專(zhuān)利名稱(chēng)：：具有高體內(nèi)活性的降血壓肽及其制備和純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種具有高體內(nèi)降血壓作用的螺旋藻降血壓肽的制備、純化方法，可應(yīng)用于保健性功能食品及藥品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：目前全世界有將近十億人口患高血壓，高血壓正成為嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的疾病之一。雖然卡托普利(C即topril)等人工合成血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑具有顯著的降血壓效果，然而這類(lèi)降血壓藥物屬酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，它們對(duì)酶活性部位的抑制是可逆的，藥物作用時(shí)間不長(zhǎng)，停藥后會(huì)使血壓反彈；而且，這類(lèi)藥物被吸收和排泄的速度較快，經(jīng)腎臟排出易損害腎功能，同時(shí)也會(huì)引起諸多的副作用，例如咳嗽、過(guò)敏、皮疹、水腫、心律失常和腎臟損害等，所以研發(fā)更為安全的天然來(lái)源ACE抑制劑十分必要。ACE抑制肽的研究在國(guó)外從上世紀(jì)六、七十年代開(kāi)始，而在國(guó)內(nèi)則從九十年代后期開(kāi)始才逐有報(bào)道。國(guó)內(nèi)外研究者已從不同的天然食物來(lái)源中分離出ACE抑制肽，如蝮蛇、牛奶、金槍魚(yú)、酪蛋白等，不同來(lái)源的ACE抑制肽在氨基酸數(shù)目、序列和活性上均存在較大差巳升°螺旋藻為藍(lán)藻的一個(gè)屬，含有多種營(yíng)養(yǎng)成分，具有營(yíng)養(yǎng)及醫(yī)療保健功能，被世界糧農(nóng)組織(FA0)譽(yù)為21世紀(jì)人類(lèi)最理想、最完美的食品。螺旋藻中尤以蛋白質(zhì)含量最為豐富，是大豆蛋白質(zhì)的兩倍，是目前已知植物中蛋白質(zhì)含量最高的一種，其中含有18種氨基酸，其中包括人體必需的全部8種氨基酸，是獲得天然活性肽的潛在寶貴資源，但高純度和高活性的螺旋藻源ACE抑制肽目前在國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道。此外，螺旋藻主要以干粉形式直接應(yīng)用食品行業(yè)，由于其溶解性質(zhì)的局限性，不利于人體吸收，使其應(yīng)用受到一定的限制。本研究采用3種不同種類(lèi)的酶及酶解提取、精制技術(shù)，獲得了9種ACE抑制肽，其中纈氨酸(valine)-谷氨酸(glutamicacid)-脯氨酸(proline)(Val-Glu-Pro，VEP)肽IC50=27.36±0.14iiM，Ki=23.59±0.54yM，其成果可廣泛應(yīng)用于保健性功能食品及藥品領(lǐng)域，具有巨大的實(shí)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服大分子蛋白質(zhì)吸收性差以及目前活性肽品種混雜不清、活性和純度不高方面的不足，獲得一種具有高體內(nèi)降血壓作用的螺旋藻降血壓肽的制備方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用超低溫凍融與超聲波破碎相結(jié)合的方法從螺旋藻粉末中提取蛋白，再利用木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶或嗜熱菌蛋白酶進(jìn)行不同條件的酶解，將以上3種酶水解所獲產(chǎn)物經(jīng)不同分子量大小的超濾膜麗CO10000、5000、3000過(guò)濾，獲得具有不同分子量多肽的濾液，以體外ACE抑制活性為指標(biāo)，通過(guò)凝膠過(guò)濾色譜、反相高效液相色譜對(duì)所提取多肽進(jìn)行純化，純化后的多肽使用PPSQ-31A/33A系列全自動(dòng)蛋白多肽序列分析儀和KratosAnalyticalShimadzu質(zhì)譜分析儀進(jìn)行鑒定?；钚噪牡捏w內(nèi)降血壓效果通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，并應(yīng)用分子生物學(xué)和免疫學(xué)等手段檢測(cè)相關(guān)調(diào)控因子的基因和蛋白表達(dá)，分析其體內(nèi)作用機(jī)制，證實(shí)具有良好的體內(nèi)降血壓效果，可應(yīng)用于保健性功能食品及藥品領(lǐng)域。此種具有高體內(nèi)降血壓作用的螺旋藻降血壓肽的制備，也可利用肽自動(dòng)合成儀通過(guò)多肽合成方法人工合成。下面對(duì)附圖進(jìn)行簡(jiǎn)要說(shuō)明。圖l是SuperdexP印tideHR10/30凝膠過(guò)濾色譜圖。橫坐標(biāo)軸表示分離各管的試管號(hào)，縱坐標(biāo)表示各管在220nm處的吸光度值。圖2是CosmosilMS-IIC18柱反相高效液相色譜圖，(a)表示第一次分離曲線(xiàn)圖，(b)表示第二次分離曲線(xiàn)圖。橫坐標(biāo)軸表示分離各管的試管號(hào)，縱坐標(biāo)軸表示各管在220nm處的吸光度值。圖3是ACE抑制肽的質(zhì)譜圖。圖4是抑制劑類(lèi)型圖。(a)表示Lineweaver-Burk圖，橫坐標(biāo)軸表示基質(zhì)濃度的倒數(shù)，縱坐標(biāo)軸表示反應(yīng)速度的倒數(shù)；(b)表示Dixon圖，橫坐標(biāo)軸表示抑制劑的濃度，縱坐標(biāo)軸表示反應(yīng)速度的倒數(shù)。圖5是HydrosphereC18柱反相高效液相色譜圖。(a)表示未經(jīng)消化酶消化的色譜圖，(b)表示經(jīng)胃蛋白酶消化的色譜圖，(c)表示經(jīng)胰凝乳蛋白酶消化的色譜圖，(d)表示經(jīng)胰蛋白酶消化的色譜圖，(e)表示經(jīng)胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及胰蛋白酶消化的色譜圖。橫坐標(biāo)軸表示時(shí)間，縱坐標(biāo)軸表示吸光度值。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但并不限制本發(fā)明的范圍。其具體工藝路線(xiàn)由以下步驟構(gòu)成1.蛋白提取及含量測(cè)定經(jīng)噴霧干燥獲得的螺旋藻粉20g懸浮在160mlMilli-Q水中，懸浮液經(jīng)液氮25-3(TC水浴法凍融五次，再用超聲波破碎3分鐘，以破碎螺旋藻壁使其中的蛋白質(zhì)游離出來(lái)。4t:下以6000g的速率離心30min，離心后去除沉淀，得到蛋白上清液。以牛血清白蛋白(BSA，SIGMA-ALDRICH公司)作為標(biāo)準(zhǔn)物，Bio-RadProteinAssay法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。上清液迅速真空冷凍干燥得到螺旋藻的蛋白粉。2.選擇不同的酶進(jìn)行酶解1)在30ml的螺旋藻蛋白液中加入終濃度為2.OmM的乙二胺四乙酸(EDTA)，5.OmML-半胱氨酸，300mM氯化鈉和5.0單位木瓜蛋白酶(Sigma，USA)。于60°C的溫度條件下，調(diào)節(jié)pH值至7.0，水解9小時(shí)。2)底物濃度為2%(相當(dāng)于20mg/ml)的蛋白質(zhì)溶液，調(diào)節(jié)pH值至8.5，加入Alcalase2.4L酶(酶與底物的比例為O.04(v/v))，混合均勻后，于50°C的溫度條件下水解10小時(shí)。3)底物濃度為2X的蛋白質(zhì)溶液，調(diào)節(jié)pH值至8.0，加入嗜熱菌蛋白酶(Wako，Japan)，加酶量0.1%(w/v)混合均勻后，于70°C的溫度條件下水解6小時(shí)。3.不同分子量活性液獲得水解物在6000g、4°C條件下經(jīng)IOOOO麗COVivascience超濾膜(SartoriusCo.，Germany)離心過(guò)濾去除酶，得到具有生物活性的下液。下液經(jīng)過(guò)不同分子量大小的超濾膜(麗C010000、5000、3000)過(guò)濾，獲得具有不同分子量的濾液，并測(cè)定各部分濾液的體外ACE抑制活性。濾液采用真空冷凍干燥保存。4.ACE抑制劑活性測(cè)定ACE抑制劑活性測(cè)定采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)基質(zhì)Abz-FRK(Dnp)P-OH，在帶有磁力轉(zhuǎn)子的2ml比色皿中加入19751Xassay緩沖液(包括0.1MTris-HCl(pH7.0)、50mMNaCl、10iiMZnCl2，0.001單位ACE禾P100iiL抑制劑溶液)，磁力轉(zhuǎn)子在37t:下轉(zhuǎn)動(dòng)均勻加熱。5分鐘后，由微量進(jìn)樣器加入15iiLFRET基質(zhì)，使其在2ml比色皿中終濃度達(dá)4.5iiM，在2分鐘內(nèi)連續(xù)記錄RF-5300-PC熒光分光光度計(jì)(ShimadzuCorporation,Japan,激發(fā)光波長(zhǎng)320nm，發(fā)射光波長(zhǎng)420nm)的數(shù)值。抑制率可由下式計(jì)算ACE抑制活性(％)=l-^^xl00C-D其中A代表在抑制劑溶液中添加FRET基質(zhì)2分鐘后的熒光值；B代表在抑制劑溶液中尚未添加FRET基質(zhì)前的熒光值；C代表以10mMTris-HCl(pH7.0)替代抑制劑溶液，添加FRET基質(zhì)2分鐘后的熒光值；D代表以10mMTris-HCl(pH7.0)替代抑制劑溶液，尚未添加FRET基質(zhì)前的熒光值。以上條件下能抑制50%ACE酶活性的抑制劑濃度(PM)被定義為這種抑制劑的IC50，由ACE抑制率(％)與抑制劑濃度回歸獲得。IC50數(shù)值越小，說(shuō)明此種抑制劑效果越強(qiáng)。5.凝膠過(guò)濾分離具有最高ACE抑制劑活性的凍干粉溶解在10ml10mMTris-HCl(pH7.0)中，并經(jīng)脫氣及0.22ymSupor膜(PallCo.USA)過(guò)濾處理，然后經(jīng)AKTA系統(tǒng)(AmershamPharmaciaBiotech,Sweden)凝膠過(guò)濾純化。流動(dòng)相為10mMTris-HCl(pH7.0)、150mMNaCl。色譜柱條件SuperdexP印tideHR10/30柱(lOmmX30cm;AmershamPharmaciaBiotech，Sweden)，流速為lml/min，柱壓低于1.5Mpa。整個(gè)設(shè)備系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)在4t:下進(jìn)行。洗脫峰在220nm波長(zhǎng)處進(jìn)行檢測(cè)并收集，其活性最高的管的收集液迅速進(jìn)行冷凍干燥。6.反相高效液相色譜(RP-HPLC)分離具有最高活性的收集液凍干粉，溶解于流動(dòng)相A中，并經(jīng)脫氣及0.22iimSupor膜過(guò)濾處理，然后經(jīng)AKTA系統(tǒng)反相高效液相色譜柱分離純化。流動(dòng)相A:0.1%三氟乙酸(TFA)溶解于1%乙腈(ACN)/水(v/v);流動(dòng)相B:0.1%TFA溶解于90%ACN/Water(v/v)。色譜柱條件COSMOSILMS-IIC18柱(4.6mmX250mrn，5iim，NacalaitesqueCo.Japan)，流速為1.5ml/min。洗脫峰在215nm處進(jìn)行檢測(cè)并收集。其活性最高的管的收集液迅速進(jìn)行冷凍干燥，再通過(guò)相同的RP-HPLC條件進(jìn)行分離純化。7.質(zhì)譜分析純化后的抑制劑的分子量通過(guò)基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS，KRATOSANALYTICALSHIMADZU，J即an)進(jìn)行檢測(cè)。0.5ii1樣品溶液與0.5ill基質(zhì)(5mg/mla-氰基-4-羥基肉桂酸，溶劑為等體積混合的ACN和0.1%TFA)形成的共結(jié)晶薄膜，在激光的照射下獲得的電離離子。未知樣品溶液濃度為1-lOpmol/iU以確保精確測(cè)定。8.氨基酸序列測(cè)定純化后的抑制劑的氨基酸序列通過(guò)PPSQ-31A/33A系列全自5動(dòng)蛋白/多肽序列儀(SHI廳ZU，J即an)測(cè)定。15的未知樣品溶液(超過(guò)50pmol)加到PVDF膜上經(jīng)自然干燥，采用Edman降解法從蛋白質(zhì)的N端按順序?qū)被崆邢?，切下的氨基酸與異硫氰酸苯(PITC)反應(yīng)，生成易于檢測(cè)的PTH氨基酸，再采用柱前衍生的液相色譜分析，從而進(jìn)行蛋白質(zhì)的氨基酸序列分析。實(shí)施例實(shí)施例1:經(jīng)噴霧干燥獲得的螺旋藻粉20g懸浮在160mlMilli-Q水中，經(jīng)液氮凍融、25-3(TC水浴法凍融五次，再用超聲波破碎3分鐘，獲得蛋白質(zhì)。fC下以6000g速率離心30分鐘，離心后去除沉淀，得到蛋白上清液并測(cè)定蛋白質(zhì)含量，上清液迅速真空冷凍干燥。在30ml底物濃度為2%的螺旋藻蛋白液中加入終濃度為2.OmM的乙二胺四乙酸，5.0mML-半胱氨酸，300mM氯化鈉和5.0單位木瓜蛋白酶。于60°C的溫度條件下，調(diào)節(jié)pH值至7.0，水解9小時(shí)。水解液在6000g、4t:條件下經(jīng)麗CO10000Vivascience超濾膜過(guò)濾去除酶，下液再經(jīng)過(guò)不同分子量大小的超濾膜(麗CO10000、5000、3000)過(guò)濾在4°C、6000g下超濾，測(cè)定各部分濾液的ACE抑制活性(見(jiàn)表1)。濾液迅速真空冷凍干燥。表1各部分濾液的ACE抑制活性<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>具有最高ACE抑制劑活性的分子量低于3000的凍干粉溶解在10ml10mMTris-HCl(pH7.0)中，并經(jīng)脫氣及O.22ymSupor膜過(guò)濾處理，然后通過(guò)SuperdexP印tideHR10/30柱平衡2循環(huán)體積(CV)，洗脫1.5CV，洗脫峰在220nm處進(jìn)行檢測(cè)并收集測(cè)定ACE抑制活性，其結(jié)果見(jiàn)附圖1。收集液迅速真空冷凍干燥。具有最高活性的第26-29管，溶解于流動(dòng)相A中，經(jīng)反相高效液相色譜進(jìn)一步分離純化，色譜柱用100%的流動(dòng)相A平衡2CV，逐漸升高流動(dòng)相B的濃度進(jìn)行梯度分離純化(0-50%，12CV;50-100%，3CV)，分離結(jié)果及ACE抑制活性檢測(cè)值見(jiàn)附圖2。收集液迅速真空冷凍干燥。抑制率最高的第22管再次反相高效液相色譜純化，梯度條件為流動(dòng)相A對(duì)B0-15%，1CV;15-20%，15CV;20-100%，2CV。分離結(jié)果及ACE抑制活性檢測(cè)值見(jiàn)附圖3。純化后的多肽經(jīng)質(zhì)譜分析及氨基酸測(cè)序，其氨基酸序列為纈氨酸(valine)-谷氨酸(glutamicacid)-脯氨酸(proline)(Val-Glu-Pro,VEP)，N端為疏水性氨基酸，C端為脯氨酸，具有典型的ACE抑制肽的特征，其結(jié)果見(jiàn)附圖3。實(shí)施例2:實(shí)施例1中純化的降血壓肽以不同濃度(0、3、7、11和15iiM)各取lOOiiL，如"
發(fā)明內(nèi)容"中所述方法在2ml的比色皿中加入IXassay緩沖液、ACE酶，在37。C下均勻加熱5分鐘。5分鐘后往反應(yīng)液中加入不同濃度(1.05，1.67和4.00iiM)的FRET基質(zhì)，反應(yīng)開(kāi)始，如"
發(fā)明內(nèi)容"中所述方法連續(xù)記錄2分鐘內(nèi)的熒光值。應(yīng)用雙倒數(shù)式，以反應(yīng)速度倒數(shù)(1/v)對(duì)FRET基質(zhì)濃度的倒數(shù)(1/[s])作圖，得到Lineweaver-Burk圖(附圖4(a));以1/v對(duì)抑制劑濃度([I])作圖，得到Dixon圖(附圖4(b))。從圖中結(jié)果可知，本發(fā)明所得的降血壓肽為ACE酶的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，這種抑制使得Vmax變小，但Km不變。抑制劑不僅與游離酶結(jié)合，也可以與酶_底物復(fù)合物結(jié)合。實(shí)施例3:實(shí)施例1中純化的降血壓肽分別通過(guò)胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶三種消化酶按以下步驟進(jìn)行體外穩(wěn)定性試驗(yàn)。1)胃蛋白酶0.2mL的1.5mM肽溶液(干燥后的粉末溶解于MilliQ水中)加入0.2mL的0.05%(w/v)胃蛋白酶液(SIGMA，溶解于0.1MKCl-HCl，pH2.0)中，在37。C下酶解6小時(shí)，加入INNaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0以停止反應(yīng)。2)胰凝乳蛋白酶0.2mL的1.5mM肽溶液加入0.2mL的0.05%(w/v)胰凝乳蛋白酶液(SIGMA，溶解于0.1MK3P04，pH8.0)中，在37。C下酶解6小時(shí)，加入6NHC1調(diào)節(jié)pH值至7.0以停止反應(yīng)。3)胰蛋白酶0.2mL的1.5mM肽溶液加入0.2mL的0.05%(w/v)胰蛋白酶液(SIGMA，溶解于O.1MK3P04，pH8.0)中，在37。C下酶解6小時(shí)，加入6NHCl調(diào)節(jié)pH值至7.0以停止反應(yīng)。4)胃蛋白酶一胰凝乳蛋白酶+胰蛋白酶0.2mL的1.5mM肽溶液加入0.2mL的0.05%(w/v)胃蛋白酶液(溶解于O.1MKCl-HCl，pH2.0)中，在37。C下酶解6小時(shí)，加入1NNa0H調(diào)節(jié)pH值至7.0以停止反應(yīng)。然后，在真空冷凍干燥后，加入0.2mL0.025%胰凝乳蛋白酶+0.025%胰蛋白酶混合酶液(溶解于0.6ml的0.1MK3P04，pH8.0)中，在37"下酶解6小時(shí)，加入6NHC1調(diào)節(jié)pH值至7.0以停止反應(yīng)。上述反應(yīng)停止后的混合液分別使用10，OOO麗CO超濾膜在4。C下以6，OOOg離心去除酶，取0.2mL進(jìn)樣RP-HPLC系統(tǒng)。流動(dòng)相A:0.1%TFA溶解于1%ACN/Water(v/v);流動(dòng)相B:0.1%TFA溶解于90%ACN/Water(v/v)。色譜柱條件HydrosphereC18柱(4.6mmX150mm，5iim，YMCCo.，Ltd,J即an)，流速為lml/min，柱壓低于15Mpa。柱子用流動(dòng)相A平衡15分鐘，然后流動(dòng)相A對(duì)B0-100%梯度洗脫30分鐘。洗脫峰與未消化前的降血壓肽洗脫峰相比較，經(jīng)不同酶處理后的降血壓肽液，在相同保留時(shí)間峰高和峰面積變化值均小于5%。峰高或峰面積變化值(％)=1-x100其中A是未經(jīng)酶消化的肽液的峰高或峰面積值；B是經(jīng)過(guò)酶消化的肽液的峰高或峰面積值。經(jīng)不同酶處理后降血壓肽液IC50值進(jìn)行了測(cè)定，其值變化也不大，說(shuō)明此種肽經(jīng)消化酶消化是穩(wěn)定的，結(jié)果如附圖5(a，b，c，d，e)所示。實(shí)施例4:根據(jù)實(shí)施例1中純化的降血壓肽的序列，通過(guò)PPSM-8肽自動(dòng)合成儀(SHIMADZU，Japan)使用固相法合成相應(yīng)的多肽。合成肽的純度使用反相高效液相色譜和質(zhì)譜檢驗(yàn)，純度>95%。實(shí)施例1中所示序列的多肽按10mg/kg(溶解于0.9X生理鹽水中，每只大鼠灌服量為lml)通過(guò)胃管每日上午11:00灌服8周齡雄性原發(fā)性高血壓大鼠(SHR，CharlesRiver，J即an)，時(shí)間持續(xù)一周。每日灌服前及第一日灌服后2、4、6、8、24小時(shí)的尾部動(dòng)脈收縮壓、舒張壓采用尾部套管法(BP-98A-L，Softron，Japan)檢測(cè)。如表2所示，首日灌服后4、6、8小時(shí)的收縮壓和舒張壓顯著低于負(fù)對(duì)照組(灌服等量的0.9%生理鹽水)，和正對(duì)照組(灌服降血壓藥物C即toporil，10mg/kg)結(jié)果相近，說(shuō)明本發(fā)明的降血壓肽具有顯著的體內(nèi)短期降血壓效果。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*與負(fù)對(duì)照組差異顯著，p<0.05。另外，從第三日起，灌服前處理組的血壓顯著地低于負(fù)對(duì)照組(表3)，說(shuō)明本發(fā)明的降血壓肽具有中長(zhǎng)期穩(wěn)定降血壓的效果。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*與負(fù)對(duì)照組差異顯著，p<0.05。權(quán)利要求一種具有高體內(nèi)活性的降血壓肽，所述降血壓肽的序列為纈氨酸-谷氨酸-脯氨酸，其中C端為脯氨酸，N端為纈氨酸。2.—種含有如權(quán)利要求1所述的降血壓肽的螺旋藻制劑的制備方法，其特征在于所述方法包括以下步驟1)蛋白提取步驟將螺旋藻粉末經(jīng)液氮-水浴凍融，再對(duì)其進(jìn)行超聲波破碎和離心，從而獲得上清液，將所述上清液迅速真空冷凍干燥得到螺旋藻蛋白粉；2)蛋白水解步驟將所述螺旋藻蛋白粉加入水中進(jìn)行溶解，從而配制成螺旋藻蛋白液，采用選自木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶或嗜熱菌蛋白酶對(duì)所述螺旋藻蛋白液進(jìn)行水解，得到水解產(chǎn)物；3)螺旋藻制劑獲得步驟用不同的超濾膜對(duì)所述水解產(chǎn)物進(jìn)行過(guò)濾，測(cè)定濾液的體外血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性，將活性最高的濾液真空冷凍干燥，從而得到所述螺旋藻制劑。3.如權(quán)利要求2所述的螺旋藻制劑的制備方法，其中所述方法還包括純化步驟，所述純化步驟為對(duì)活性最高的濾液進(jìn)行凝膠過(guò)濾分離和反相高效液相色譜分離。4.如權(quán)利要求1所述的降血壓肽的制備方法，其特征在于所述降血壓肽可利用肽自動(dòng)合成儀通過(guò)合成方法人工合成。5.如權(quán)利要求1所述的具有高體內(nèi)活性的降血壓肽在制備具有降血壓作用的保健功能性食品或藥劑中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種具有高體內(nèi)降血壓活性的降血壓肽及其制備和純化方法，所述降血壓肽的序列為纈氨酸-谷氨酸-脯氨酸，C端為脯氨酸，N端為纈氨酸，以及這種降血壓肽的制備和純化方法。本發(fā)明以螺旋藻粉末為原料，采用超低溫凍融與超聲波破碎相結(jié)合的方法提取螺旋藻蛋白，再利用木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶或嗜熱菌蛋白酶進(jìn)行水解，通過(guò)檢測(cè)體外血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性作為參考指標(biāo)，確定最佳的酶解工藝參數(shù)。酶解后的螺旋藻活性肽混合液再通過(guò)超濾、凝膠過(guò)濾色譜和反相高效液相色譜分離等步驟，得到高純度、高活性的螺旋藻降血壓肽。所述降血壓肽具有明顯的降血壓效果。文檔編號(hào)C07K5/083GK101768209SQ20091007620公開(kāi)日2010年7月7日申請(qǐng)日期2009年1月5日優(yōu)先權(quán)日2009年1月5日發(fā)明者任迪峰,王建中,魯軍,魯勇申請(qǐng)人:北京林業(yè)大學(xué)