA緩沖液)進行溫育。根據(jù)ECL Protein Biotinylation Module試齊!j盒(Amersham Bioscience), 進行生物素化。為 了檢測，然后將它與作為最終化學(xué)發(fā)光讀出的底物的鏈霉抗生物素蛋白-HRP(lng/ml KPL ) —起溫育。加入5(HU魯米諾和50pl過氧化物 (SupersignalELISAFemto底物,Pierce)時，產(chǎn)生了化學(xué)發(fā)光。
結(jié)果表明對于兩個實施例而言，偶聯(lián)于磁珠都是有效的，并且抗 體以允許各種抗原結(jié)合的方向進行偶聯(lián)(圖3和圖4)。
實施例3 —寡核苷酸-抗體偶聯(lián)
將兩種抗體(抗-NY-ESO-l(ES121)和抗-EGFR)順利地偶聯(lián)于端粒酶 識別寡核苷酸(5'-TTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTTAGGGTTAGGG TTAG-3' -SEQIDNO:3)，所述的寡核苷酸包含5'硫醇修飾，容許通過 使用NHS-酯-馬來酰亞胺交聯(lián)劑N-[Y-馬來酰亞胺基丁酰-氧代]磺基琥珀 酰亞胺酯(磺基-GMBS,Pierce)經(jīng)過硫醇偶聯(lián)化學(xué)作用而進行偶聯(lián) (Schweitzer等,2000)。使用HPLC、 SDS-PAGE凝膠電泳和TBE-瓊脂糖 電泳，監(jiān)測偶聯(lián)和純度(圖5至圖9)。使用BCA(Pierce )和Oligreen (Pierce)分析(參見下文)，通過分光光度法獲得定量和化學(xué)當量。通過 氨基酸定量分析，獲得蛋白質(zhì)絕對濃度。由于多個標記經(jīng)過賴氨酸殘基的偶聯(lián)，使用Mono-Q層析實現(xiàn)了不 均一性的進一步分析(圖10)。通過SDS-PAGE (數(shù)據(jù)未顯示)和 1.5%瓊脂糖凝膠，分析餾分17-22回收的峰值，以顯示所產(chǎn)生的不同寡 核苷酸-抗體同工型(圖11)。
實施例4一寡核苷酸-抗體鑒定
在基于珠的延伸反應(yīng)分析中，分析實施例3中描述的寡核苷酸-抗 體，來確保寡核苷酸-抗體仍然具有生物活性，并能分別結(jié)合NY-ESO-l 或EGFR:該分析也表明寡核苷酸識別序列可通過酶(端粒酶)進行延 伸。
經(jīng)過胺偶聯(lián)化學(xué)作用，將Dynal M270胺磁珠與可溶性的EGFR的 高親合力形式進行偶聯(lián)。在Kingfisher微粒處理器中，進行自動化分 析。將6pl/孔的偶聯(lián)EGFR的磁珠用封閉緩沖液(PBS/1%BSA)進行封 閉，然后在室溫(RT)下將其與寡核苷酸-抗EGFR抗體一起溫育30分 鐘，或用于非放大分析抗EGFR抗體-生物素。根據(jù)ECL Protein Biotinylation Module試齊U盒(Amersham Bioscience), 進行生物素化。然 后將樣品與用于擴增的反應(yīng)混合液一起溫育，其中混合液含有20mM Tris-HCl、 1.5mM MgCl2、 63mM KC1、 ImM EGTA、 ImM EDTA、 150mMNaCl、 0.005%Tween 20、 12.5|iM生物素-21-dUTP、 18.75nM dAdG、 lnl端粒酶和來自1(^個細胞的LIM1215裂解物(墨爾本路德維格 學(xué)院細胞系1215-Whitehead等，1985)。包括熱失活的端粒酶(95°C， 20 分鐘)作為對照。在擴增步驟后，進行多次洗滌，然后室溫下將樣品與 0.5pg/ml鏈霉抗生物素蛋白-HRP —起溫育30分鐘。在這次溫育后，在 重懸浮于終容積的工作緩沖液中之前，用工作緩沖液洗滌樣品 (0.1M Tris， 0.1M KCl,pH7.4)，然后將樣品轉(zhuǎn)入白色發(fā)光96孔平板， 并在剛一加入50|il魯米諾和50^1過氧化物(Supersignal ELISA Femto底 物,Pierce )就在BMG Flurostar光度計中讀出發(fā)光。結(jié)果(11=2)表明來自放大分析的信號顯著地高于熱失活的對照和未 放大的ELISA信號(圖12)。
實施例5 —寡核苷酸-抗體定量
通過檢測ssDNA的基于熒光分析的Oligreen (Pierce)分析，來確定 寡核苷酸的含量。以通過未修飾寡核苷酸所生成的標準曲線為基準，定 量寡核苷酸-抗體。
通過標準BCA分析來測定抗體濃度，由于沒有寡核苷酸引起的信 號干擾，使得可準確地估計蛋白質(zhì)含量。在550nm讀出吸光度。
實施例6-使用端粒酶檢測NY-ESO-l
將偶聯(lián)于E978 mAb(180嗎)的磁珠與分離自黑素瘤細胞系LAR41的 NY-ESO-l陽性胞質(zhì)提取物一起溫育(0.5乂107細胞，室溫，60分 鐘)。黑素瘤細胞系的LAR(Ludwig Austin Repatriation)系列來源于路德 維格學(xué)院的病人活檢樣品，并在建立之前得到各個病人的同意。
在抗原結(jié)合后，將磁珠與ES121 mAb —起溫育(16|ag/ml，室溫下 60分鐘)，其中所述的ES121 mAb用適于端粒酶的寡核苷酸識別序列 (5'-TTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTTAGGGTTAGGGTTAG-3' - SEQ ID N0:3)進行標記，其中所述的寡核苷酸識別序列包含5'硫醇修飾，使 得使用NHS-酯-馬來酰亞胺交聯(lián)劑N-[ 馬來酰亞胺基丁酰-氧代]磺基琥 珀酰亞胺酯(磺基-GMBS,Pierce)(如上所述)通過硫醇偶聯(lián)化學(xué)作用來進行 偶聯(lián)。
在存在反應(yīng)混合緩沖液(20mM Tris-HCl 、 1.5mM MgCl2、 63rnM KC1 、 lmM EGTA 、 lmM EDTA、 150mM NaCl、 0.005o/o Tween20、 12.5nm生物素-21-dUTP、 18.75pM dAdG)的情況下，分離自HEK293 (人胚腎)細胞德端粒酶用于延伸寡核苷酸(37°C， 60分鐘)。該步驟 在酶延伸DNA序列時，沿著DNA序列加入許多生物素殘基。然后將復(fù)
合體與鏈霉抗生物素蛋白-HRP —起溫育(0.5pg/ml，室溫下30分 鐘)。在這次溫育后，用工作緩沖液洗滌樣品(O.lMTris， 0.1M KCl,pH7.4)，然后將樣品重懸浮于終容積5(^1的工作緩沖液中。然后 將樣品轉(zhuǎn)入白色發(fā)光96孔平板，并在剛一加入魯米諾和5(^1過氧 化物(Supersignal ELISA Femto底物，Pierce )就在BMG Flurostar光度計中 讀出發(fā)光。
使用適于自動操作的Kingfisher微粒處理器進行收集分析。結(jié)果 (n-3)表明剛一加入5(^l魯米諾和5(Hil過氧化物(Pierce)就產(chǎn)生強烈的 發(fā)光信號(圖13)。
實施例7—使用末端轉(zhuǎn)移酶延伸結(jié)合于磁珠的寡核苷酸模板
將磁性Dynal珠與單鏈DNA寡核苷酸(TTTTTTAATCCGT CGAGCAGAGTTAGGGTTAGGGTTAG-SEQ ID NO:3)進行偶聯(lián)。在這 種情況中，由于末端轉(zhuǎn)移酶不象端粒酶那樣優(yōu)先延伸特異序列，因此上 述序列是端粒酶所用的相同序列。為了這種酶修改了延伸條件，所用的 延伸緩沖液是50mM乙酸鉀、20mMTris-乙酸、10mM乙酸鎂、0.25mM 氯化鈷、12.5joM生物素-21-dUTP、 18.75pM dAdG、 10U末端轉(zhuǎn)移酶， pH7.9。將末端轉(zhuǎn)移酶加入各孔中，每孔有寡核苷酸偶聯(lián)的磁珠 (30mg/ml)、 100nl延伸緩沖液，37。C下延伸30分鐘。然后在工作緩沖 液(0.1MTris、 0.1M氯化鉀)中洗滌延伸的磁珠三次。然后將磁珠與 0.5pg/ml鏈霉抗生物素蛋白-HRP —起于室溫下溫育30分鐘，并在重懸 浮于終體積5(^1的工作緩沖液中之前，用工作緩沖液洗滌3次。然后將 樣品轉(zhuǎn)入白色發(fā)光96孔平板，并在一加入50pl魯米諾和過氧化物 (Supersignal ELISA Femto底物，Pierce )后就在BMG Flurostar光度計中讀 出發(fā)光。重復(fù)實驗兩次，包括熱失活的對照，其中通過在95'C下加熱 20分鐘來失活末端轉(zhuǎn)移酶。
結(jié)果顯示發(fā)光信號顯著地高于熱失活的對照，表明在該方法中， 端粒酶可被末端轉(zhuǎn)移酶取代(圖14)。
實施例8—使用末端轉(zhuǎn)移酶延伸結(jié)合于抗體的寡核苷酸模板
在0.1M硼酸鹽(pH9.6)中，通過過夜溫育，將Tosyl活化的Dynal珠 (15mg)偶聯(lián)于300昭的501FC (連接于抗體Fc區(qū)的EGF受體的配體結(jié) 合區(qū))。偶聯(lián)之后，充分洗滌珠，并通過與0.2MTris/0.1%BSA —起于 37t:溫育4小時，給未反應(yīng)的基團進行加帽。然后洗滌珠，并貯存在 PBS/0.1。/oBSA中。
利用如前所述的肼化學(xué)作用(Kozlov等，2004)，以含有端粒酶識別序 列(TTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTTAGGGTTAGGGTTAG)(SEQ ID NO :3)的靶核苷酸功能化抗-EGFR抗體。使用PBS緩沖液，以流速lml/ 分鐘和25。C柱溫，在Superose12 10/300柱(GE Amersham)上，利用尺寸 排阻HPLC從殘余反應(yīng)體純化所得的偶聯(lián)物。
在存在以端粒酶識別序列功能化的LMH42抗體的情況下，將1(^1 體積的501FC-偶聯(lián)的珠在室溫下溫育60分鐘，然后徹底洗滌。隨后用 1% BSA處理珠-501FC-抗體復(fù)合體，來降低非特異性本底信號。進一步 洗滌之后，在存在50^1反應(yīng)緩沖液(50mM乙酸鉀、20mMTris-乙酸、 10mM乙酸鎂、0.25mM氯化鈷、12.5 y M熒光素-dUTP、 18.75pM dAdG; pH 7.9)和0.5^1末端轉(zhuǎn)移酶(10U酶)的情況下，將復(fù)合體在37 'C下溫育60分鐘。在工作緩沖液(O.lMTris、 0.1M氯化鉀)中，將延 長的磁珠洗滌三次，然后與lpg/ml抗熒光素-HRP在室溫下溫育30分 鐘。之后，用工作緩沖液將磁珠洗滌三次，然后重懸浮于終容積5(^1的 工作緩沖液中。然后將樣品轉(zhuǎn)入白色發(fā)光96孔板，并在加入50^1魯米 諾和50jil過氧化物(Supersignal ELISA Femto底物，Pierce )后在BMG Fluorostar光度計中讀出發(fā)光。重復(fù)處理兩次，包括熱失活的對照，其中 通過在95。C下加熱30分鐘來失活末端轉(zhuǎn)移酶。
結(jié)果顯示(圖15):末端轉(zhuǎn)移酶能延伸寡核苷酸底物并包含標記的 核苷酸。因此，末端轉(zhuǎn)移酶顯然可用于本發(fā)明方法。
實施例9一使用末端轉(zhuǎn)移酶和熒光素-dUTP特異性檢測EGFR抗原
在0.1M硼酸鹽緩沖液(pH9.6)中，通過在37"C下過夜溫育，將 Tosyl活化的Dynal珠(15mg)偶聯(lián)于300昭的LMH41抗-EGFR mAb。偶 聯(lián)之后，充分洗滌磁珠，并通過與0.2MTris/0.1%BSA —起于37'C溫育 4小時，給未反應(yīng)的基團進行加帽。然后洗滌磁珠，并貯存在 PBS/0.1。/oBSA中。
利用如前所述的肼化學(xué)作用(Kozlov等,2004)，以含有端粒酶識別序 列(TTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTTAGGGTTAGGGTTAG) (SEQ ID NO :3)的靶核苷酸功能化抗-EGFR抗體。使用PBS緩沖液，以流速lml/ 分鐘和25"C柱溫，在Superose12 10/300柱(GE Amersham)上，利用尺寸 排阻HPLC來從殘余反應(yīng)體純化所得的偶聯(lián)物。
在存在不同濃度的EGFR抗原(sEGFR 1 - 621,Domagala等，2000)的 情況下，將lOpl體積的LMH41-偶聯(lián)珠在室溫下溫育60分鐘。多個洗 滌步驟之后，將抗原-抗體-磁珠復(fù)合體與被端粒酶識別序列功能化的 LMH42抗體在室溫下溫育60分鐘，然后徹底洗滌。隨后洗滌珠復(fù)合 體，然后在存在5(HU反應(yīng)緩沖液(50mM乙酸鉀、20mM Tris-乙酸、 10mM乙酸鎂、0.25mM氯化鈷、12.5^M熒光素-dUTP、 18.75pM dAdG; pH 7.9)和0.5pl末端轉(zhuǎn)移酶(10U酶)的情況下，將復(fù)合體在37 匸下溫育60分鐘。在工作緩沖液(0.1MTris、 0.1M氯化鉀)中，將延 長的磁珠洗滌三次，然后與lpg/ml抗熒光素-HRP在室溫下溫育30分 鐘。之后，用工作緩沖液洗滌磁珠三次，然后重懸浮于終容積5(^1的工 作緩沖液中。然后將樣品轉(zhuǎn)入白色的熒光96孔平板，并在加入5(^1魯 米諾和50|il過氧化物(Supersignal ELISA Femto底物,Pierce)后在BMG
Fluorostar光度計中讀出熒光。重復(fù)處理兩次，包括熱失活的對照，其中 通過在？5匸下加熱30分鐘來失活末端轉(zhuǎn)移酶。
結(jié)果顯示(圖16):末端轉(zhuǎn)移酶能延伸寡核苷酸底物并包含標記的 核苷酸。這種延伸反應(yīng)發(fā)生于與抗體形成復(fù)合體的寡核苷酸上，所述抗 體則結(jié)合于抗原，而所述抗原又結(jié)合于與磁珠偶聯(lián)的抗體。因此，在該 實施例中，分析法能檢測靶分析物(EGFR)。
實施例IO—粗提取物和預(yù)凈化物中的端粒酶活性的比較
用10mlPBS，將鋪滿LAR41細胞的10cm培養(yǎng)皿在原位洗滌兩 次。將細胞從平板上刮入lml PBS中，并轉(zhuǎn)入1.5ml管中。進行細胞計 數(shù)，并以13,0001"*111離心細胞5分鐘。除去上清液，并將RIPA裂解緩 沖液(50mMTris、 150mMNaCl、 lmM EDTA， l%Triton X-IOO、 1%去 氧膽酸鈉、0.1%SDS、蛋白酶抑制劑藥片(Roche ))加入細胞(200^1/1 乂106細胞)中。上下多次吸打細胞來裂解細胞，然后冰上溫育30分 鐘。隨后，以13，0001"導(dǎo)111于4°(:離心25分鐘。將上清液轉(zhuǎn)入鮮的1.5ml 管中，并分析端粒酶活性。
在存在反應(yīng)緩沖液(20mM Tris-HCl、 1.5mM MgCl2、 63mM KC1、 lmMEGTA、 lmM EDTA、 150mMNaCl、 0.005% Tween20、 12.5pM生 物素-21-dUTP、 18.75nMdAdG)和源自膀胱癌細胞系(LAR41)的提 取物的情況下，將通過胺偶聯(lián)化學(xué)作用(參見上文)偶聯(lián)了端粒酶識別 序列的磁珠在37"C下溫育30分鐘，其中所述的提取物可以是未處理的 (細胞裂解后沒有對提取物進行進一步的操作)，或可以是通過以 13,000r.p.m將提取物離心25分鐘(Sorvall Heraeus Fresco Biofiige,轉(zhuǎn)子 514400)而預(yù)凈化的。離心之后，上清液(預(yù)凈化的提取物)用于與粗 提物一起進行并列式端粒酶延伸反應(yīng)。
結(jié)果如圖17所示。作為對照，也顯示了熱失活(Hi)的樣品。顯 然，表達端粒酶的粗裂解細胞可作為用于本發(fā)明方法的酶源。
實施例11 —用于槍測CT抗原NY-ESO-l的放大的蛋白發(fā)光(APL)分析
利用標準的胺偶聯(lián)化學(xué)作用(過夜偶聯(lián)，pH8.3)，將Tosyl活化的 Dynal珠偶聯(lián)于抗-NY-ESO-l mAb E978(Sugita等，2004)。偶聯(lián)之后，充 分洗滌磁珠，并貯存在PBS中。
禾l擁如前所述的肼化學(xué)作用(Kozlov等，2004)，以含有端粒酶識別序 列(TTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTTAGGGTTAGGGTTAG)的耙核苷 酸功能化抗-NY-ESO-l抗體ES121(Chitale等,2004)。使用PBS緩沖液， 以流速lml/分鐘和25°。柱溫，在Superose12 10/300柱(GE Amersham) 上，利用尺寸排阻HPLC來從殘余反應(yīng)體純化所得的偶聯(lián)物。
利用BIAcore3000光學(xué)生物傳感器和固定化在傳感器表面上的mAb ES978，通過NHS/EDC化學(xué)作用以及夾心法ELISA，確定兩種抗體同 時結(jié)合NY-ESO-l的能力。
在含有0.5%甘油和蛋白酶抑制劑(MiniProtease, Roche)的 0.5%CHAPS、 10mM Tris-HCl 、 lmM MgCl2以及l(fā)mM EGTA(pH7.5) 中，通過裂解LIM 1215細胞(1(f細胞/ml)來產(chǎn)生活性的端粒酶制備 物。通過TRAP分析(Chemicon)確認活性，通過BCA分析測定蛋白水 平，并將等分試樣貯存在-7(TC中以備在APL分析中活化端粒酶的寡核 苷酸靶。
使用重組NY-ESO-1驗證APL分析(Davis等,2004)。在TC培養(yǎng)基 中，通過連續(xù)稀釋來制備NY-ESO校準標準。
將mAbE978-Dynal珠(約107珠)加入1.5ml Eppendorf管中含有 NY-ESO-1標準品的組織培養(yǎng)基(高達1ml)。通過在25。C下振蕩1小 時將NY-ESO-1選擇性回收于偶聯(lián)Dynal珠上。然后通過磁性粒子收集 器來吸附珠，并用PBS洗滌。洗滌之后，將珠重懸浮在200^1的PBS緩 沖液中，其中該緩沖液含有寡核苷酸功能化的mAbES121,在25"C進 —步振蕩1小時，與已被捕獲在Dynal珠上的NY-ESO-1形成復(fù)合體。 然后吸附珠，并以延伸緩沖液(20mM Tris-HCl、 1.5mM MgCl2、 63mM
KC1 、 lmM EGTA 、 0.1嗎/ml，含0.005% Tween20(Xu等，2002))洗滌， 然后將珠重懸浮于含有dATP和dGTP以及生物素化dUTP (200pl)的延 伸緩沖液中。然后加入提取自LIM 1215細胞的端粒酶(l)al，參見上 文)，并將管在32t:下振蕩溫育30分鐘。然后用1X延伸緩沖液洗滌 珠，隨后進一步洗滌(多次)來除去本底信號(例如通過提高NaCl濃 度、O.lMNaOH、降低pH或使用低濃度洗滌劑)，然后加入鏈霉抗生 物素蛋白-HRP(150plPBS中，含2pg/ml)并在32-C下溫育30分鐘。在重 懸浮于25^1相同緩沖液以備轉(zhuǎn)入96孔LumiNunc平板中之前，用含有 0.1M KC1的5 X 0.1M Tris-HCl(pH8.5)洗滌珠。
將LumiNunc平板轉(zhuǎn)入BMG FluoroStar光度計中，并使用儀器的自 動輸送泵來加入50pl魯米諾與增強劑以及50pl H202 (SuperSignal， Pierce Biotechnology Inc )，并記錄發(fā)光信號。
實施例12 —用于檢測抗CT抗原抗體的放大的蛋白發(fā)光(APL)分析
利用標準的胺偶聯(lián)化學(xué)作用(過夜偶聯(lián)，pH8.3)，將Tosyl活化的 Dynal珠偶聯(lián)于重組NY-ESO-1 (Davis等，2004)。偶聯(lián)之后，充分洗滌 珠，并貯存在PBS中。
禾U用如前所述的肼化學(xué)作用(Kozlov等,2004)，以末端轉(zhuǎn)移酶的靶核 苷酸序列功能化抗人抗IgG山羊抗體。使用PBS緩沖液，以流速lml/分 鐘和25。C柱溫，在Superose12 10/300柱(GE Amersham)上，利用尺寸排 阻HPLC來從殘余反應(yīng)體純化所得的偶聯(lián)物。
將含有潛在的抗NY-ESO-l抗體的尿樣(100pl)加到含有NY-ESO-l-Dynal珠(約107珠)的白色Nunc 96孔平板中。通過在25"C下振蕩 (lO，OOOrpm)l小時，將抗-NY-ESO-l抗體選擇性回收到Dynal珠上。然 后通過磁力將珠吸附到平板表面，并用PBS充分洗滌。洗滌之后，將珠 重懸浮在15(Hxl的PBS緩沖液中，其中該緩沖液含有寡核苷酸功能化的 抗人抗IgG山羊抗體，在25t:進一步振蕩(10，000rpm)1小時，與已被捕
獲在Dynal珠上的抗NY-ESO-l抗體形成復(fù)合體。然后將珠吸附到平板 表面，并用末端轉(zhuǎn)移酶延伸緩沖液(Genesearch反應(yīng)緩沖液，2.5mM CoCl2)洗滌珠，然后重懸浮于含有dATP和dGTP以及生物素化dUTP 的延伸緩沖液(5(^1)。然后加入末端轉(zhuǎn)移酶(lpl, Genesearch ,澳大利 亞)，并將管在32。C下振蕩(10，000rpm)溫育30分鐘。然后用1X延伸 緩沖液洗滌珠，隨后進一步洗滌(多次)來除去本底信號(例如通過提 高NaCl濃度、O.lMNaOH、降低pH或使用低濃度洗滌劑)，然后加入 鏈霉抗生物素蛋白-HRP(150iUPBS中，含2ug/ml)并在32"C下溫育30 分鐘。然后用含有0.1MKC1的5X0.1M Tris-HCl(pH8.5)洗滌珠，然后 重懸浮于25^1相同緩沖液以備轉(zhuǎn)入96孔LumiNunc平板中。
將LumiNunc平板轉(zhuǎn)入BMG FluoroStar光度計中，并使用儀器的自 動輸送泵來加入50nl魯米諾與增強劑以及50pl H202 (SuperSignal ,Pierce Biotechnology Inc .)，并記錄發(fā)光信號。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解的是在不背離本發(fā)明廣泛描述的精神或范 圍的前提下，可如具體實施方案所示對本發(fā)明進行多種改變和/或修飾。 因此，無論從哪一點來看，本發(fā)明的實施方案都被認為是用于舉例說明 的，而不是限制性的。
以上論述的AU出版物全文并入本文中。
本說明書中所包括的任何討論的文件、法案、材料、設(shè)備、論文等 等，僅僅用于給出本發(fā)明的范圍。不應(yīng)當理解為由于其存在于本申請 的各項權(quán)利要求的優(yōu)先權(quán)日之前，這些材料的任何或全部都已成為現(xiàn)有 技術(shù)基礎(chǔ)的一部分，或是在與本發(fā)明有關(guān)的領(lǐng)域中屬于公知常識。
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權(quán)利要求
1.一種用于篩查樣品中存在或不存在分析物的方法，該方法包括i)將樣品暴露于結(jié)合分析物的第一化合物，以形成分析物-第一化合物復(fù)合體，ii)將所述分析物-第一化合物復(fù)合體暴露于結(jié)合所述分析物-第一化合物復(fù)合體的第二化合物，以形成分析物-第一化合物-第二化合物復(fù)合體，其中第二化合物包含多核苷酸，iii)在下列條件下將所述分析物-第一化合物-第二化合物復(fù)合體暴露于聚合酶，其中所述的條件是a)能容許聚合酶延伸所述多核苷酸，或b)能容許聚合酶合成所述多核苷酸的互補鏈，和iv)檢測步驟iii)中的a)或b)部分的產(chǎn)物，其中步驟iii)的部分b)不包括使用所述互補鏈作為模板進一步合成多核苷酸。
2. —種用于篩查樣品中存在或不存在分析物的方法，該方法包括i) 將樣品暴露于結(jié)合分析物的第二化合物，以形成分析物-第二化合 物復(fù)合體，其中第二化合物包含多核苷酸，ii) 將所述分析物-第二化合物復(fù)合體暴露于結(jié)合所述分析物-第二化 合物復(fù)合體的第一化合物，以形成分析物-第一化合物-第二化合物復(fù)合 體，iii) 在下列條件下將所述分析物-第一化合物-第二化合物復(fù)合體暴露 于聚合酶，其中所述的條件是a)能容許聚合酶延伸所述多核苷酸，或b) 能容許聚合酶合成所述多核苷酸的互補鏈，和iv) 檢測步驟iii)中的a)或b)部分的產(chǎn)物， 其中步驟m)的部分b)不包括使用所述互補鏈作為模板進一步合成 多核苷.酸。.
3. 權(quán)利要求l或2中所述的方法，其中聚合酶延長單鏈多核苷酸或部分雙鏈多核苷酸的單鏈突出端。
4. 權(quán)利要求3中所述的方法，其中聚合酶選自poly(A)聚合酶、 端粒酶和末端轉(zhuǎn)移酶。
5. 權(quán)利要求4中所述的方法，其中聚合酶是端粒酶，并且所述 端粒酶通過裂解產(chǎn)生端粒酶的癌細胞而獲得。
6. 權(quán)利要求5中所述的方法，其中不進行將端粒酶與裂解的細 胞的其它成分分離的過程。
7. 權(quán)利要求1或權(quán)利要求2中所述的方法，其中聚合酶是選自下 列的DNA聚合酶Taq聚合酶、噬菌體T4聚合酶、噬菌體T7聚合酶 以及大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段。
8. 權(quán)利要求1至7中任何一項所述的方法，其中第一化合物和/ 或第二化合物附著于固相支持物上。
9. 權(quán)利要求8中所述的方法，其中固相支持物選自磁珠、生物 傳感器芯片、微量滴定板的加樣孔、浸染棒以及微陣列玻片。
10. 權(quán)利要求1至9中任何一項所述的方法，其中在存在至少一種 以可檢測方式標記的核苷酸的情況下，實施步驟iii)。
11. 權(quán)利要求10中所述的方法，其中可檢測的標記選自放射性同位素、熒光標記、化學(xué)發(fā)光標記、生物發(fā)光標記以及酶標記。
12. 權(quán)利要求1至9中任何一項所述的方法，其中在存在至少一種 半抗原偶聯(lián)的核苷酸的情況下，實施步驟iii)，其中所述的半抗原能夠 結(jié)合配體。
13. 權(quán)利要求12中所述的方法，其中半抗原選自半胱氨酸、賴氨 酸、絲氨酸、生物素、抗生物素蛋白以及鏈霉抗生物素蛋白。
14. 權(quán)利要求12或13中所述的方法，其中配體是以可檢測方式標 記的。
15. 權(quán)利要求14中所述的方法，其中可檢測的標記選自放射性同 位素、熒光標記、化學(xué)發(fā)光標記、生物發(fā)光標記以及酶標記。
16. 權(quán)利要求14或15中所述的方法，其中步驟iii)還包括將聚合 酶活性的產(chǎn)物暴露于所述以可檢測方式標記的配體。
17. 權(quán)利要求15或16中所述的方法，其中可檢測的標記是酶。
18. 權(quán)利要求17中所述的方法，其中酶選自p-半乳糖苷酶、螢光 素酶、堿性磷酸酶、神經(jīng)氨酸酶以及辣根過氧化物酶。
19. 權(quán)利要求17或18中所述的方法，其中步驟iii)的聚合酶活性 的產(chǎn)物是至少包含其中摻入了半抗原偶聯(lián)的核苷酸的多核苷酸的復(fù)合 體，其中至少部分半抗原結(jié)合于酶標記的配體，并且步驟iv)包括將步驟iii)的產(chǎn)物暴露于允許酶產(chǎn)生可檢測信號的條件下。
20. 權(quán)利要求19中所述的方法，其中通過酶與底物反應(yīng)產(chǎn)生可檢 測信號。
21. 權(quán)利要求20中所述的方法，其中底物是魯米諾或9，10-二氫化 吖啶。
22. 權(quán)利要求20或21中所述的方法，其中方法還包括提供增強所 述可檢測信號的分子。
23. 權(quán)利要求22中所述的方法，其中增強所述可檢測信號的分子 是對碘酚或?qū)Ρ交椒印?br>
24. 權(quán)利要求19至23中任何一項所述的方法，其中所述可檢測信 號是發(fā)光或熒光。
25. 權(quán)利要求1或3至24中任何一項所述的方法，其中步驟i)還 包括洗滌分析物-第一化合物復(fù)合體，以除去未結(jié)合的第一化合物。
26. 權(quán)利要求2至24中任何一項所述的方法，其中步驟i)還包括 洗滌分析物-第二化合物復(fù)合體，以除去未結(jié)合的第二化合物。
27. 權(quán)利要求1至26中任何一項所述的方法，其中步驟ii)還包括 洗滌分析物-第一化合物-第二化合物復(fù)合體，以除去未結(jié)合的第一和/或 第二化合物。
28. 權(quán)利要求1至9或25至27中任何一項所述的方法，其中方法 還包括除去未摻入的以可檢測方式標記的核苷酸。
29. 權(quán)利要求1至7或14至27中任何一項所述的方法，其中方法 還包括除去未摻入的以可檢測方式標記的配體。
30. 權(quán)利要求1至29中任何一項所述的方法，其中第一化合物是 蛋白質(zhì)。
31. 權(quán)利要求1至30中任何一項所述的方法，其中第一化合物是 抗體。
32. 權(quán)利要求1至31中任何一項所述的方法，其中第二化合物是 蛋白質(zhì)-多核苷酸偶聯(lián)物。
33. 權(quán)利要求1至32中任何一項所述的方法，其中第二化合物是 抗體-多核苷酸偶聯(lián)物。
34. 權(quán)利要求1至33中任何一項所述的方法，其中第二化合物結(jié) 合所述分析物。
35. 權(quán)利要求1至34中任何一項所述的方法，其中所述分析物是 疾病狀態(tài)的標記。
36. 權(quán)利要求35中所述的方法，其中疾病狀態(tài)選自癌癥和感染。
37. 權(quán)利要求1至36中任何一項所述的方法，其中所述分析物是 蛋白質(zhì)或肽。
38. 權(quán)利要求l中所述的方法，其中方法包括i) 將樣品暴露于結(jié)合分析物的第一化合物，以形成分析物-第一化合 物復(fù)合體，其中第一化合物附著于固相支持物上，ii) 將所述分析物-第一化合物復(fù)合體暴露于結(jié)合所述分析物的第二 化合物，以形成分析物-第一化合物-第二化合物復(fù)合體，其中第二化合 物包含可被端粒酶延伸的多核苷酸，iii) 在允許端粒酶延伸所述多核苷酸的條件下，在存在至少一種半抗原偶聯(lián)的核苷酸的情況下，將所述分析物-第一化合物-第二化合物復(fù) 合體暴露于端粒酶，iv) 在允許半抗原結(jié)合配體的條件下，將端粒酶活性的產(chǎn)物暴露于 酶標"l己的配體，v) 在存在所述酶的底物的情況下，溫育多核苷酸-半抗原-配體-酶復(fù) 合體，以及vi) 檢測由所述酶對底物的活性產(chǎn)生的可檢測信號。
39. 權(quán)利要求l中所述的方法，其中方法包括i) 將樣品暴露于結(jié)合分析物的第一化合物，以形成分析物-第一化合 物復(fù)合體，其中第一化合物附著于固相支持物上，ii) 將所述分析物-第一化合物復(fù)合體暴露于結(jié)合所述分析物的第二 化合物，以形成分析物-第一化合物-第二化合物復(fù)合體，其中第二化合 物包含可被末端轉(zhuǎn)移酶延伸的多核苷酸，iii) 在允許末端轉(zhuǎn)移酶延伸所述多核苷酸的條件下，在存在至少一 種半抗原偶聯(lián)的核苷酸的情況下，將所述分析物-第一化合物-第二化合 物復(fù)合體暴露于末端轉(zhuǎn)移酶， iv)在允許所述半抗原結(jié)合配體的條件下，將末端轉(zhuǎn)移酶活性的產(chǎn) 物暴露于酶標記的配體，V)在存在所述酶的底物的情況下，溫育多核苷酸-半抗原-配體-酶復(fù) 合體，以及vi)檢測由所述酶對底物的活性產(chǎn)生的可檢測信號。
40. —種用于篩査樣品中存在或不存在分析物的方法，方法包括i) 將樣品暴露于結(jié)合分析物的第一化合物，以形成分析物-第一化合 物復(fù)合體，ii) 將所述分析物-第一化合物復(fù)合體暴露于結(jié)合所述分析物-第一化 合物復(fù)合體的第二化合物，以形成分析物-第一化合物-第二化合物復(fù)合 體，iii) 將所述分析物-第一化合物-第二化合物復(fù)合體暴露于結(jié)合所述第 二化合物的第三化合物，其中第三化合物包含多核苷酸，iv) 在下列條件下將分析物-第一化合物-第二化合物-第三化合物復(fù) 合體暴露于聚合酶，其中所述的條件是a)能容許聚合酶延伸所述多核苷 酸，或b)能容許聚合酶合成所述多核苷酸的互補鏈，和v) 檢測步驟iv)中的a)或b)部分的產(chǎn)物，其中步驟iii)的部分b)不包括使用所述互補鏈作為模板進一步合成 多核苷酸，和其中所述第一和/或第二化合物附著在固相支持物上。
41. 一種蛋白質(zhì)-DNA偶聯(lián)物，其中DNA包含可結(jié)合端粒酶并被 其延伸的序列。
42. 權(quán)利要求41中所述的蛋白質(zhì)-DNA偶聯(lián)物，其中蛋白質(zhì)是抗體。
43. —種試劑盒，包含權(quán)利要求41或42中所述的蛋白質(zhì)-DNA偶 聯(lián)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測樣品中的分析物的方法。本方法是基于聚合酶對多核苷酸底物的活性，其中多核苷酸底物連接于結(jié)合分析物的分子，例如抗體。通過摻入適當標記的核苷酸，和/或摻入半抗原偶聯(lián)的核苷酸，可檢測聚合酶的活性，其中半抗原偶聯(lián)的核苷酸能夠結(jié)合適當標記的半抗原的配體。
文檔編號C07K16/46GK101115847SQ200580046714
公開日2008年1月30日 申請日期2005年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月16日
發(fā)明者E·C·尼斯, J·A·羅特哈克 申請人:希艾娜癌癥診療有限公司