專利名稱：C型利鈉肽變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本文的領(lǐng)域大體而言涉及C型利鈉肽(CNP)的變體、包含CNP變體的組合物、制造 CNP變體的方法，及使用CNP變體來治療CNP反應(yīng)性病癥的方法，這些病癥包括(但不限于) 骨相關(guān)病癥，諸如骨骼發(fā)育不良(例如軟骨發(fā)育不全)，及血管平滑肌病癥。
背景技術(shù)：
利鈉肽家族系由三種結(jié)構(gòu)上相關(guān)的肽組成心房利鈉肽(ANP) (Genbank登錄號(hào) NP_006163,針對(duì)ANP前驅(qū)蛋白質(zhì)NPPA)、腦利鈉肽(BNP) (Genbank登錄號(hào)NP_002512，針對(duì)BNP前驅(qū)蛋白質(zhì)NPPB)，及C型利鈉肽(CNP) (Biochem. Biophys. Res. Commun.(生物化學(xué)生物物理研究通訊)，168 =863-870 (1990) (GenBank登錄號(hào)NP_077720，針對(duì)CNP前體蛋白質(zhì) NPPC) (J. Hypertens.(高血壓雜志)，10 :907-912 (1992))。此等小型單鏈肽(ANP、BNP、 CNP)具有一個(gè)17個(gè)氨基酸的環(huán)結(jié)構(gòu)(Levin等人，N. Engl. J. Med.(新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志)， 339 :863-870(1998))且在多個(gè)生物過程中具有重要作用。ANP及BNP結(jié)合并活化利鈉肽受體A(NPR-A)(亦稱為鳥苷酸環(huán)化酶A(GC-A))，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)環(huán)單磷酸鳥苷(cGMP)含量升高。 同樣，CNP與NPR-B(GC-B)相互作用刺激cGMP的產(chǎn)生(J. Hypertens.(高血壓雜志)，10 1111-1114(1992))。第三類型的受體NPR-C以高親和力結(jié)合各利鈉肽且主要用以捕捉來自細(xì)胞外代謝區(qū)的肽且使這些肽沉積于溶酶體中，這些肽在此處被降解(kience (科學(xué))， 238 :675-678 (1987))。ANP及BNP主要在心肌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，且據(jù)信其在心血管內(nèi)穩(wěn)定中具有重要作用Science(科學(xué))，252 :120-123(1991))。CNP表達(dá)更廣泛，包括表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、生殖道、骨及血管內(nèi)皮中(Hypertension (高血壓)，49 =419-426 (2007)) 在人類中，CNP最初自呈126個(gè)氨基酸單鏈前原多肽形式的利鈉肽前體C(NPPC) 基因產(chǎn)生(Biochem. Biophys. Res. Commun.，(生物化學(xué)生物物理研究通訊)168 863-870(1990))。移除信號(hào)肽得到原CNP，且通過內(nèi)切蛋白酶弗林蛋白酶(furin)的進(jìn)一步切割產(chǎn)生53個(gè)氨基酸的活性肽(CNP-53)，其經(jīng)分泌且經(jīng)未知酶再次切割產(chǎn)生22個(gè)氨基酸的成熟肽(CNP-22) (ffu, J.Biol. Chem.(生物化學(xué)雜志)278 :25847-852 (2003))。 CNP-53及CNP-22在其分布方面不同，其中CNP-53在組織中居主導(dǎo)，而CNP-22主要見于血漿及腦脊髓液中(J. Alfonzo, Recept. Signal. Transduct. Res.(受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究),26 269-297(2006)) ο軟骨中的主要CNP形式尚未知。CNP-53與CNP-22類似地結(jié)合于NPR-B。 此外，其均以劑量依賴性方式及類似方式誘導(dǎo)cGMP產(chǎn)生(VT Yeung, P印tides (肽)，17 : 101-106(1996))。先前已描述天然CNP基因及多肽。美國專利第5，352，770號(hào)揭示來自豬腦的在序列方面與人類CNP相同的經(jīng)分離及純化的CNP-22，及其在治療心血管適應(yīng)癥中的用途。美國專利第6，034，231號(hào)揭示原CNP (126個(gè)氨基酸)的人類基因及多肽，及人類CNP-53基因及多肽。細(xì)胞外間隙的CNP清除通過迅速降解CNP的膜結(jié)合中性內(nèi)肽酶(NEP)的作用 (Biochem. J.(生物化學(xué)雜志)，(第一部分)83-88 (1993))，及經(jīng)由結(jié)合于CNP且使CNP 沉積于溶酶體(CNP在此處降解)中的NPR-C。已顯示CNP在正常人類中具有2. 6分鐘的活體內(nèi)半衰期(J. Clin. Endocrinol. Metab.(臨床內(nèi)分泌代謝雜志),78 1428-35 (1994))。 CNP的低血漿濃度(J. Bone Moner. Res.，(骨礦物質(zhì)研究雜志)19 (增刊1) S20 (2004))及其與NPR-B在許多組織中共表達(dá)表明CNP主要經(jīng)由自分泌/旁分泌機(jī)制起作用。如上所述，CNP結(jié)合并活化利鈉肽受體B (NPR-B)(亦稱為鳥苷酸環(huán)化酶B (GC-B))， 導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)環(huán)單磷酸鳥苷(cGMP)含量升高。由cGMP產(chǎn)生所介導(dǎo)的下游信號(hào)傳導(dǎo)會(huì)影響一系列不同生物過程，包括軟骨內(nèi)骨化。因此，提高或抑制此路徑中任何組分的含量皆可能會(huì)引起骨生長異常。舉例而言，在小鼠模型中敲除CNP或NPR-B產(chǎn)生長骨及椎骨較短的矮化表型的動(dòng)物。已鑒別出人類NPR-B中阻斷適當(dāng)CNP信號(hào)傳導(dǎo)的突變且其導(dǎo)致侏儒癥(Olney等人，J.Clin. Endocrinol. Metab.(臨床內(nèi)分泌代謝雜志)91 (4) :1229-1232(2006) ；Bartels 等人，Am. J. Hum. Genet.(美國人類遺傳學(xué)雜志)75 27-34 (2004)) 0相反，工程改造成產(chǎn)生較高含量的CNP的小鼠呈現(xiàn)延長的長骨及椎骨。軟骨發(fā)育不全是由成纖維細(xì)胞生長因子受體3 (FGFRj)基因的常染色體顯性突變(導(dǎo)致軟骨形成異常)引起。FGFR-3通常對(duì)軟骨細(xì)胞生長及因此骨生長具有負(fù)調(diào)節(jié)作用。 在軟骨發(fā)育不全中，F(xiàn)GFR-3的突變形式具有組成型活性，其引起骨嚴(yán)重縮短。軟骨細(xì)胞增殖與分化似乎均受到干擾，導(dǎo)致生長板軟骨顯著較短(P. Krejci等人，J. Cell Sci.(細(xì)胞科學(xué)雜志)118 :5089-510(^200 )。軟骨內(nèi)骨化為控制長骨縱向生長的過程。生長板存在四個(gè)區(qū)域靜止區(qū)、增殖區(qū)、肥大區(qū)及鈣化區(qū)。在生長板中，NPR-B由增殖細(xì)胞表達(dá)，而NPR-C 由肥大細(xì)胞表達(dá)(Yamashite等人，J. Biochem.(生物化學(xué)雜志)127 177-179 (2000))。在正常軟骨內(nèi)骨生長中，軟骨細(xì)胞組織成柱狀形式且在生長板增殖區(qū)中增殖。在軟骨發(fā)育不全患者中，此等柱變得紊亂。另外，在肥大區(qū)中，細(xì)胞變大且最終凋亡(裂解)，導(dǎo)致骨細(xì)胞侵入及礦化。軟骨發(fā)育不全患者中肥大軟骨細(xì)胞及該區(qū)的總體大小比正?；颊咝〉枚唷NP 為軟骨細(xì)胞及骨生長的正調(diào)節(jié)劑NPR-B的促效劑。CNP/NPR-B的下游信號(hào)傳導(dǎo)在有絲分裂原活化蛋白激酶(MAP K)層面上抑制FGFR-3路徑。在MAP K處的抑制可促進(jìn)生長板的增殖區(qū)及肥大區(qū)中軟骨細(xì)胞的增殖及分化，使得骨生長。在人類中，F(xiàn)GFR-3的活化突變?yōu)檫z傳性侏儒癥的主要原因。具有已活化FGFR-3的小鼠充當(dāng)軟骨發(fā)育不全(骨骼發(fā)育不良的最常見形式)的模型，且CNP的過度表達(dá)拯救此等動(dòng)物避免矮小。因此，CNP及CNP的功能變體為治療各種骨骼發(fā)育不良的潛在治療劑。CNP的治療用途目前受限于其短血漿半衰期，該半衰期在人類中活體內(nèi)顯示為 2. 6 分鐘(J Clin. Endocrinol. Metab.(臨床內(nèi)分泌代謝雜志)，78 :1似8_35 (1994))。為提高CNP濃度高于人類血漿中通常所見的固有含量(約5pM)，在使用全身性給予的CNP的所有人類及動(dòng)物研究中，必需連續(xù)輸注。相較于野生型CNP，具有較長活體內(nèi)血清半衰期且顯示類似或改良的活性的CNP變體對(duì)于可持續(xù)治療策略為重要的。人類血漿中縮短CNP半衰期的兩種機(jī)制為中性內(nèi)肽酶(NEP)造成的降解及利鈉肽受體C(NPR-C)造成的清除(GrowthHorm. &IGF Res.(生長激素和IGF研究)，16 :S6_S14 (2006))。據(jù)報(bào)導(dǎo)，對(duì)肽進(jìn)行修飾可增強(qiáng)對(duì)內(nèi)肽酶及外肽酶裂解的抗性(Amino Acids(氨基酸)，30 :351-367(2006) ；Curr. Opin. Biotech (生物技術(shù)目前觀點(diǎn)).，17 =638-642 (2006))。已評(píng)估CNP的多種類似物及衍生物的生物活性。據(jù)報(bào)導(dǎo)，通過以S-甲基Cys取代Cp6與Cys22,肽經(jīng)由Cys6-Cys22 二硫鍵的環(huán)化顯示對(duì)CNP刺激cGMP形成的活性重要 (Biochem. Biophys. Res. Comm.(生物化學(xué)生物物理研究通訊)，183 :964-969 (1992)，亦使用丙氨酸掃描以鑒別對(duì)CNP功能性重要的氨基酸)。據(jù)報(bào)導(dǎo)，活性的額外顯著增強(qiáng)是氨基酸 1^119、1^81(1及1^1111的組合存在引起的。美國專利第5，434，133號(hào)描述包含在氨基酸位置6、 7、9、11或22具有取代的CNP-22的CNP類似物，其中該氨基酸選自位置6的Cys或Pmp (五環(huán)巰基丙酸)，位置7的Phe、4-氯-Phe、4-氟-Phe、4_硝基-Phe或Cha (3_環(huán)己基-Ala)， 位置9的Gly、Val、Aib或tLeu，位置11的Leu或lie，及位置22的Cys或Pmp。美國專利公開案第2004/0138134號(hào)(現(xiàn)為美國專利7，276，481)描述包含CNP-22 的氨基酸Cys6至Cys22的CNP變體(“CNP-17”)，其包括位置9、10、11、16、17、19或20的另一天然氨基酸的至少一個(gè)取代；具有插入及缺失的CNP變體，諸如在Cp6與Wie7之間NEP 裂解的所報(bào)導(dǎo)主要位點(diǎn)添加His殘基；及使用此等變體來增大異常骨中骨生長板的尺寸及延長異常骨的方法。然而，如根據(jù)cGMP產(chǎn)生所量測(cè)，此等變體的活性未得到顯著增強(qiáng)，且如在基于活體外細(xì)胞的方法(實(shí)施例7)中所觀測(cè)，幾乎所有變體的活性均減弱。未提供其它支持性數(shù)據(jù)，諸如提供活體外穩(wěn)定性或活體內(nèi)測(cè)定改良的藥物動(dòng)力學(xué)(PK)來證實(shí)CNP類似物的所聲稱NEP抗性及NPR-C抗性。美國專利第6，743，425號(hào)揭示治療軟骨發(fā)育不全的物質(zhì)，其活化NPR-B/GC-B且為肽或低分子量化合物，包括C型利鈉肽CNP-22及CNP-53。PCT 公開案第WO 94/205 號(hào)揭示命名為血管鈉肽(vasonatrin peptide/VNP)的CNP-22與 ANP的5氨基酸C端的嵌合體，亦即有限數(shù)目的氨基酸取代及藉由形成二硫鍵或雙鍵產(chǎn)生的環(huán)狀嵌合肽。改良其它利鈉肽家族成員的半衰期的方法包括降低ANP對(duì)NPR-C的親和力(美國專利第5，846，932號(hào))、利用NPR-C的五肽拮抗劑(W0 00/6163)及共給予NEP抑制劑，諸如塞奧芬(thiorphan)與坎沙曲(candoxatril) (Clin. Exp. Pharma. Physiol. , 25 986-991 (1997)，Hyperten.，30 184-190 (1997))。WO 2004/047871 描述 BNP 及 BNP 變體與聚烷二醇部分、糖部分、聚山梨醇酯部分、聚陽離子部分及其它親水性聚合物部分的偶聯(lián)物，其據(jù)報(bào)導(dǎo)顯示獲改良的循環(huán)半衰期且據(jù)報(bào)導(dǎo)適用于治療急性充血性心臟衰竭。然而，尚無關(guān)于制造具有NEP抗性同時(shí)保留CNP功能性的CNP的成功策略的公開報(bào)導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本文涉及C型利鈉肽(CNP)的變體，其適用于治療骨相關(guān)病癥(例如軟骨發(fā)育不全)及血管平滑肌病癥。本公開包含血清半衰期增加(例如由于結(jié)合于中性內(nèi)肽酶(NEP) 的能力降低、對(duì)NEP的蛋白水解作用的抗性較高及/或?qū)η宄c肽受體C(NPR-C)的親和力降低)同時(shí)保留CNP功能性的CNP變體。下文闡述人類CNP-22的野生型序列(在本文中稱為” hCNP22，，、，，wtCNP22，， 或” CNP22”)
(N 端)Gly1-Leu2-Ser3-Lys4-Gly5-Cys6-Phe7-Gly8-Leu9-Lys10-Leu11-Asp12-Arg13-Il e14~Gly15-Ser 16-Met 17~Serlg-GlY19-Leu20-Gly21-CyS22 (SEQ ID NO :1)。CNP22的位置6至22藉助于Cys6與Cys22之間的二硫鍵形成環(huán)狀域。已顯示17 個(gè)氨基酸的環(huán)狀結(jié)構(gòu)對(duì)CNP結(jié)合于NPR-B重要GchiIler，Biochem. Biophys. Res. Commun.， (生物化學(xué)生物物理研究通訊)138 =880-886 (1986))。CNP22的位置6至22的氨基酸序列在本文中稱作” CNP17” (SEQ ID NO :2)。CNP 在許多位點(diǎn)易于被 NEP 裂解Cys6_Phe7、Gly8_Leu9、LyslO-LeulU Argl3-Ilel4、Serl6_Metl7及Glyl9_Leu20。在一實(shí)施例中，本公開包括一種CNP變體，其 (1)經(jīng)修飾以使其總體大小或分子量增至例如以下范圍約2. 6kDa或2. SkDa至約4kDa、 4. 2kDa>4. 4kDa>4. 6kDa>4. 8kDa>5kDa>5. 2kDa>5. 4kDa>5. 6kDa>5. 8kDa>6kDa>6. 2kDa>
6.4kDa或至約7kDa、7. 2kDa或約8. 2kDa，及/或( 在某些氨基酸位置經(jīng)修飾以降低其在
1、2、3、4、5或所有6個(gè)上列位點(diǎn)對(duì)NEP裂解的敏感性。CNP變體的大小或分子量可藉由多種方式增大，例如藉由將其它氨基酸及/或其它種類的化學(xué)(例如天然或合成聚合)基團(tuán)偶聯(lián)至肽序列的例如N端、C端及/或側(cè)鏈，及/或藉由使用天然氨基酸、非天然氨基酸及/或具有較龐大側(cè)鏈的肽模擬物。視情況進(jìn)一步使CNP變體偶聯(lián)偶聯(lián)至其它功能或結(jié)構(gòu)部分。 視情況與本文所述的任何實(shí)施例組合，可將突變(例如取代、添加及/或缺失)引入CNP22 的某一(某些)位置以降低CNP變體對(duì)NPR-C的親和力。在不影響NEP抗性或CNP活性的情況下，可進(jìn)行其它修飾，例如保守性取代，或在此項(xiàng)技術(shù)中已知的其它修飾。在一實(shí)施例中，CNP變體由以下通式表示(X)-Gly1-Leu2-Ser3-Lys4-Gly5-Cys6-Ph G7-Gly8-Leu9-Lys10-Leu11-Asp12-Arg13-Ile14-Gly15-Serl6-Met17-Serl8-Gly19-Leu20-Gly21-Cys2 2_(z) (SEQ ID NO :5)，其中在對(duì)應(yīng)于一或多個(gè)以下CNP殘基的位置Glyl、Lys4、Gly5、Cys6、Phe7、Gly8、 Leu9、LyslO、LeulU Ilel4、Glyl5、Serl6、Metl7、Glyl9、Leu20 及 Gly21, CNP 變體包含一或多個(gè)經(jīng)修飾的氨基酸，其可產(chǎn)生經(jīng)修飾的肽鍵(例如經(jīng)由使用肽鍵等構(gòu)物)；及(χ)及(ζ)獨(dú)立地可不存在或可為來源于利鈉多肽(例如NPPC、ANP、BNP)或非利鈉多肽(例如人類血清白蛋白(HSA)、IgG等)的氨基酸序列。在一實(shí)施例中，CNP變體包括(1)在對(duì)應(yīng)于CNP22的位置6、7或8 (Cys6、Phe7或 Gly8)的一的氨基酸位置處的修飾；(2)在位置1-5 (GlyU Leu2、Ser3、Lys4及Gly5)的任何或所有氨基酸的視情況存在的缺失、添加及/或取代；及C3)視情況至多1、2、3、4、5、6、
7、8、9或10個(gè)在對(duì)應(yīng)于位置6-22的位置處的其它修飾(缺失、添加及/或取代)，其中1、
2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)修飾可為保守性取代或本文所述或在此項(xiàng)技術(shù)中已知的其它取代。應(yīng)了解，以編號(hào)提及特定氨基酸位置(例如CNP22的位置7)指任何CNP變體中對(duì)應(yīng)的氨基酸位置，即使該CNP變體中的位置編號(hào)因前述插入或缺失而發(fā)生變化亦如此。舉例而言，對(duì)于前五個(gè)氨基酸已缺失的CNP變體，提及”位置7”或”Phe7”將指相應(yīng)位置2。類似地，對(duì)于一個(gè)氨基酸已添加至N端的CNP變體，提及”位置7”指對(duì)應(yīng)位置8。在本文所述的任何實(shí)施例中，CNP變體可通過對(duì)應(yīng)于CNP22的6與22位之間的共價(jià)鍵環(huán)化?？紤]使用此項(xiàng)技術(shù)中已知的任何方法形成共價(jià)鍵。在另一實(shí)施例中，CNP變體可經(jīng)由位于肽的N端或靠近N端的氨基酸與C端或靠近C端的氨基酸(出于此目的稱為，，末端”氨基酸)之間所形成的共價(jià)鍵來環(huán)化。在一實(shí)施例中，在兩個(gè)末端氨基酸的側(cè)鏈之間或?qū)?yīng)于CNP22的6與22的位置的氨基酸之間形成共價(jià)鍵。在另一實(shí)施例中，在一個(gè)末端氨基酸的側(cè)鏈與另一末端氨基酸的末端基團(tuán)之間，或在各末端氨基酸的末端基團(tuán)之間形成共價(jià)鍵。舉例而言，末端氨基酸之間或?qū)?yīng)于CNP22的6與22的位置的氨基酸之間所形成的共價(jià)鍵可能為頭至尾鍵、側(cè)鏈至側(cè)鏈鍵、側(cè)鏈至頭鍵或側(cè)鏈至尾鍵。在一實(shí)施例中，本文提供一種對(duì)NEP的親和力降低，及/或?qū)EP裂解的抗性較大及/或活體內(nèi)血清半衰期增加，同時(shí)保留CNP的功能性(例如刺激cGMP產(chǎn)生)的CNP變體。NEP由于其活性位點(diǎn)腔隙的尺寸有限而較佳識(shí)別小于約3kDa的底物(Oefner，J. Mol. Biol.(分子生物學(xué)雜志)，296 :341-349(2000)) ο在一實(shí)施例中，例如藉由添加約0. 6kDa 至約5kDa的氨基酸、親水性或水溶性聚合物、疏水性酸(包括脂肪酸)及/或碳水化合物來修飾CNP變體，以使其總分子量增至約2. 6kDa或2. 8kDa至約4,4. 6、5、5· 2,5. 8、6、6· 4 或7kDa的范圍。在特定例示性實(shí)施例中，CNP變體的分子量在約2. 6kDa與約7kDa之間， 或在約2. 8kDa與6kDa之間，或在約2. 8kDa與約5. 8kDa之間。在某些實(shí)施例中，添加至少約 0. 6、0· 8、1、1· 2、1· 4、1. 6 或 1. 8kDa，或至多 2、2· 2、2· 4、2· 6、2· 8、3、3· 2、3· 4、3· 6、3· 8、4、 4. 2,4. 4,4. 6,4. 8或5kDa，以使CNP變體的總分子量增至例如約2. 6或2. 8kDa至約4kDa、 4. 2kDa>4. 4kDa>4. 6kDa>4. 8kDa>5kDa>5. 2kDa>5. 4kDa>5. 6kDa>5. 8kDa>6kDa>6. 2kDa> 7. 2kDa、8. 2kDa或更高的范圍。在一些實(shí)施例中，此等CNP變體包含與CNP22的氨基酸6_22 至少約70%、75%、80%、85%、90%或95%相同或同源的氨基酸序列。在其它實(shí)施例中，此等CNP變體包含另一天然或非天然氨基酸或肽模擬物的1、2、3、4、5、6或7個(gè)氨基酸的取代、插入或缺失。盡管預(yù)想保守性取代與非保守性取代或插入均可在任何位置進(jìn)行，但可例如藉由保守性取代開始將修飾引入此項(xiàng)技術(shù)中已鑒定為與CNP活性或NPR-B結(jié)合有關(guān)的區(qū)域中，而非保守性取代可在先前已顯示容許修飾的那些區(qū)域中進(jìn)行。在另一實(shí)施例中，CNP變體包含在Cys6與Cys22之間具有完整環(huán)化部分，且具有含有約 1-40、1-20、5-40、5-35、10-35、15-35、5-31、10-31 或 15-31 個(gè)氨基酸且為來源于 CNP 多肽及/或非CNP多肽的片段的N端尾及/或C端尾的CNP。在一實(shí)施例中，此等CNP變體的分子量在約2. 8kDa至約4,4. 6、5、5· 2,5. 8、6、6· 4或7kDa的范圍內(nèi)。此等CNP變體的非限制性實(shí)施例包括野生型CNP22 ；或具有一或多個(gè)氨基酸取代(例如K4R取代)的CNP22， 其具有來源于以下的N端及/或C端延伸人類或其它物種的利鈉肽前體序列(例如ANP、 BNP或CNP)；具有氨基酸取代、添加及/或缺失的利鈉肽前體C(NPPC)變體(例如這些CNP 變體可為CNP-53的截短形式，其產(chǎn)生分子量在約2. SkDa與5. SkDa之間的肽)；或其它非 CNP多肽，諸如血清白蛋白或IgG蛋白(例如這些CNP變體可為含有人類或其它物種的血清白蛋白或IgG的片段的CNP嵌合體)。在一實(shí)施例中，總質(zhì)量特征在于本文一般描述的范圍(例如約2. 6kDa或2. SkDa 至約6kDa或7kDa)、經(jīng)設(shè)計(jì)以便增強(qiáng)對(duì)NEP降解的抗性的CNP變體由以下通式表示(χ) -Gly1-Leu2-Ser3- (b) 4 "Gly5-Cy S6-Phe7-Gl y8-Leu9- (h) 10-Leun-Asp12-Arg13-Ile H-Gly15-Ser16-Met17-Ser18-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22-(ζ) (SEQ ID NO :6)，其中(χ)為合成或天然聚合基團(tuán)，或其組合，其中合成聚合基團(tuán)的非限制性實(shí)例為聚乙二醇(PEG，亦稱為聚環(huán)氧乙烷(ΡΕ0))，且天然聚合基團(tuán)的非限制性實(shí)例為含有1至35個(gè)氨基酸且來源于以下的氨基酸序列NPPC或其具有取代及/或缺失的變體、ANP、BNP,或其它非CNP多肽或肽，諸如血清白蛋白、IgG、富含組氨酸的糖蛋白、纖連蛋白、纖維蛋白原、含鋅指多肽、骨織素(osteocrin)或成纖維細(xì)胞生長因子2 (FGF2)；(ζ)可不存在或可為合成或天然聚合基團(tuán)，或其組合，其中合成聚合基團(tuán)的非限制性實(shí)例為PEG，且天然聚合基團(tuán)的非限制性實(shí)例為來源于利鈉多肽(例如NPPC、CNP、ANP或 BNP)或非利鈉多肽(例如血清白蛋白或IgG)的氨基酸序列；且(b)及(h)可各自獨(dú)立地在該位置是野生型Lys，或可經(jīng)保守性氨基酸取代或經(jīng)側(cè)鏈上不具有反應(yīng)性伯胺的任何天然或非天然氨基酸或肽模擬物(包括(但不限于)Arg、 Gly、6-羥基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、6111、6111或％1·)置換。在一實(shí)施例中，(b)為Arg。 在另一實(shí)施例中，為了改良NEP抗性，(b)不為Gly。在又一實(shí)施例中，(h)不為Arg。來源于NPPC或其變體的氨基酸序列的非限制性實(shí)例包括Arg ；Glu-Arg ；Gly-Ala-Asn-Lys-Lys(SEQ ID NO 7)；Gly-Ala-Asn-Arg-Arg(SEQ ID NO 8)；Gly-Ala-Asn-Pro-Arg(SEQ ID NO 9)；Gly-Ala-Asn-Gln-Gln(SEQ ID NO: 10)；Gly-Ala-Asn-Ser-Ser(SEQ ID NO: 11)；Gly-Ala-Asn-Arg-Gln(SEQ ID NO: 12)；Gly-Ala-Asn-Arg-Met (SEQ ID N0:13)；Gly-Ala-Asn-Arg-Thr (SEQ ID N0:14)；Gly-Ala-Asn-Arg-Ser (SEQ ID N0:15)；Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala(SEQ ID NO 16)；Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg(SEQ ID NO 17)；Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg(SEQ ID NO 18)；Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys(SEQ ID NO 19)；Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Arg-Arg(SEQ ID NO 20)；Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-G Iu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys(SEQ ID NO 21)；及Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-G Iu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Arg-Arg(SEQ ID NO 22)。來源于非CNP多肽(諸如ANP、BNP、血清白蛋白及IgG)的氨基酸序列的非限制性實(shí)例包括Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser(SEQ ID NO 23)；Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr(SEQ ID NO 24)；Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO 25)；Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO 26)；Lys-Val-Leu-Arg-Arg-Tyr(SEQ ID NO 27)；
Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His(SEQ ID NO 28)；Gly-Gln-His-Lys-Asp-Asp-Asn-Pro-Asn-Leu-Pro-Arg(SEQ ID NO 29)；Gly-Val-Pro-Gln-Val-Ser-Thr-Ser-Thr(SEQ ID NO 30)；Gly-Glu-Arg-Ala-Phe-Lys-Ala-Trp-Ala-Val-Ala-Arg-Leu-Ser-Gln(SEQ ID N0:31)；及Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO :32)。在一實(shí)施例中，CNP22或其變體的N端及/或C端可獨(dú)立地偶聯(lián)偶聯(lián)于含有1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個(gè)氨基酸的氨基酸延伸。在一實(shí)施例中，氨基酸延伸來源于NPPC、CNP53、ANP或BNP。在一特定實(shí)施例中，氨基酸延伸為Gln-Glu-His-Pro-Asn-A Ia-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys (SEQ ID NO :33)。在一相關(guān)實(shí)施例中，將此 15 個(gè)氨基酸的延伸添加至N端以提供下式的CNP變體=Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys-Gly1-Leu2-Ser3- (b) 4~G1 y5-Cy S6-Phe7-Gl Y8-Leu9- (h) 10~Leu H-Asp12-Arg13-Ile14-Gly15-Serl6-Met17-Serl8-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22- (ζ) (SEQ ID NO :34)。在一實(shí)施例中，CNP變體包含N端及/或C端偶聯(lián)與親水性聚合物(例如PEG)偶聯(lián)以使其總體分子大小增至約2. 6kDa或2. 8kDa至約4、5、6或7kDa的范圍的wtCNP22或其變體(例如具有添加、缺失及/或取代(諸如K4R取代)的變體)(SEQ ID N0:35)。此等 CNP變體視情況在N端及/或C端進(jìn)一步偶聯(lián)偶聯(lián)于包含例如氨基酸、碳水化合物、疏水性酸及/或磷脂的聚合基團(tuán)，該聚合基團(tuán)的一非限制性實(shí)例為含有1至35個(gè)、或5至31個(gè)氨基酸的N端氨基酸延伸。在一實(shí)施例中，將至少約0. 4,0. 6,0. 8、1、1· 2,1. 4、1· 6或1. 8kDa 或至多 2,2. 2,2. 4,2. 6,2. 8、3、3· 2,3. 4,3. 6,3. 8、4、4· 2,4. 4,4. 6,4. 8 或 5kDa 的親水性聚合(例如PEG)部分添加至wtCNP22或其變體的N端及/或C端。如本文中所示，約0. 6kDa或更高的親水性或水溶性PEG(或ΡΕ0)聚合物偶聯(lián)偶聯(lián)于CNP22或其變體一般會(huì)顯著增強(qiáng)對(duì)NEP裂解的抗性。然而，將PEG(即使小至0. 6kDa) 添加至wtCNP22可能會(huì)降低CNP功能性(例如刺激cGMP信號(hào)傳導(dǎo))，且將大于約2kDa或 3kDa的PEG添加至CNP22或其變體可能會(huì)以尺寸依賴性方式降低CNP功能活性。但當(dāng)使約0. 6kDa至約1. 2kDa或可能達(dá)約2kDa的PEG (或ΡΕ0)聚合物偶聯(lián)與具有N端氨基酸延伸的CNP變體偶聯(lián)時(shí)，CNP功能性得以保留(至少與wtCNP22的功能性相當(dāng))，其中至少一個(gè)在生理?xiàng)l件下可能帶正電荷的相對(duì)較大氨基酸(例如精氨酸)緊接于對(duì)應(yīng)于CNP22的 Glyl 的位置之前，諸如 GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO :36)、GANPR_CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 37)、ER-CNP22 (SEQ ID NO :38)、ER-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO :39)、R-CNP22 (SEQ ID NO :40) 及 R-CNP22(K4R)(SEQ ID NO :41)。因此，在一實(shí)施例中，聚乙二醇化CNP變體在CNP22或其變體(例如具有K4R取代的變體)的N端包含含有至少1、2、3、4或5個(gè)氨基酸的氨基酸延伸，其中使PEG聚合物偶聯(lián)與經(jīng)氨基酸延伸的CNP變體的N端偶聯(lián)以產(chǎn)生特征在于本文一般描述的范圍(例如約 2. 6kDa或2. 8kDa至約6kDa或7kDa)以便增強(qiáng)對(duì)NEP裂解的抗性的總質(zhì)量。在一實(shí)施例中，為增強(qiáng)CNP的功能性，此等聚乙二醇化且經(jīng)氨基酸延伸的CNP變體含有至少一個(gè)緊接于對(duì)應(yīng)于CNP22的Glyl的位置之前的在生理?xiàng)l件下可能帶正電荷的相對(duì)較大的天然或非天然氨基酸。在一特定實(shí)施例中，聚乙二醇化且經(jīng)氨基酸延伸的CNP變體含有至少一個(gè)緊接于對(duì)應(yīng)于CNP22的Glyl位之間的精氨酸殘基。除在N端及/或C端偶聯(lián)偶聯(lián)親水性或水溶性聚合物(諸如PEG (或ΡΕ0))的CNP 變體外，本發(fā)明亦包括在內(nèi)部位點(diǎn)與這種偶聯(lián)聚合物偶聯(lián)的CNP變體。本文中為簡明起見， 將使用PEG(或ΡΕ0)作為親水性或水溶性聚合物的代表性實(shí)例。CNP變體可能在各種位點(diǎn)聚乙二醇化，包括(但不限于)(1)僅在N端聚乙二醇化；( 僅在C端聚乙二醇化；(3)僅在內(nèi)部位點(diǎn)(例如Lys4)聚乙二醇化；(4)在N端與C端皆聚乙二醇化；(5)在N端及內(nèi)部位點(diǎn)聚乙二醇化；及(6)在C端及內(nèi)部位點(diǎn)聚乙二醇化。為增強(qiáng)對(duì)NEP降解的抗性及保留 CNP功能性，在某些實(shí)施例中，聚乙二醇化CNP變體的總質(zhì)量的特征在于本文一般描述的范圍，例如在約2. 6kDa或2. 8kDa至約4、5、6或7kDa的范圍內(nèi)。在一特定實(shí)施例中，CNP17、 CNP22、CNP37 (下文定義)或其變體(包括具有氨基酸添加、取代及/或缺失的變體)僅在 N端聚乙二醇化。在另一實(shí)施例中，CNP變體僅在內(nèi)部位點(diǎn)(例如Lys4)聚乙二醇化。在另一實(shí)施例中，CNP變體在N端及內(nèi)部位點(diǎn)(例如Lys4)聚乙二醇化。在又一實(shí)施例中，為得到更佳功能性，CNP變體不在環(huán)狀域(對(duì)應(yīng)于CNP22的Cys6至Cys22)內(nèi)的位點(diǎn)(例如 LyslO)聚乙二醇化。為防止在內(nèi)部位點(diǎn)聚乙二醇化，可用在側(cè)鏈上不含反應(yīng)性伯氨基的天然或非天然氨基酸或肽模擬物(諸如Gly、kr、Arg、Asn、Gln、Asp、GlU或瓜氨酸(Cit))取代Lys4及/或LyslO。在一特定實(shí)施例中，Lys4及/或LyslO經(jīng)Arg置換。在另一實(shí)施例中，LyslO不經(jīng)Arg置換。本文包括使用可在以下方面不同的親水性或水溶性聚合物(例如PEG分子)類型(例如均聚物或共聚物；無規(guī)共聚物、交替共聚物或嵌段共聚物；線性或分支；單分散或多分散)、鍵聯(lián)(例如可水解鍵或穩(wěn)定鍵聯(lián)，諸如酰胺、亞胺、胺、伸烷基或酯鍵)、偶聯(lián)位點(diǎn) (例如在N端及/或C端，較佳不在CNP的環(huán)化區(qū)(對(duì)應(yīng)于CNP22的殘基6-22)中的任何殘基處)，及長度(例如約0. 2,0. 4或0. 6kDa至約2、3、4或5kDa)。親水性或水溶性聚合物可藉助于此項(xiàng)技術(shù)中已知的基于N-羥基丁二酰亞胺(NHS)或基于醛的化學(xué)或其它化學(xué)偶聯(lián)至CNP肽。此等CNP變體可使用以下產(chǎn)生例如wtCNP-22 (2. 2kDa)、僅保留wtCNP22 的環(huán)化區(qū)(殘基6-22)的CNP-17、在CNP22的N端及/或C端具有氨基酸延伸的CNP變體，或具有氨基酸取代、添加及/或缺失的變體，例如GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)、 GANPR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 37)、R-CNP22 (SEQ ID NO 40)、R-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 41)、ER-CNP22(SEQ ID NO :38)及 ER-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO :39)。在一實(shí)施例中，總質(zhì)量的特征在于本文一般描述的范圍(例如約2. 6kDa或2. 8kDa至約6或7kDa)的PEG-CNP變體含有經(jīng)由基于NHS或基于醛的化學(xué)偶聯(lián)偶聯(lián)于N端及/或C端的單分散性線性PEG (或 ΡΕ0)基團(tuán)，或經(jīng)由基于NHS的化學(xué)偶聯(lián)于N端及/或C端的兩臂或三臂分支PEG基團(tuán)。本文進(jìn)一步包括經(jīng)設(shè)計(jì)以降低腎清除率的帶負(fù)電PEG-CNP變體，包括(但不限于)羧酸化、硫酸化及磷酸化化合物。在一相關(guān)實(shí)施例中，本文包括PEG-CNP偶聯(lián)物，其包含基于NHS或基于醛的式 (CH2CH2O)n的PEG，其中η為12至50的整數(shù)，且PEG聚合物的分子量為至多約2. 5kDa。在一特定實(shí)施例中，η為12或M。在一實(shí)施例中，PEG聚合物的末端羥基經(jīng)非反應(yīng)性基團(tuán)封端。在一特定實(shí)施例中，封端基團(tuán)為烷基，例如低級(jí)烷基，諸如甲基。在另一實(shí)施例中，PEG聚合物或其衍生物具有約0. 4kDa至約2. 5kDa或約0. 6kDa 至約1.5kDa范圍內(nèi)的聚合物數(shù)目平均分子量。
在另一實(shí)施例中，使WtCNP或CNP變體肽偶聯(lián)至包括例如二磷酸鹽、碳水化合物、 疏水性酸(包括脂肪酸)或氨基酸序列的部分。此等氨基酸序列包括例如適用于靶向骨/ 軟骨的聚Asp或聚Glu，或可來源于具有已闡明骨靶向域的骨蛋白或其衍生物，諸如骨橋蛋白(osteopontin)、骨鈣化素(osteocalcin)、涎蛋白(sialoprotein)等的融合蛋白或肽序列。在本文所述的CNP22或其變體連接至骨或軟骨靶向部分的實(shí)施例中，這種部分設(shè)計(jì)成促進(jìn)經(jīng)修飾的CNP肽到達(dá)骨生長板的軟骨細(xì)胞，該肽可在此處結(jié)合并活化軟骨細(xì)胞上的 NPR-B0在另一實(shí)施例中，本文提供具有不太易于被肽酶(包括NEP)切割的肽鍵的CNP變體。本文包括在內(nèi)肽酶裂解位點(diǎn)包含至少一個(gè)經(jīng)修飾殘基的CNP變體。在一實(shí)施例中，CNP 中NEP裂解位點(diǎn)處的Cys6-Phe7肽鍵(-C ( = 0)_ΝΗ_)可經(jīng)任一以下肽鍵等構(gòu)物置換-CH2-NH-,-C( = 0)-N(R)-，其中酰氨基經(jīng)任何以下R基團(tuán)烷基化甲基、乙基、正丙基、異丙基、環(huán)丙基、正丁基、異丁基、仲丁基或叔丁基，-C( = 0)-NH-CH2-,-CH2-S-,-CH2-S(O)n-,其中 η 為 1 或 2，-CH2-CH2-,-CH = CH-，-C( = 0)-CH2-,-CH(CN) -NH-,-CH(OH) -CH2-,-0_C( = 0)-ΝΗ-，及-NHC ( = 0)ΝΗ-ο在另一實(shí)施例中，Phe7經(jīng)其對(duì)映異構(gòu)體D-Phe取代。在另一實(shí)施例中，將D-對(duì)映異構(gòu)體引入wtCNP-22內(nèi)的一或多個(gè)(至多所有22個(gè))位點(diǎn)。在另一實(shí)施例中，用β氨基酸(諸如3-氨基-2-苯基丙酸)取代Wie7，這在減小側(cè)鏈長度的同時(shí)增加主鏈長度。在另一實(shí)施例中，本文包括Cys6位置的Cys類似物，包括(但不限于)高半胱氨酸、青霉胺、 2-巰基丙酸及3-巰基丙酸。即使在Cys6與Wie7之間存在NEP抗性鍵，其它肽鍵(包括Gly8_Leu9、 LyslO-Leull、Argl3-Ilel4、Serl6-Metl7 及 Glyl9_Leu20)亦可能會(huì)被 NEP 水解。因此，本文包括在CNP類似物主鏈中多個(gè)位置處含有肽鍵等構(gòu)物的CNP類似物。在一實(shí)施例中，CNP 類似物或變體在一個(gè)以上肽酶裂解位點(diǎn)處包含修飾。在另一實(shí)施例中，此變體包含在結(jié)合于NEP活性位點(diǎn)中重要的氨基酸殘基處具有取代從而增強(qiáng)對(duì)NEP降解的抗性的CNP。一或多個(gè)NEP結(jié)合殘基(包括(但不限于)6178、61715、^^18、61719及/或61721)經(jīng)較大尺寸的天然或非天然氨基酸殘基置換以降低對(duì)NEP活性位點(diǎn)的親和力。在另一實(shí)施例中，NEP 識(shí)別所必需的一或多個(gè)疏水性殘基(包括(但不限于)？&7、1^119、1^1111、11614^討17及 Leu20)被降低NEP結(jié)合的天然或非天然氨基酸及/或肽模擬物取代。在另一實(shí)施例中，CNP 的前五個(gè)氨基酸中的一至五個(gè)可缺失或經(jīng)任何其它天然氨基酸或非天然氨基酸或肽模擬物取代，或可將一或多個(gè)天然或非天然氨基酸或肽模擬物添加至CNP的前五個(gè)位置中的任一位置或所有位置。在另一實(shí)施例中，CNP變體具有特征在于本文一般描述的范圍(例如約2. 6kDa或 2. 8kDa至約6kDa或7kDa)的總質(zhì)量，且由下式表示(χ) -Gly1-Leu2-Ser3- (a) 4_Gly5_ (b) 6_ (c) 7_ (d) 8_ (e) 9_ (f) 10- (g) n_Asp12-Arg13- (h) 14-Gly15-kr164i)17-kr18-Gly19-(j)2。-Gly21-Cys22-(Z) (SEQ ID NO :46)，其中(χ)可不存在，或可選自由以下組成的群合成骨靶向化合物，諸如二磷酸鹽；適用于靶向骨或軟骨的氨基酸序列，諸如聚Asp及聚Glu ；來源于具有已闡明骨靶向域的骨蛋白(諸如骨橋蛋白、骨鈣化素、涎蛋白等的融合蛋白或肽序列)的氨基酸序列；降低腎清除率的聚合或非聚合分子，諸如帶電PEG分子；及延伸，包含例如聚合物(例如PEG)、碳水化合物、疏水性酸(包括脂肪酸)及/或氨基酸，且其中此等氨基酸延伸可含有例如1至31 個(gè)，或1至35個(gè)，或5至35個(gè)，或10至35個(gè)，或15至35個(gè)氨基酸殘基，且可來源于NPPC、 ANP、BNP、其它非CNP多肽或肽(諸如血清白蛋白或IgG)，或具有取代、添加及/或缺失的上述多肽的變體，或其組合；(ζ)可不存在，或可選自由以下組成的群適用于靶向骨或軟骨的氨基酸序列，諸如聚Asp及聚Glu;來自骨蛋白(諸如骨橋蛋白、骨鈣化素及涎蛋白)的骨靶向域的氨基酸序列；及來源于非CNP多肽或肽(諸如ANP或BNP)的氨基酸序列；(a)可為該位置的野生型Lys，或可經(jīng)保守性氨基酸取代或在側(cè)鏈上不具有反應(yīng)性伯胺的天然或非天然氨基酸或肽模擬物(包括(但不限于)Arg、Gly、6-羥基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gin、Ser或Glu)置換，其中在一實(shí)施例中，(a)為Arg ；(b)選自由Cys、及Cys6與Phe7之間的Cys和肽鍵等構(gòu)物(諸如Cys-CH2-NH)組成的群；(c)選自L_Phe ；D-Phe ；3_氨基_2_苯基丙酸；Phe的N-烷基化衍生物，其中N-烷基為甲基、乙基、正丙基、異丙基、環(huán)丙基、正丁基、異丁基、仲丁基或叔丁基；及Phe類似物， 其中Phe類似物的苯環(huán)的一或多個(gè)鄰位、間位及/或?qū)ξ唤?jīng)一或多個(gè)選自由以下組成的群的取代基取代商素、羥基、氰基、直鏈或支鏈Cp6烷基、直鏈或支鏈CV6烷氧基、直鏈或支鏈鹵基-Cp6烷基、C3_10環(huán)烷基、雜環(huán)基、C6_14芳基及雜芳基(實(shí)例包括(但不限于)酪氨酸、 3-氯苯丙氨酸、2，3-氯-苯丙氨酸、3-氯-5-氟-苯丙氨酸、2-氯-6-氟-3-甲基-苯丙氨酸)，或其中Phe類似物的苯環(huán)可經(jīng)另一芳基(非限制性實(shí)例包括1-萘基丙氨酸及2-萘基丙氨酸)或雜芳基(非限制性實(shí)例包括吡啶基丙氨酸、噻吩基丙氨酸及呋喃基丙氨酸) 置換；(d)選自Gly、叔丁基-Gly (tBu-Gly)、Thr、Ser、Val 及 Asn ；(e)選自Leu、Ser, Thr 及肽鍵等構(gòu)物，諸如 N-Me-Leu ；(f)可為該位置的野生型Lys，或可經(jīng)保守性氨基酸取代或在側(cè)鏈上不具有反應(yīng)性伯胺的天然或非天然氨基酸或肽模擬物(包括(但不限于)Arg、Gly、6-羥基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gin、Ser或Glu)置換，其中在一實(shí)施例中，(f)不為Arg ；(g)選自Leu及肽鍵等構(gòu)物，諸如N-Me-Leu ；(h)選自Ile、tBu-Gly、及肽鍵等構(gòu)物，諸如 N-Me-Ile ；⑴選自僅討、￥￡11、六卯、3-(141￡1、2-氨基丁酸(Abu)及2-氨基-異丁酸(Aib)； 且
(j)選自Leu、正亮氨酸(Nle)、高亮氨酸(homoleucine) (Hleu)、Val、叔丁 基-Ala(tBu-Ala)、Ser, Thr、Arg、及肽鍵等構(gòu)物，諸如 N-Me-Leu。在一實(shí)施例中，CNP變體在位置 6、7、8、9、10、11、13、14、16、17、19 及 / 或 20 中一
或多個(gè)位置處包含修飾，且可視情況在本文所揭示的任何其它位置處具有修飾。在本文所述的CNP22或其變體可連接至疏水性酸的實(shí)施例中，CNP肽可連接至一或多個(gè)疏水性酸。疏水性酸的非限制性實(shí)例包括直鏈或支鏈、飽和或不飽和C5-C12羧酸(例如戊酸、庚酸等)及天然脂肪酸。疏水性酸可連接至一或多個(gè)氨基酸殘基的N端、C端及/ 或側(cè)鏈。在一實(shí)施例中，疏水性酸偶聯(lián)至N端。在一實(shí)施例中，CNP22或其變體與疏水性酸的偶聯(lián)經(jīng)過特別設(shè)計(jì)，以促進(jìn)經(jīng)修飾CNP肽與血清白蛋白之間的非特異性相互作用，藉此增大CNP肽的尺寸并保護(hù)其避免被蛋白酶(諸如NEP)切割。與疏水性酸偶聯(lián)的CNP肽與白蛋白之間的相互作用的設(shè)計(jì)不能太強(qiáng)，以使經(jīng)修飾CNP肽可擴(kuò)散穿過軟骨，到達(dá)骨生長板的軟骨細(xì)胞，且結(jié)合及活化NPR-B。在另一實(shí)施例中，本文提供CNP變體，其在活體外或活體內(nèi)刺激產(chǎn)生cGMP，其產(chǎn)量為相同濃度wtCNP22(例如ΙμΜ)下的cGMP產(chǎn)量的至少約50 % ,60 % ,70 % ,80 % ,90 % , 100%,110%,120%,130%,140%^ 150%，在位置(b)6、(。)7及/或(山8包含至少一個(gè)經(jīng)修飾氨基酸，且由以下通式表示(χ) -Gly1-Leu2-Ser3- (a) 4_Gly5- (b) 6_ (c)廠(d) 8_ (e) 9_ (f) 10_ (g) n-Asp12-Ai^13- (h) 14-Gly15-kr164i)17-kr18-Gly19-(j)2。-Gly21-Cys22-(Z) (SEQ ID NO :47)，其中(χ)可不存在，或可為含有1至5個(gè)氨基酸且來源于如本文所述的利鈉多肽(例如 NPPC、CNP, ANP或BNP)或非利鈉多肽(例如HSA、IgG、骨靶向蛋白等)的肽序列；(ζ)可不存在，或可選自由以下組成的群合成骨靶向化合物，諸如二磷酸鹽；適用于靶向骨/軟骨的氨基酸序列，諸如聚Asp及聚Glu ；具有骨靶向域的骨蛋白及其衍生物，諸如骨橋蛋白、骨鈣化素及涎蛋白的融合蛋白或肽序列；降低腎清除率的分子，諸如帶電PEG ；及如本文所述增強(qiáng)CNP對(duì)NEP介導(dǎo)降解的抗性的分子；(a)可為該位置的野生型Lys，或可經(jīng)保守性氨基酸取代或在側(cè)鏈上不具有反應(yīng)性伯胺的天然或非天然氨基酸或肽模擬物(包括(但不限于)Arg、Gly、6-羥基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gin、Ser或Glu)置換，其中在一實(shí)施例中，(a)為Arg ；(b)可為Cys或去羧基半胱氨酸，或(b)6_(c)7肽鍵(_C( = 0)_NH_)可經(jīng)任一以下肽鍵等構(gòu)物置換-CH2-NH-,-C( = O)-N(R)-，其中酰氨基經(jīng)任何以下R基團(tuán)烷基化甲基、乙基、正丙基、異丙基、環(huán)丙基、正丁基、異丁基、仲丁基或叔丁基，-C( = 0)-NH-CH2-,-CH2-S-,-CH2-S(0)n-，其中 η 為 1 或 2，-CH2-CH2-,-CH = CH-,-C( = 0)-CH2-,-CH(CN) -NH-,
-CH(OH) -CH2-,-0_C( = 0)-ΝΗ-，或-NHC ( = 0) NH-;(c)選自L_Phe ；D-Phe ；3-氨基_2_苯基丙酸；Phe的肽鍵等構(gòu)物，諸如Phe的 N-烷基化衍生物，其中N-烷基系選自由甲基、乙基、正丙基、異丙基、環(huán)丙基、正丁基、異丁基、仲丁基及叔丁基組成的群；及Phe類似物，其中Phe類似物的苯環(huán)的一或多個(gè)鄰位、間位及/或?qū)ξ唤?jīng)一或多個(gè)選自由以下組成的群的取代基取代鹵素、羥基、氰基、直鏈或支鏈C^6烷基、直鏈或支鏈CV6烷氧基、直鏈或支鏈鹵基-Cp6烷基、C3,環(huán)烷基、C6_14芳基、 雜環(huán)基及雜芳基(實(shí)例包括(但不限于)酪氨酸、3-氯苯丙氨酸、2，3_氯-苯丙氨酸、 3-氯-5-氟-苯丙氨酸、2-氯-6-氟-3-甲基-苯丙氨酸)，或其中Phe類似物的苯環(huán)可經(jīng)另一芳基(非限制性實(shí)例包括1-萘基丙氨酸及2-萘基丙氨酸)或雜芳基(非限制性實(shí)例包括吡啶基丙氨酸、噻吩基丙氨酸及呋喃基丙氨酸)置換；(d)選自Gly、i^TS-Gly(tBu-Gly)、Val、kr、Thr&Asn ；(e)選自Leu、kr、Thr、及肽鍵等構(gòu)物，諸如 N-Me-Leu ；(f)為側(cè)鏈上不具有反應(yīng)性伯氨基的任何天然或非天然氨基酸或肽模擬物，包括 (但不限于)Arg、Gly、6-羥基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gin、Ser或Glu，其中在一實(shí)施例中，(f)不為Arg;(g)選自Leu及肽鍵等構(gòu)物，諸如N-Me-Leu ；(h)選自Ile、tBu-Gly 及肽鍵等構(gòu)物，諸如 N-Me-Ile ；⑴選自僅討、￥￡11、六卯、3-(141￡1、2-氨基丁酸(Abu)及2-氨基-異丁酸(Aib)； 且(j)選自Leu、正亮氨酸(Nle)、高亮氨酸(Hleu)、Val、叔丁基-Ala (tBu-Ala)、 Ser, Thr、Arg、及肽鍵等構(gòu)物，諸如N-Me-Leu。在另一實(shí)施例中，本文包括CNP變體，其在活體外或活體內(nèi)刺激產(chǎn)生在相同濃度 wtCNP22(例如 ΙμΜ)下所產(chǎn)生的 cGMP 量的至少約 50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、100 %、 110 %、120 %、130 %、140 %或150 %，具有特征在于本文一般描述的范圍(例如約2. 6kDa或 2. SkDa至約6kDa或7kDa)的總質(zhì)量以增強(qiáng)對(duì)NEP降解的抗性，且由以下通式表示 (χ) - (y) -Cys6-Phe7-Gly8-Leu9- (h) 10-Leun-Asp12-Ai^13-I Ie14-Gly15-Ser16-Met17-S er18-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22-(z) (SEQ ID NO :48)，其中(χ)為合成或天然聚合基團(tuán)，或其組合，其中合成聚合基團(tuán)的非限制性實(shí)例為聚乙二醇(PEG)，且天然聚合基團(tuán)的非限制性實(shí)例為含有1至35個(gè)氨基酸且來源于以下的氨基酸序列NPPC或其具有取代及/或缺失的變體、ANP、BNP，或其它非CNP多肽或肽，諸如血清白蛋白、IgG、富含組氨酸的糖蛋白、纖連蛋白、纖維蛋白原、含鋅指多肽、骨織素或FGF2;(y)可不存在，或可為一或多個(gè)來自Gly1-Leu2-Ser3-Lys4-Gly5 (對(duì)應(yīng)于CNP22的位置1至幻(SEQ ID NO 1)的氨基酸及/或在一或多個(gè)這些位置使用天然或非天然氨基酸的取代(例如K4R取代)；(h)可為該位置的野生型Lys，或可經(jīng)保守性氨基酸取代或在側(cè)鏈上不具有反應(yīng)性伯胺的天然或非天然氨基酸或肽模擬物(包括(但不限于)Arg、Gly、6-羥基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gin、Ser或Glu)置換，其中在一實(shí)施例中，(h)不為Arg ；且
(z)可不存在，或可為合成或天然聚合基團(tuán)，或其組合，其中合成聚合基團(tuán)的非限制性實(shí)例為PEG，且天然聚合基團(tuán)的非限制性實(shí)例為來源于利鈉多肽(例如NPPC、CNP、ANP 或BNP)或非利鈉多肽(例如血清白蛋白或IgG)的氨基酸序列。在一實(shí)施例中，(x)、(y)與(ζ)總共含有約10至約40個(gè)，或約15至約35個(gè)氨基酸。在另一實(shí)施例中，(X)為包含1至40個(gè)氨基酸或1至20個(gè)氨基酸的氨基酸序列。還包括在活體外或活體內(nèi)刺激產(chǎn)生在相同濃度wtCNP22 (例如1 μ Μ)下所產(chǎn)生的 cGMP 量的至少約 50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%或 150% 且包含以下序列的CNP變體(y) -Cys6-Phe7-Gly8-Leu9-Lys10-Leu11-Asp12-Arg13-Ile14-Gly15-Serl6-Met17-Serl8-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22 (SEQ ID NO :138)，其中(y)包含一或多個(gè)選自 Gly1-Leu2-Ser3-Lys4-Gly5 (SEQ ID NO 1)的氨基酸及 / 或在一或多個(gè)該位置使用天然或非天然氨基酸的取代(例如K4R取代)，且進(jìn)一步包含分子量為約0. 6kDa至約5kDa的親水性或水溶性聚合物。在一實(shí)施例中，親水性或水溶性聚合物偶聯(lián)至此經(jīng)氨基酸延伸的CNP變體的N端。在另一實(shí)施例中，親水性或水溶性聚合物為 PEG (或 ΡΕ0)。在另一實(shí)施例中，本文提供在活體外或活體內(nèi)刺激產(chǎn)生在相同濃度wtCNP22(例如 ΙμΜ)下所產(chǎn)生的 cGMP 量的至少約 50%,60%,70%,80%,90%UOO%U10%,120%, 130%、140%或150%的CNP變體，其中這些CNP變體包含含有1至15個(gè)氨基酸的N端及/ 或C端肽延伸，且偶聯(lián)至親水性或水溶性聚合物。在一實(shí)施例中，肽延伸含有5至10個(gè)氨基酸。在一特定實(shí)施例中，肽延伸含有5個(gè)氨基酸。在另一特定實(shí)施例中，親水性或水溶性聚合物為PEG (或ΡΕ0)。在另一實(shí)施例中，本文的CNP變體在活體外或活體內(nèi)外刺激產(chǎn)生在相同濃度 wtCNP22 (例如 1 μ Μ)下所產(chǎn)生的 cGMP 量的至少約 50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、100 %、 110 %、120 %、130 %、140 %或150 %，且包含至少一個(gè)來源于利鈉肽前體C (NPPC)的15個(gè)氨基酸的片段，其中該片段與含有相同數(shù)目氨基酸殘基的野生型NPPC的序列至少70%同源。在又一實(shí)施例中，CNP變體具有特征在于本文一般描述的范圍(例如約2. 6kDa或 2. 8kDa至約6kDa或7kDa)的總質(zhì)量以便增強(qiáng)NEP抗性，且由下式表示(χ) - (b) 6- (c) 7- (d) 8- (e) 9_ (f) 10- (g) n-Asp12-Arg13- (h) 14-Gly15-Ser16- (i) 17_Ser18-Glyi9-(J)20-Gly21-Cys22-(Z) (SEQ ID NO :4 ，其中(χ)可不存在(亦即，以-NH2基團(tuán)為N末端)，或可選自由以下組成的群來自肽 Gly1-Leu2-Ser3-Lys4-Gly5(SEQ ID NO :1)的1、2、3、4或5個(gè)氨基酸的序列；適用于靶向骨 /軟骨的氨基酸序列，諸如聚Asp或聚Glu ；來自骨蛋白(諸如骨橋蛋白、骨鈣化素或涎蛋白)的骨靶向域；降低腎清除率的分子，諸如親水性或水溶性聚合物，包括(但不限于)帶電PEG分子；及包含PEG、碳水化合物、疏水性酸、氨基酸或其組合的部分，其中此等部分可為氨基酸延伸，包括(但不限于)來源于NPPC或非CNP多肽或肽(諸如BNP、ANP、血清白蛋白或IgG)的氨基酸序列；(ζ)可不存在，或可選自由以下組成的群適用于靶向骨/軟骨的氨基酸序列，諸如聚Asp或聚Glu ；來源于骨靶向蛋白(諸如骨橋蛋白、骨鈣化素或涎蛋白)的氨基酸序列； 及來源于如本文所述的NPPC或非CNP多肽或肽的氨基酸序列；
(b)選自Cys、及Cys6與Phe7之間的肽鍵等構(gòu)物，諸如Cys-CH2-NH ；(c)選自=L-Phe ；D-Phe ；3_氨基_2_苯基丙酸；Phe的N-烷基化衍生物，其中N-烷基為甲基、乙基、正丙基、異丙基、環(huán)丙基、正丁基、異丁基、仲丁基或叔丁基；及Phe類似物， 其中Phe類似物的苯環(huán)的一或多個(gè)鄰位、間位及/或?qū)ξ唤?jīng)一或多個(gè)選自由以下組成的群的取代基取代商素、羥基、氰基、直鏈或支鏈Cp6烷基、直鏈或支鏈CV6烷氧基、直鏈或支鏈鹵基-Cp6烷基、C3_10環(huán)烷基、C6_14芳基、雜環(huán)基及雜芳基(實(shí)例包括(但不限于)酪氨酸、 3-氯苯丙氨酸、2，3-氯-苯丙氨酸、3-氯-5-氟-苯丙氨酸、2-氯-6-氟-3-甲基-苯丙氨酸)，或其中Phe類似物的苯環(huán)可經(jīng)另一芳基(非限制性實(shí)例包括1-萘基丙氨酸及2-萘基丙氨酸)或雜芳基(非限制性實(shí)例包括吡啶基丙氨酸、噻吩基丙氨酸及呋喃基丙氨酸) 置換；(d)選自Gly、i^TS-Gly(tBu-Gly)、Val、kr、Thr&Asn ；(e)選自Leu、kr、Thr、及肽鍵等構(gòu)物，諸如 N-Me-Leu ；(f)可為該位置的野生型Lys，或可經(jīng)保守性氨基酸取代或在側(cè)鏈上不具有反應(yīng)性伯胺的天然或非天然氨基酸或肽模擬物(包括(但不限于)Arg、Gly、6-羥基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gin、Ser或Glu)置換，其中在一實(shí)施例中，(f)不為Arg ；(g)選自Leu及肽鍵等構(gòu)物，諸如N-Me-Leu ；(h)選自Ile、tBu-Gly 及肽鍵等構(gòu)物，諸如 N-Me-Ile ；⑴選自僅討、￥￡114卯、3-(141￡1、2-氨基丁酸(Abu)及2-氨基-異丁酸(Aib)； 且(j)選自Leu、正亮氨酸(Nle)、高亮氨酸(Hleu)、Val、叔丁基-Ala (tBu-Ala)、 Ser, Thr、Arg、及肽鍵等構(gòu)物，諸如N-Me-Leu。在另一實(shí)施例中，CNP變體具有特征在于本文一般描述的范圍(例如約2. 6kDa或 2. 8kDa至約6kDa或7kDa)的總質(zhì)量以便增強(qiáng)NEP抗性，且其由下式表示；(χ) -Gly1-Leu2-Ser3- (a) 4_Gly5_ (b) 6_ (c) 7_ (d) 8_ (e) 9_ (f) 10_ (g) n-Asp12_Arg13- (h) 14-(i) 15-Ser16-(j) 17-Ser18-Gly19-(k)20-Gly21-Cys22-(z) (SEQ ID NO :50)，其中(x)及(ζ)獨(dú)立地可不存在，或可選自由以下組成的群合成骨靶向化合物，諸如二磷酸鹽；適用于靶向骨/軟骨的氨基酸序列，諸如聚Asp或聚Glu ；來源于骨蛋白及其衍生物(諸如骨橋蛋白、骨鈣化素、涎蛋白等的融合蛋白或肽序列)的骨靶向域的氨基酸序列；降低腎清除率的部分，包括(但不限于)親水性或水溶性聚合物，諸如帶電PEG分子；及包含例如親水性聚合物(例如PEG)、碳水化合物、疏水性酸及/或氨基酸的部分；(a)可為該位置的野生型Lys，或可經(jīng)保守性氨基酸取代或在側(cè)鏈上不具有反應(yīng)性伯胺的天然或非天然氨基酸或肽模擬物(包括(但不限于)Arg、Gly、6-羥基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gin、Ser或Glu)置換，其中在一實(shí)施例中，(a)為Arg ；(b)選自Cys、及Cys6與Phe7之間的肽鍵等構(gòu)物，諸如Cys-CH2-NH ；(c)選自L_Phe ；D-Phe ；3_氨基_2_苯基丙酸；Phe的N-烷基化衍生物，其中N-烷基為甲基、乙基、正丙基、異丙基、環(huán)丙基、正丁基、異丁基、仲丁基或叔丁基；及Phe類似物， 其中Phe類似物的苯環(huán)的一或多個(gè)鄰位、間位及/或?qū)ξ唤?jīng)一或多個(gè)選自由以下組成的群的取代基取代商素、羥基、氰基、直鏈或支鏈Cp6烷基、直鏈或支鏈CV6烷氧基、直鏈或支鏈鹵基-Cp6烷基、C3_10環(huán)烷基、C6_14芳基、雜環(huán)基及雜芳基(實(shí)例包括(但不限于)酪氨酸、
263-氯苯丙氨酸、2，3-氯-苯丙氨酸、3-氯-5-氟-苯丙氨酸、2-氯-6-氟-3-甲基-苯丙氨酸)，或其中Phe類似物的苯環(huán)可經(jīng)另一芳基(非限制性實(shí)例包括1-萘基丙氨酸及2-萘基丙氨酸)或雜芳基(非限制性實(shí)例包括吡啶基丙氨酸、噻吩基丙氨酸及呋喃基丙氨酸) 置換；(d)選自:Gly、叔丁基-Gly、Thr、kr、Val 及 Asn ；(e)選自Leu、Ser、Thr 及肽鍵等構(gòu)物，諸如 N-Me-Leu ；(f)可為該位置的野生型Lys，或可經(jīng)保守性氨基酸取代或在側(cè)鏈上不具有反應(yīng)性伯胺的天然或非天然氨基酸或肽模擬物(包括(但不限于)Arg、Gly、6-羥基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gin、Ser或Glu)置換，其中在一實(shí)施例中，(f)不為Arg ；(g)選自Leu、Asn及肽鍵等構(gòu)物，諸如N-Me-Leu ；(h)選自Ile、叔丁基-Gly (tBu-Gly)、Asn 及肽鍵等構(gòu)物，諸如 N-Me-Ile ；(i)選自Gly、Arg, Ser 及 Asn ；(j)選自僅討、￥￡11、六卯、3-(141￡1、2-氨基丁酸(Abu)及 2-氨基-異丁酸(Aib)； 且(k)選自Leu、正亮氨酸(Nle)、高亮氨酸(Hleu)、Val、叔丁基-Ala (tBu-Ala)、 Arg、Thr, Ser及肽鍵等構(gòu)物，諸如N-Me-Leu。在另一實(shí)施例中，CNP變體可在CNP22的位置1至22中任何一或多個(gè)位置具有氨基酸取代。在一實(shí)施例中，Glyl經(jīng)Arg或Glu取代。在另一實(shí)施例中，Lys4經(jīng)Arg置換。 在又一實(shí)施例中，Gly5經(jīng)Arg、Gln或Ser取代。在另一實(shí)施例中，Glyl5經(jīng)kr、Asn、Arg 或Cit取代。在另一實(shí)施例中，61719經(jīng)^^3印或Asn取代。在另一實(shí)施例中，Gly21經(jīng) kr、Ilir 或 Arg 取代。在一實(shí)施例中，CNP變體選自GLSKGC (CH2NH) FGLKLDRIGSMSGLGC (使用去羧基-Cys 形成)(SEQ ID NO 56)、GLSKGC-(N-Me-Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 57)、GLSKGC-(D-Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO : 136)、GLSKGCF-(tBuG)-LKLDRIG SMSGLGC(SEQ ID NO :58)、GLSKGC-(3_Cl_Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO :137)及 GLSKGC-[NHCH2CH (Ph) CO]-GLKLDRIGSMSGLGC (使用 3-氨基-2-苯基丙酸形成)(SEQ ID NO: 59)。在另一實(shí)施例中，在本文所述任何CNP變體中Cys6、Cys6位置處的去羧基-Cys或另一含巰基半胱氨酸類似物與Cys22之間存在二硫鍵。在另一實(shí)施例中，CNP變體在CNP22或CNP17的N端及/或C端含有氨基酸延伸， 包括(但不限于)DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-53)(SEQ ID NO 4)；QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37，類似物 BL) (SEQ ID NO 60)；AAWARLLQEHPNAGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CA) (SEQ ID NO 61)；AAWARLLQEHPNARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CB) (SEQ ID NO 62)；DLRVDTKSRAAWARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CC) (SEQ ID NO 63)；RGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO 40)；ERGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO 38)；GANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO 64)；
GANRRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO 65)；GANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO 66)；GANSSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO 67)；GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO :144)(在實(shí)例及圖中有時(shí)稱作” CNP27-HSA” 或” HSA-CNP27”)；SPKMVQGSG-CNP17_KVLRRH(類似物 CD) (SEQ ID NO 68)(具有來源于 BNP 的 N 端及C端尾的CNP17)。在另一實(shí)施例中，CNP變體在CNP22的位置4處具有K4R取代。CNP(K4R)變體的非限制性實(shí)例包括GANRRGLSEGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 AY) (SEQ ID NO 36)；GANPRGLSEGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物 Cl) (SEQ ID NO 37)；RGLSEGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 AZ) (SEQ ID NO 41)；ERGLSEGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 BA) (SEQ ID NO 39)；GANQQGLSEGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CH) (SEQ ID NO 69)；及GANSSGLSEGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CG) (SEQ ID NO 70)。在一實(shí)施例中，具有PEG (或ΡΕ0)部分及N端氨基酸延伸的CNP變體在緊接于對(duì)應(yīng)于CNP22的Glyl位前的位置含有精氨酸。此等聚乙二醇化CNP變體經(jīng)設(shè)計(jì)為增強(qiáng)對(duì)NEP降解的抗性、降低與血清白蛋白的結(jié)合且增強(qiáng)CNP功能活性(例如活化cGMP信號(hào)傳導(dǎo))。聚乙二醇化CNP變體的非限制性實(shí)例包括 PE024-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO :36)、PE012-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) , PE024-GANRR-CNP22 (SEQ ID NO :65)、PE012-GANRR-CNP22 (SEQ ID NO :65)、 PE024-GANPR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO :37)、PEOl2-GANPR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO :37)、PE024-GANPR-CNP22(SEQ ID NO :37)、PE012-GANPR-CNP22(SEQ ID NO: 66)、PE024-GANQQ-CNP22(SEQ ID NO :64)、PE012-GANQQ-CNP22 (SEQ ID NO :64)、 PE024-ER-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO :39)、PE012-ER-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO :39)、 PE024-ER-CNP22 (SEQ ID NO :38)、PE012-ER-CNP22 (SEQ ID NO :38)、PE024-R-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 41)、PE012_R_CNP22(K4R)(SEQ ID NO :41)、PE024_R_CNP22(SEQ ID NO :40)及 PE012-R-CNP22 (SEQ ID NO :40)，其中 PE024 為單分散性 1. 2kDa PEG 聚合物且 PEO12 為單分散性0. 6kDa PEG聚合物。在一實(shí)施例中，PEG (或ΡΕ0)聚合物連接至CNP變體的N端。其它CNP變體包括(但不限于)CNP37的衍生物，這些衍生物在弗林蛋白酶裂解位點(diǎn)(加下劃線)具有突變，旨在提高對(duì)弗林蛋白酶的活體內(nèi)抗性，及/或在谷氨酰胺之前具有甘氨酸(加下劃線)，旨在防止形成焦谷酰胺(pyroglutamine)，這些衍生物包括(但不限于)GQEHPNARIWKGAN￡EGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物⑶)(SEQ ID NO 71) ；GQEHP NARKIGANQKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物 CT) (SEQ ID NO 72) ；GQEHPNARKYKGANQQGLS KGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CU) (SEQ ID NO 73) ；GQEHPNARKYKGANKPGLSKGCFGLKLDRIGS MSGLGC (類似物 CW) (SEQ ID NO 74) ；GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Gly-CN P37，類似物DB) (SEQ ID NO 75) ；PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-Gly-C NP37)(SEQ ID NO :145)。
在另一實(shí)施例中，CNP變體為包含CNP22及N端肽片段的嵌合體，其包括(但不限于)GHHSHEQHPHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物 CQ)(富含組氨酸的糖蛋白 (HRGP)片段-CNP22 嵌合體)(SEQ ID NO 76)；GAHHPHEHDTHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CR) (HRGP 片段-CNP22 嵌合體)(SEQ ID NO 77)；GHHSHEQHPHGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CX) (HRGP 片段-CNP22 嵌合體)(SEQ ID NO 78)；GQPREPQVYTLPPSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物 CF) (IgG1 (Fc)片段-CNP22 嵌合體)(SEQ ID NO 79)；GQHKDDNPNLPRGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CT)(人類血清白蛋白 (HSA)片段-CNP22 嵌合體)(SEQ ID NO 80)； GERAFKAWAVARLSQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CE) (HSA 片段-CNP22 嵌合體)(SEQ ID NO 81)；FGIPMDRIGRNPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物 CZ)(骨織素”NPR C 抑制劑，，片段-CNP22 嵌合體)(SEQ ID NO 82)；及GKRTGQILGSKTGPGH(GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物 DA) (FGF2” 肝素結(jié)合域” 片段-CNP22 嵌合體)(SEQ ID NO 83)。在另一實(shí)施例中，CNP變體為包含N端肽片段及CNP22 (其中精氨酸取代CNP22的 Lys4( “CNP22(K4R)”))的嵌合體，其包括(但不限于)GQPREPQVYTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CK) (IgG1 (Fc)片段-CNP22(K4R)嵌合體)(SEQ ID NO 84)；GVPQVSTSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CL) (HSA 片段-CNP22 (K4R)嵌合體)(SEQ ID NO 85)；GQPSSSSQSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CM)(纖連蛋白片段-CNP22(K4R)嵌合體)(SEQ ID NO 86)；GQTHSSGTQSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CN)(纖維蛋白原片段-CNP22(K4R)嵌合體)(SEQ ID NO 87)；GSTGQWHSESGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CO)(纖維蛋白原片段-CNP22(K4R)嵌合體)(SEQ ID NO 88)；及GSSSSSSSSSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CP)(鋅指片段-CNP22 (K4R) 嵌合體)(SEQ ID NO 89)。在另一實(shí)施例中，CNP變體為嵌合體或融合蛋白，其包含CNP肽或變體，及可切割肽或蛋白質(zhì)，或肽標(biāo)簽。例示性可裂解蛋白質(zhì)或肽包括(但不限于)組氨酸(例如六His) 標(biāo)簽；TAF12 人類轉(zhuǎn)錄因子TAF12 ；KSI 酮類固醇異構(gòu)酶；MBP 麥芽糖結(jié)合蛋白；β-Gal β -半乳糖苷酶；GST 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶；Trx 硫氧還蛋白(thioredoxin) ；CBD 殼多糖結(jié)合域；BMPM :BMP-2突變、SUM0、CAT、TrpE、葡萄球菌蛋白A、鏈球菌蛋白、淀粉結(jié)合蛋白、內(nèi)葡聚糖酶A的纖維素結(jié)合域、外葡聚糖酶Cex的纖維素結(jié)合域、生物素結(jié)合域、recA、Flag、 c-Myc、聚(His)、聚(Arg)、聚(Asp)、聚(Gln)、聚(Phe)、聚(Cys)、綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、青色熒光蛋白、生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素、抗體表位及其片段。在另一實(shí)施例中，CNP變體可為單體或二聚體。在一相關(guān)實(shí)施例中，二聚CNP變體的單體可經(jīng)由接頭或不經(jīng)接頭使N端連接至N端，經(jīng)由接頭或不經(jīng)接頭使N端連接至C端， 或經(jīng)由接頭或不經(jīng)接頭使C端連接至C端。包含IgG片段及CNP22或其變體的嵌合體設(shè)計(jì)成尤其增強(qiáng)對(duì)NEP降解的抗性且降低與血清白蛋白的結(jié)合。包含HSA的表面片段的CNP嵌合體設(shè)計(jì)成尤其降低免疫原性且降低與血清白蛋白的結(jié)合。在N端含有富含組氨酸、無賴氨酸、無精氨酸的陽離子性序列的 HRGP-CNP22及HRGP-CNP22 (K4R)嵌合體經(jīng)設(shè)計(jì)為尤其增強(qiáng)對(duì)蛋白酶的穩(wěn)定性。含有骨織素片段的嵌合體經(jīng)設(shè)計(jì)以在骨生長板處在蛋白酶(例如弗林蛋白酶)裂解后釋放骨織素片段，其中該片段將抑制清除受體NPR-C。關(guān)于包含F(xiàn)GF2肝素結(jié)合片段的嵌合體，結(jié)合于片段的肝素經(jīng)設(shè)計(jì)以保護(hù)嵌合體避免降解，藉此提供較長血清半衰期。含有纖連蛋白、纖維蛋白原或鋅指片段的嵌合體系設(shè)計(jì)為降低與血清白蛋白的結(jié)合，以及其它有利特征。不希望受理論束縛，與wtCNP22相比對(duì)NEP降解的抗性增強(qiáng)且具有類似或改良的功能性(例如結(jié)合于NPR-B及刺激cGMP信號(hào)傳導(dǎo))的分子量為約2. 6kDa或2. 8kDa至約 6kDa或7kDa的CNP變體若不緊密結(jié)合于血漿蛋白(諸如血清白蛋白)，則可能更有效。不緊密結(jié)合于血漿蛋白(例如血清白蛋白)的CNP變體可更有效地?cái)U(kuò)散穿過軟骨，到達(dá)骨生長板的軟骨細(xì)胞，且結(jié)合并活化NPR-B以進(jìn)行cGMP信號(hào)傳導(dǎo)。在一實(shí)施例中，經(jīng)設(shè)計(jì)為降低與血漿蛋白(例如血清白蛋白)的結(jié)合的CNP變體為包含CNP22或其變體及來自IgG的肽片段的嵌合體。在另一實(shí)施例中，經(jīng)設(shè)計(jì)為降低與血漿蛋白的結(jié)合的CNP變體為包含CNP22 或CNP22(K4R)及來自多肽(例如IgG、HSA、纖連蛋白、纖維蛋白原、含鋅指多肽等)的片段的嵌合體。在另一實(shí)施例中，經(jīng)設(shè)計(jì)為降低與血漿蛋白的結(jié)合的CNP變體包含CNP22或其變體偶聯(lián)至親水性或水溶性聚合物。在一實(shí)施例中，親水性或水溶性聚合物為PEG (或ΡΕ0)。 在另一實(shí)施例中，親水性或水溶性聚合物(例如PEG)經(jīng)在生理?xiàng)l件下賦予聚合物負(fù)電荷的一或多個(gè)官能基(諸如羧基、硫酸根或磷酸根，或其組合)官能化。在本文所揭示的任何實(shí)施例中，CNP變體可具有與野生型CNP22實(shí)質(zhì)上相同或比其更佳的生物活性。舉例而言，CNP變體例如就與NPR-B (GC-B)相互作用以刺激產(chǎn)生cGMP 而言，可保留野生型CNP22活性的至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或更高，或可具有高于CNP22的活性?；蛘呋蛄硗?，CNP變體就調(diào)節(jié)軟骨內(nèi)骨生長及軟骨細(xì)胞活性而言，可保留野生型CNP22活性的至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或更高，或可具有高于0呢22 的活性，包括(但不限于)軟骨細(xì)胞增殖、軟骨細(xì)胞分化、有絲分裂原活化蛋白(MAP)激酶 /MEK(Raf-I)激酶信號(hào)傳導(dǎo)路徑的抑制，及促進(jìn)軟骨內(nèi)骨化。在本文所述的任何實(shí)施例中， CNP變體可包含與野生型CNP22的氨基酸6-22或1_22至少40 %、50%、60 %、70 %、80%、 90 %、95 %或更高相同或同源的氨基酸序列。在另一實(shí)施例中，本文提供對(duì)NPR-C清除受體具有較小親和力，同時(shí)保留結(jié)合及活化NPR-B的能力的CNP22變體。本文包括自或可自如實(shí)施方式中所述基于同源性的 NPR-B/CNP復(fù)合物結(jié)構(gòu)模型產(chǎn)生的變體。在另一實(shí)施例中，CNP變體在位置1、5、8、15、19及 21的一或多個(gè)Gly位點(diǎn)處具有取代以降低構(gòu)型柔性，此可增強(qiáng)其結(jié)合于NPR-B超過NPR-C 的特異性。對(duì)NPR-C的親和力可能降低的CNP變體包括(但不限于)具有一或多個(gè)以下取代的變體G1R、G1E、G5R、G5Q、G5S、F7Y、G8T、G8S、G8V、G8N、L9S、L9T、KlOCit、K10Q、K10S、 I14N、G15R、G15S、G15N、G15Cit、S16Q、M17V、M17N、G19S、G19R、G19N、L20V、L20R、L20T、 L20S、G21S、G21T 及 G21R。在另一實(shí)施例中，CNP變體在位置5、7、8、9、10、14、15、16、17、19、20及21中一或多
個(gè)位置處具有修飾及/或取代，且視情況可在本文所揭示的任何其它位置具有修飾及/或取代。在另一實(shí)施例中，CNP變體可視情況例如在N端及/或C端具有偶聯(lián)或延伸以有助于靶向骨/軟骨、降低腎清除率及/或增強(qiáng)對(duì)NEP降解的抗性。此(等)偶聯(lián)或延伸可包含由以下形成或來源于以下的分子或序列例如，聚Asp、聚Glu、骨或軟骨靶向肽、骨橋蛋白、 骨鈣化素、涎蛋白、PEG、碳水化合物、疏水性酸、NPPC或非CNP多肽或肽，或其組合。在又一實(shí)施例中，CNP變體是藉由標(biāo)準(zhǔn)固相肽合成法，用適當(dāng)時(shí)經(jīng)取代及/或添加的天然或非天然氨基酸或肽模擬物來制備。在另一實(shí)施例中，CNP變體是通過重組合成方法，例如經(jīng)由含有標(biāo)簽或載體蛋白的融合蛋白來產(chǎn)生，其中使用標(biāo)簽或載體蛋白有助于例如檢測(cè)、分離及/或純化融合蛋白，且使標(biāo)簽或載體蛋白自融合蛋白選擇性化學(xué)裂解或蛋白水解裂解提供目標(biāo)CNP變體。在另一實(shí)施例中，CNP變體的聚乙二醇化在化學(xué)或生物合成之后或作為化學(xué)或生物合成的部分進(jìn)行，其中偶聯(lián)反應(yīng)利用基于NHS或基于醛的化學(xué)或此項(xiàng)技術(shù)中已知的其它化學(xué)來進(jìn)行。在另一實(shí)施例中，CNP變體包含二硫鍵。在一相關(guān)實(shí)施例中，二硫鍵形成環(huán)狀肽。在另一實(shí)施例中，在對(duì)應(yīng)于CNP22的位置6與22的位置的半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵。還包括CNP變體可偶聯(lián)至疏水性聚合或非聚合部分，諸如庚酸、戊酸或脂肪酸。疏水部分可偶聯(lián)至氨基酸殘基(包括(但不限于)賴氨酸、絲氨酸、半胱氨酸或蘇氨酸)的側(cè)鏈，或可連接至CNP變體的N端及/或C端。在一實(shí)施例中，如本文所述的CNP變體具有在約8至約10. 5或約8. 5至約10范圍內(nèi)的Pi值。在另一實(shí)施例中，本文提供一種醫(yī)藥組合物，其包含CNP變體、視情況選用的另一生物活性劑，及視情況選用的醫(yī)藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑。在一些實(shí)施例中， 這些組合物為適于非經(jīng)腸注射的無菌醫(yī)藥組合物。在一些實(shí)施例中，組合物包含實(shí)質(zhì)上純 (例如至少約90%或95%純)的CNP變體。在一些實(shí)施例中，這些組合物含有少于約5%、 4%、3%、2(%、1(%或0.5(%的污染物，諸如其它人類蛋白質(zhì)、豬蛋白質(zhì)，或0呢53或其片段 (除所需CNP變體的外)。在某些實(shí)施例中，給予個(gè)體該無菌組合物以供治療或預(yù)防本文所揭示的任何CNP反應(yīng)性病狀或病癥。本文的CNP變體宜保留CNP活性且顯示增加的血清半衰期。保留CNP活性可顯示為例如保留所需活體內(nèi)生物作用，或保留在相同濃度(例如Ιμπι CNP肽或高于ED80)下 CNP22的cGMP刺激活性的至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%或至少約100%。在一些實(shí)施例中，CNP變體顯示相較于CNP22血清半衰期增至至少約1. 5倍、2倍、3倍、4倍、5 倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍或40倍。在一相關(guān)實(shí)施例中，本文所述的CNP變體與野生型CNP22相比具有增強(qiáng)的NEP抗性且顯示增加的半衰期。在一實(shí)施例中，與野生型CNP22相比，CNP變體的半衰期增加約 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或約 100%。在某些實(shí)施例中，本文所述的CNP變體增加活體外cGMP產(chǎn)生、增加活體內(nèi)cGMP產(chǎn)
31生、活體內(nèi)增加一或多種與軟骨或骨形成或生長相關(guān)的生物標(biāo)記的含量、增強(qiáng)對(duì)活體外NEP 裂解的抗性、增加血漿或血清活體內(nèi)半衰期、增強(qiáng)活體內(nèi)生物可用性，或增加活體內(nèi)特定骨的長度，或?qū)崿F(xiàn)此等增加(增強(qiáng))的組合，與野生型CNP22相比，增至約1.5倍、約2倍、約 2. 5倍、約3倍、約3. 5倍、約4倍、約4. 5倍或約5倍或更多倍。在另一實(shí)施例中，本文提供治療CNP反應(yīng)性病狀或病癥的方法，其包含給予有需要的個(gè)體治療有效量的CNP變體或包含其的組合物。在一實(shí)施例中，CNP反應(yīng)性病癥為骨生長病癥，包括(但不限于)骨骼發(fā)育不良及遺傳性骨骼畸形，諸如與成纖維細(xì)胞生長因子受體3(FGFR-;3)突變相關(guān)的病癥。在一特定實(shí)施例中，與FGFR-3突變相關(guān)的病癥為軟骨發(fā)育不全。在另一實(shí)施例中，CNP反應(yīng)性病癥為與血管平滑肌細(xì)胞及組織相關(guān)的病癥。在另一實(shí)施例中，CNP變體適用于增大骨(例如肢骨)的生長板的尺寸。在另一實(shí)施例中，CNP 變體適用于使骨延長或增強(qiáng)長骨生長。在又一實(shí)施例中，CNP變體適用于增強(qiáng)軟骨細(xì)胞的基質(zhì)產(chǎn)生、增殖及分化。在某些實(shí)施例中，以約5nmol/kg 或 10nmol/kg 至約 300nmol/kg，或約 20nmol/kg 至約200nmol/kg范圍內(nèi)的劑量給予本文所述的CNP變體。在一些實(shí)施例中，以約5、10、 15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、210、 220、230、240、250、260、270、280、290、300、350、400、450、500、750、1000、1250、1500、1750 或 2000nmOl/kg的劑量或治療醫(yī)師認(rèn)為適當(dāng)?shù)钠渌鼊┝拷o予CNP變體。在其它實(shí)施例中，以約 5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、 250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750 或 800μ g/kg，或約 lmg/kgU. 25mg/kg、 1. 5mg/kg、2mg/kg的劑量或治療醫(yī)師認(rèn)為適當(dāng)?shù)钠渌鼊┝拷o予CNP變體。本文所述的CNP 變體的劑量可根據(jù)本文所述的給藥頻率/給藥頻率來給予，這些頻率包括(但不限于)每日、每周2或3次、每周、每2周、每3周、每月等。在另一實(shí)施例中，以單次治療或多次劑量形式給予CNP變體。多次劑量可在療程內(nèi)每日給予，或分多次劑量給予。在某些實(shí)施例中，包括以如下頻率給予CNP變體單次劑量或多次劑量、每日、每隔一日、每3日、每周2次、每周3次、每周、每兩周、每3周、每月、每 6周、每2個(gè)月、每3個(gè)月，或治療醫(yī)師認(rèn)為適當(dāng)?shù)念l率。在某些實(shí)施例中，調(diào)節(jié)CNP變體的給予以留出生長期(例如軟骨生成)，接著為恢復(fù)期(例如骨生成)。舉例而言，可皮下、靜脈內(nèi)，或藉由另一模式每日或每周多次給予 CNP變體持續(xù)一段時(shí)間，接著為無治療時(shí)期，接著重復(fù)該循環(huán)。在一些實(shí)施例中，初始治療期(例如每日或每周多次給予CNP變體)持續(xù)3日、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8 周、9周、10周、11周或12周。在一相關(guān)實(shí)施例中，無治療時(shí)期持續(xù)3日、1周、2周、3周或4 周。在某些實(shí)施例中，CNP變體的給藥療程為每日給藥持續(xù)3日，接著3日不給藥；或每日或每周多次給藥持續(xù)1周，接著3日或1周不給藥；或每日或每周多次給藥持續(xù)2周，接著 1或2周不給藥；或每日或每周多次給藥持續(xù)3周，接著1、2或3周不給藥；或每日或每周多次給藥持續(xù)4、5、6、7、8、9、10、11或12周，接著1、2、3或4周不給藥。在其它實(shí)施例中，本文提供一種治療CNP反應(yīng)性病狀或病癥的方法，其包含給予個(gè)體CNP肽或變體，及監(jiān)測(cè)個(gè)體中(例如來自個(gè)體的生物樣品中)至少一種骨或軟骨相關(guān)生物標(biāo)記的含量，其中骨或軟骨相關(guān)生物標(biāo)記的含量增加或降低表明CNP肽或變體對(duì)該個(gè)體具有治療作用。在一些實(shí)施例中，當(dāng)生物標(biāo)記含量與骨或軟骨形成或生長相關(guān)而增加時(shí)，該生物標(biāo)記含量的增加表明CNP肽或變體對(duì)該個(gè)體具有治療作用。在其它實(shí)施例中，當(dāng)生物標(biāo)記含量與骨或軟骨形成或生長相關(guān)而降低時(shí)，該生物標(biāo)記含量的降低表明CNP肽或變體對(duì)該個(gè)體具有治療作用。在其它實(shí)施例中，治療方法進(jìn)一步包含調(diào)節(jié)給予CNP肽或變體的量(或劑量)或頻率，其中(i)在生物標(biāo)記含量與骨或軟骨形成或生長相關(guān)而增加的情況下，若至少一種骨或軟骨相關(guān)生物標(biāo)記的含量低于目標(biāo)含量，則增加給予CNP肽或變體的量(或劑量)或頻率；或(ii)在生物標(biāo)記含量與骨或軟骨形成或生長相關(guān)而增加的情況下，若至少一種骨或軟骨相關(guān)生物標(biāo)記的含量高于目標(biāo)含量，則降低給予CNP肽或變體的量(或劑量)或頻率；或(iii)在生物標(biāo)記含量與骨或軟骨形成或生長相關(guān)而降低的情況下，若至少一種骨或軟骨相關(guān)生物標(biāo)記的含量高于目標(biāo)含量，則增加給予CNP肽或變體的量(或劑量)或頻率；或(iv)在生物標(biāo)記含量與骨或軟骨形成或生長相關(guān)而降低的情況下，若至少一種骨或軟骨相關(guān)生物標(biāo)記的含量低于目標(biāo)含量，則降低給予CNP肽或變體的量(或劑量)或頻率。預(yù)期生物標(biāo)記的目標(biāo)含量指與個(gè)體中治療作用及/或在緩解或改善病癥或病狀的癥狀方面的有益作用相關(guān)的生物標(biāo)記的含量或含量范圍。在某些實(shí)施例中，高于或低于目標(biāo)含量的生物標(biāo)記含量可能對(duì)個(gè)體有害。在其它實(shí)施例中，本文包括一種評(píng)估給予CNP肽或變體對(duì)骨或軟骨形成或生長的影響的方法。在一實(shí)施例中，該方法提供分析或量測(cè)已給予CNP肽或變體的個(gè)體中至少一種骨或軟骨相關(guān)生物標(biāo)記的含量以評(píng)估CNP肽或變體在活體內(nèi)對(duì)骨及軟骨形成及生長的影響。在一相關(guān)實(shí)施例中，至少一種骨或軟骨相關(guān)生物標(biāo)記的含量增加可表明給予CNP肽或變體對(duì)骨或軟骨形成或生長具有積極影響且為適用于與CNP活性降低相關(guān)的骨骼發(fā)育不良及其它骨或軟骨相關(guān)疾病或病癥的治療。例示性骨或軟骨相關(guān)生物標(biāo)記包括(但不限于)CNP (例如內(nèi)源性含量的CNP-22或CNP-53)、cGMP、骨鈣化素、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、 I型原膠原的前肽(PINP)及其片段、I型膠原蛋白及其片段、II型膠原蛋白的前肽及其片段、II型膠原蛋白及其片段、聚集蛋白聚糖硫酸軟骨素(aggrecan chondroitin sulfate) 及堿性磷酸酶。在其它實(shí)施例中，本文包括一種評(píng)估CNP肽或變體對(duì)個(gè)體中至少一種骨或軟骨相關(guān)生物標(biāo)記的含量的影響的方法，其包含分析或量測(cè)來自已給予CNP肽或變體的個(gè)體的生物樣品中骨或軟骨相關(guān)生物標(biāo)記的含量。在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包含給予個(gè)體CNP 肽或變體，隨后分析或量測(cè)骨或軟骨相關(guān)生物標(biāo)記的含量。在某些實(shí)施例中，至少一種骨或軟骨相關(guān)生物標(biāo)記選自CNP (例如內(nèi)源性含量的 CNP-22或CNP-53)、cGMP、II型膠原蛋白的前肽及其片段、II型膠原蛋白及其片段、骨鈣化素、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、I型原膠原的前肽(PINP)及其片段、I型膠原蛋白及其片段、 聚集蛋白聚糖硫酸軟骨素及堿性磷酸酶。在與骨或軟骨相關(guān)生物標(biāo)記有關(guān)的方法(例如治療方法、診斷方法及分析方法)的一些實(shí)施例中，CNP肽或變體為CNP-22、CNP-53,或本文所述的任何CNP肽及變體。在此等方法的某些實(shí)施例中，CNP肽或變體不是CNP-22或CNP-53。在其它實(shí)施例中，本文提供一種重組產(chǎn)生CNP變體的方法，其包含將包含編碼CNP 變體肽的多核苷酸連接至編碼可切割肽或蛋白質(zhì)的多核苷酸的宿主細(xì)胞在培養(yǎng)基中在使得由這些多核苷酸編碼的融合多肽得以表達(dá)的條件下培養(yǎng)。在一相關(guān)實(shí)施例中，宿主細(xì)胞經(jīng)包含編碼CNP變體肽的多核苷酸連接至編碼可切割肽或蛋白質(zhì)的多核苷酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。在一實(shí)施例中，載體為質(zhì)粒。在又一實(shí)施例中，質(zhì)粒選自pET-21a、pjexpress、 pET-31b、pET-15b、pET_32a、pET_41a、pMAL、pQE-30、pET-SUMO、pET_22b 及 pTYBll。在某些實(shí)施例中，可切割肽或蛋白質(zhì)包含選自由以下組成的群的多肽組氨酸標(biāo)簽、人類轉(zhuǎn)錄因子TAF12、酮類固醇異構(gòu)酶、麥芽糖結(jié)合蛋白、半乳糖苷酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、硫氧還蛋白、殼多糖結(jié)合域，及ΒΜΡ-2突變，或其片段。在一相關(guān)實(shí)施例中，可切割肽或蛋白質(zhì)由切割劑切割。在一些實(shí)施例中，切割劑選自甲酸、溴化氰(CNBr)、羥胺、蛋白質(zhì)自切割(protein self cleavage)、因子)(a、 腸激酶、ftx)TEV及SUMO蛋白酶。其它例示性切割劑包括(但不限于)鈀、梭菌蛋白酶 (clostripain)、凝血酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胰蛋白酶樣蛋白酶、羧肽酶、腸肽酶、Kex 2蛋白酶、Omp T蛋白酶、枯草桿菌蛋白(subtilisin)、V8蛋白酶、HIV蛋白酶、鼻病毒蛋白酶、變種枯草桿菌蛋白酶(furilisin)、IgA蛋白酶、人類I^ce蛋白酶、膠原酶、Nia蛋白酶、脊髓灰白質(zhì)炎病毒2Apro蛋白酶、脊髓灰白質(zhì)炎病毒3C蛋白酶、genenase、弗林蛋白酶、彈性蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、皺胃酶(rerminM凝乳酶(chymosin))、微生物天冬氨酸蛋白酶、木瓜酶、鈣蛋白酶(calpain)、木瓜凝乳酶(chymopapain)、無花果酶(ficin) (無花果蛋白酶(ficain))、菠蘿酶(bromelain)(菠蘿蛋白酶(bromelase))、組織蛋白酶B(cath印isin B)、卡斯蛋白酶(caspase)、嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)、內(nèi)切蛋白酶 Arg-C、內(nèi)切蛋白酶Glu-C、內(nèi)切蛋白酶Lys-C、胰舒血管素(kallikrein)及纖維蛋白溶酶。在某些實(shí)施例中，融合多肽表達(dá)為可溶蛋白質(zhì)或包涵體。在一相關(guān)實(shí)施例中，本文包括自宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基分離所表達(dá)的融合多肽。在另一實(shí)施例中，使經(jīng)分離的融合多肽與如本文所述的切割劑接觸。在一實(shí)施例中，本文提供一種包含表達(dá)載體的細(xì)菌宿主細(xì)胞，該載體包含編碼CNP 變體肽的多核苷酸連接至編碼可切割肽或蛋白質(zhì)的多核苷酸。在一些實(shí)施例中，可切割肽或蛋白質(zhì)選自組氨酸標(biāo)簽、人類轉(zhuǎn)錄因子TAF12、酮類固醇異構(gòu)酶、麥芽糖結(jié)合蛋白、 β -半乳糖苷酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、硫氧還蛋白、殼多糖結(jié)合域，及ΒΜΡ-2突變，或其片段。在另一實(shí)施例中，宿主細(xì)胞為細(xì)菌，諸如大腸桿菌(E. coli)。在一相關(guān)實(shí)施例中， 大腸桿菌細(xì)胞選自BL21 (DE3)、BL21 (DE3) pLysS、BL21 (DE3) pGro7、ArcticExpress (DE3)、 C41 [亦稱作 C41 (DE3) ]、C43 [亦稱作 C43 (DE3) ]、Origami B (DE3)、Origami B (DE3) pLysS、 KRX及Timer(DE;3)。在另一實(shí)施例中，宿主細(xì)胞包含如上所述的載體。在一些實(shí)施例中，宿主細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)的前經(jīng)載體轉(zhuǎn)化。在某些實(shí)施例中，包括在培養(yǎng)基中在適于表達(dá)由多核苷酸編碼的融合多肽的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。在一實(shí)施例中，融合多肽表達(dá)為可溶蛋白質(zhì)或包涵體。在一相關(guān)實(shí)施例中，自宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基分離所表達(dá)的融合多肽。在又一實(shí)施例中，使經(jīng)分離的融合多肽與如本文所述的切割劑接觸。


圖1展示大腸桿菌中CNP融合蛋白的表達(dá)(圖IA 考馬斯藍(lán)染色，圖1B:蛋白質(zhì)印跡分析)。M 蛋白質(zhì)標(biāo)記；T 總細(xì)胞溶胞物；S:可溶上清液；P :2yg CNP22 ；KSI KSI-CNP (M/N)融合蛋白表達(dá)(不可溶)；N:未誘導(dǎo)的KSI-CNP融合蛋白總?cè)馨铮籏SI ’ KSI-P-CNP融合蛋白表達(dá)(不可溶)；Trx =Trx-P-CNP融合蛋白表達(dá)(可溶)；MBP MBP-P-CNP融合蛋白表達(dá)(可溶)；TAF =TAF-P-CNP融合蛋白表達(dá)(不可溶)(BL21) ；TAF’ TAF-P-CNP融合蛋白表達(dá)(不可溶)BL21 (DE3)，其中CNP為Gly_CNP37 ；圖2展示TAF-CNP包涵體的甲酸裂解。M 蛋白質(zhì)標(biāo)記；1 :Gly_CNP37陽性對(duì)照；2 未裂解的TAF-CNP包涵體；3 甲酸裂解的TAF-CNP包涵體，其中CNP為Gly_CNP37 ；圖3A-E描繪大腸桿菌中CNP融合蛋白的表達(dá)。M 蛋白質(zhì)標(biāo)記；Tu 未經(jīng)誘導(dǎo)的總細(xì)胞溶胞物；Su 未經(jīng)誘導(dǎo)的可溶上清液；T 誘導(dǎo)的總細(xì)胞溶胞物；S 可溶上清液；Cl CNP22 ；C :Gly-wtCNP37 ( “CNP38”)；P 不可溶沉淀。A :KSI :KSI_CNP38 (M/N)融合蛋白表達(dá)(不可溶)；KSI，:KSI-Pro-CNP38 (Pro_Gly-wtCNP37 指定為” Pro_CNP38 ”)融合蛋白表達(dá)(不可溶)；Trx :Trx-Pro-CNP38融合體表達(dá)(可溶)；MBP :MBP-Pro-CNP38融合蛋白表達(dá)(可溶)；TAF:來自BL21細(xì)胞的TAF-Pro-CNP38融合蛋白表達(dá)(不可溶)；TAF’ 來自BL21 (DE3)細(xì)胞的TAF-Pro-CNP38融合蛋白表達(dá)(不可溶)。B :TAF-Pro_CNP37及 BMP-Pro-CNP37融合蛋白表達(dá)。C :BMP-Pro_CNP38融合蛋白及BMP蛋白質(zhì)表達(dá)。D TAF-Pr o-HSA-CNP ( "Pro-GHKSEVAHRFK-wtCNP27 (SEQ ID NO :188)指定為”Pro-HSA-CNP，，)融合蛋白表達(dá)。E :TAF-Pro-CNP38融合蛋白及TAF蛋白質(zhì)表達(dá)； 圖4A-C描繪TAF-Pro-CNP38包涵體的甲酸切割。A :TAF-Pro_CNP38包涵體的50 % 甲酸切割。M 蛋白質(zhì)標(biāo)記；U 未切割的TAF-Pro-CNP38包涵體；25 °C、37 °C、42 °C、55 °C TAF-Pro-CNP38包涵體在50%甲酸中在25°C、37°C、42°C或55°C下切割24小時(shí)。37°C -S及 55°C -S 來自37°C及55°C下的切割反應(yīng)、以ION NaOH中和且在14，OOOrpm下離心15分鐘的可溶上清液。B :TAF-Pro-CNP38包涵體的10%及2%甲酸切割。M 蛋白質(zhì)標(biāo)記；U 未切割的TAF-Pro-CNP38包涵體；C 甲酸切割的TAF-Pro_CNP38 ；S 無中和下在14，OOOrpm下離心5分鐘后的可溶上清液；P 無中和下在14，OOOrpm下離心5分鐘后的不可溶沉淀；C 來自TAF-Pro-CNP38包涵體的2%及10%甲酸切割產(chǎn)物的LC/MS分析；圖5A-C描繪在不同溫度及甲酸切割時(shí)間下TAF-Pro_CNP38包涵體的甲酸切割。M 蛋白質(zhì)標(biāo)記；C :Gly-wtCNP37(‘‘CNP38”)陽性對(duì)照；U 未切割的TAF_Pro_CNP38包涵體。A 在 42°C、55°C或 70°C下以 2% 甲酸切割 6、24 或 48 小時(shí)的 TAF_Pro_CNP38。B 在 55°C、60°C、 65°C或 70°C下以 2% 甲酸切割 17 或 24 小時(shí)的 TAF-Pro_CNP38。C 來自 TAF-Pro_CNP38 包涵體的2%甲酸切割產(chǎn)物的LC/MS分析；圖6為TAF-CNP34融合蛋白表達(dá)的SDS-PAGE(考馬斯藍(lán)染色)。M 蛋白質(zhì)標(biāo)記； C 對(duì)照Wly-CNP37(“CNP38”)] ；T 總細(xì)胞溶胞物；S 上清液；TI 經(jīng)誘導(dǎo)的總細(xì)胞溶胞物； SI 經(jīng)誘導(dǎo)上清液；圖 7 為融合蛋白 TAF-NL- (C/A 及 6D/6E) _Pro_CNP38、TAF (C/A 及10D/10E)-Pro-CNP38 及 TAF_Pro_CNP53 表達(dá)的 SDS-PAGE(考馬斯藍(lán)染色)，其中” Pro-CNP38”表示 Pro-Gly-CNP37。Μ:蛋白質(zhì)標(biāo)記；C 對(duì)照[Gly-CNP37 ( “CNP38，，)] ；T 總細(xì)胞溶胞物；TI 經(jīng)誘導(dǎo)的總細(xì)胞溶胞物；S 上清液；SI 經(jīng)誘導(dǎo)上清液；圖8為融合蛋白TAF-CNP34及TAF_Pro_CNP53的甲酸切割產(chǎn)物的SDS-PAGE (考馬斯藍(lán)染色)。M 蛋白質(zhì)標(biāo)記；P:陽性對(duì)照[Gly-CNP37(“CNP38”)] ；U 未切割；C 切割；CS 切割的上清液；CP 切割的沉淀；圖9為展示TAF-CNP3甲酸切割后CNP-34的峰的LC/MS層析圖；圖10為展示TAF-Pro-CNP53甲酸切割后Pro_CNP53的峰的LC/MS層析圖；圖 11 為融合蛋白 TAF (C/A 及 4D/4E) -Pro-CNP38 及 TAF (4D/4E) -Pro-CNP38 表達(dá)的SDS-PAGE (考馬斯藍(lán)染色)，其中” ft~o-CNP38”表示Pro_Gly-CNP37。M 蛋白質(zhì)標(biāo)記；C 對(duì)照[Gly-CNP37( “CNP38”)] ；T 總細(xì)胞溶胞物；TI 經(jīng)誘導(dǎo)的總細(xì)胞溶胞物；S 上清液； SI 經(jīng)誘導(dǎo)上清液；圖 12 為融合蛋白 TAF (4D/4E) -Pro_CNP38 及 TAF (C/A 及 4D/4E) -Pro_CNP38 的甲酸切割產(chǎn)物的SDS-PAGE (考馬斯藍(lán)染色)，其中”Pro-CNP38”表示Pro_Gly-CNP37。M :蛋白質(zhì)標(biāo)記；P 陽性對(duì)照[Gly-CNP37( “CNP38”)] ；U 未切割；C 切割；CS 切割的上清液；CP 切割的沉淀；圖 13 為融合蛋白 TAF-NL-(C/A 及 6D/6E)-Pro_CNP38 及 TAF (C/A 及 10D/10E) -Pro-CNP38的甲酸切割產(chǎn)物的SDS-PAGE (考馬斯藍(lán)染色)，其中” Pro-CNP38"表示 ftx)-Gly-CNP37。M 蛋白質(zhì)標(biāo)記；P 陽性對(duì)照[Gly_CNP37 ( “CNP38”)] ；U 未切割；C 切割；CS 切割的上清液；CP 切割的沉淀； 圖14為在BL21 (DE3)細(xì)胞的IOL發(fā)酵物中產(chǎn)生的TAF-Pro_CNP38融合蛋白的使用抗CNP抗體的蛋白質(zhì)印跡分析，其中在OD6tltl = 64時(shí)及第17小時(shí)誘導(dǎo)這些細(xì)胞且” Pro-CNP38” 表示 Pro_Gly-CNP37 ；圖15為來自較粗Pro-Gly_CNP37 ( "Pro-CNP38")產(chǎn)物的SP-瓊脂糖陽離子交換管柱層析的洗脫級(jí)分的SDS-PAGE(考馬斯藍(lán)染色)。A 水中的TAF-Pro-CNP38包涵體 (IB) ；B :甲酸鹽中的IB ；C :甲酸鹽中的IB，經(jīng)中和；D 中和的沉淀；E 中和的上清液；F TMAE Hi-CAP負(fù)載；G 流經(jīng)的TMAE Hi-CAP/SP-瓊脂糖負(fù)載；H 流經(jīng)的SP-瓊脂糖；SP-瓊脂糖洗脫級(jí)分1-47 10微升/泳道；圖16展示N端聚乙二醇化CNP22偶聯(lián)物在活體外對(duì)中性內(nèi)肽酶(NEP)的抗性程度；圖17描繪在N端具有氨基酸延伸的CNP變體[“CNP27”為GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)]的NEP抗性程度；圖 18 說明 N 端聚乙二醇化 CNP17 及 GANRR-CNP22 (K4R) ( “CNP27”) (SEQ ID NO 36)的NEP抗性程度；圖 19 說明 wtCNP22 及 CNP 變體 Gly_CNP37、GHKSEVAHRFK_wtCNP27 (圖中的” CNP27-HSA”)(SEQ ID NO :144)及 PE012-GANRR-CNP22 (K4R)(圖中的” CNP27-PE012”) (SEQ ID NO 36)的 NEP 抗性程度；圖20展示具有N端氨基酸延伸的CNP變體在NIH3T3細(xì)胞中活體外刺激cGMP 產(chǎn)生的能力。這些結(jié)果是相對(duì)于在ΙμΜ CNP22存在下產(chǎn)生的cGMP含量?！盋NP27”為GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO 36)；圖 21 展示 N 端聚乙二醇化 CNP17 及 GANRR-CNP22 (K4R) ( “CNP27”) (SEQ ID NO 36)在NIH3T3細(xì)胞中刺激cGMP產(chǎn)生的能力；圖22說明CNP22的N端聚乙二醇化對(duì)cGMP產(chǎn)生的影響；圖 23 說明 NIH3T3 細(xì)胞中由 wtCNP22 及 CNP 變體 Gly_CNP37、 GHKSEVAHRFK-wtCNP27 ( "CNP27-HSA" ) (SEQ ID NO : 1 44)、wtCNP29 及 PE012-GANRR-CNP22 (K4R) ( “CNP27-PE012，，)(SEQ ID NO :36)誘導(dǎo)的 cGMP 產(chǎn)生；圖24A及B展示在活體外信號(hào)傳導(dǎo)競爭分析法中，CNP-22及 Pro-Gly-CNP37 ( "Pro-CNP38")經(jīng)由NPR-B、以類似劑量-反應(yīng)曲線、且以比經(jīng)由NPR-A高得多的程度刺激cGMP產(chǎn)生，且顯示NPR-B相對(duì)于NPR-C選擇性的類似概況；圖25顯示每日一次1小時(shí)或每日一次2小時(shí)將大鼠軟骨肉瘤細(xì)胞暴露于CNP22在逆轉(zhuǎn)FGF2誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞生長停滯方面與連續(xù)暴露于CNP22具有實(shí)質(zhì)上類似的有效性；圖^A及B展示來自對(duì)CNP22對(duì)FGF2停滯的大鼠軟骨肉瘤(RCS)細(xì)胞的影響進(jìn)行的劑量反應(yīng)研究的結(jié)果；圖27A-D展示將CNP22添加至藉由FGF2停滯的RCS細(xì)胞中增加基質(zhì)合成且部分抑制FGF2，如由35S-硫酸鹽及3H-Pro并入基質(zhì)中或在基質(zhì)中減少所評(píng)估。A及C圖，合成；B及 D圖，降解；A及B圖,3 量測(cè)；C及D圖，3H量測(cè)。統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的差異經(jīng)突出顯示(AN0VA ； *p < 0. 05，**p < 0. 01)；圖28A-C展示以FGF2及CNP22培養(yǎng)的RCS細(xì)胞中聚集蛋白聚糖及纖連蛋白產(chǎn)生的程度(mRNA，圖A及C，及蛋白質(zhì)，圖B)；圖 29 展示 CNP37 及 PE024-GANRR-CNP22 (K4R)(圖中的” CNP27-PE024，，) (SEQ ID NO 36)在離體小鼠器官模型中刺激野生型股骨的縱向生長的功效；圖 30 展示每兩日以 CNP22、CNP37 或 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)處理的2-3日齡野生型小鼠脛骨的縱向骨生長。相對(duì)于處理前(第0日)的量測(cè)值校正結(jié)果。 數(shù)據(jù)以平均值士 SEM (n = 8)的形式表示；圖 31 展示每兩日以 CNP22、CNP37 或 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)處理的2-3日齡軟骨發(fā)育不全FGFR3aeh小鼠脛骨的縱向骨生長。相對(duì)于處理前(第0日)的量測(cè)值校正結(jié)果。數(shù)據(jù)以平均值士 SEM (n = 7-8)的形式表示；圖 32 展示每兩日以 CNP22、CNP37 或 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)處理的2-3日齡野生型小鼠股骨的縱向骨生長。相對(duì)于處理前(第0日)的量測(cè)值校正結(jié)果。 數(shù)據(jù)以平均值士 SEM (n = 8)的形式表示；圖 33 展示每兩日以 CNP22、CNP37 或 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)處理的2-3日齡FGFR3aeh小鼠股骨的縱向骨生長。相對(duì)于處理前(第0日)的量測(cè)值校正結(jié)果。數(shù)據(jù)以平均值士 SEM (n = 3-7)的形式表示；圖34Α-Ι描繪每兩日離體處理的FGFR3aeh小鼠股骨中的CNP37生物分布。圖A-C 說明股骨遠(yuǎn)端中的分布，圖D-F說明關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的分布且圖G-I說明肥大軟骨細(xì)胞中的分布；圖35A-C描繪在每兩日以CNP22或CNP37處理野生型及FGFR3aeh小鼠股骨持續(xù)8 日之后生長板中增殖柱的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。㈧無處理，⑶處理后每柱的細(xì)胞數(shù)，(C)處理后的形態(tài)學(xué)研究。圖35C(i)至C(Vi)中的圖對(duì)應(yīng)于圖35B中所述的樣品順序。數(shù)據(jù)以平均值士 SEM (n = 4-8)的形式表示；圖36A-C描繪在每兩日以CNP22或CNP37離體處理野生型及FGFR3aeh小鼠股骨持續(xù)8日之后的軟骨細(xì)胞肥大。(A)無處理，(B)處理后的細(xì)胞尺寸，(C)處理后的形態(tài)學(xué)研究。圖36C(i)至C(vi)中的圖對(duì)應(yīng)于圖36B中所述的樣品順序。數(shù)據(jù)以平均值士SEM(n =4-9)的形式表示；圖37A-I描繪經(jīng)活體內(nèi)處理的FGFR3aeh小鼠脛骨中的CNP37生物分布。圖A-C展示股骨遠(yuǎn)端中的分布，圖D-F說明關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的分布且圖G-I說明肥大軟骨細(xì)胞中的分布；圖38A-C說明CNP37對(duì)FGFR3aeh小鼠脛骨生長板的活體內(nèi)作用㈧總生長板厚度，(B)增殖區(qū)厚度，及(C)肥大區(qū)厚度。數(shù)據(jù)以平均值士SEM(n = 7-15)的形式表示；圖 39 展示來自以 CNP22、CNP37 或 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) ( “CNP27-PE024，，) (SEQ ID NO 36)離體處理的野生型小鼠股骨的條件培養(yǎng)基中的cGMP含量(ρ < 0. 01)；圖 40 展示來自以 CNP22、CNP37 或 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)離體處理的FGFR3aeh小鼠股骨的條件培養(yǎng)基中的cGMP含量(ρ < 0. 01)；圖 41 描繪來自以 CNP22、CNP37 或 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)離體處理的野生型小鼠脛骨的條件培養(yǎng)基中的cGMP含量(ρ < 0. 01)；圖 42 展示來自以 CNP22、CNP37 或 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)離體處理的FGFR3aeh小鼠脛骨的條件培養(yǎng)基中的cGMP含量(ρ < 0. 01)；圖43顯示使野生型及FGFR3aeh小鼠股骨離體暴露于CNP22、CNP37或 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)使條件培養(yǎng)基中切割的第II型膠原蛋白的含量增加(P < 0. 05)；圖44描繪自野生型小鼠及FGFR3Y367G小鼠(嚴(yán)重軟骨發(fā)育不全的小鼠模型)分離且以載體或ΙμΜ Pro-Gly-CNP37 ( "ProCNP38 ”)離體處理6日的股骨肥大區(qū)，表明 Pro-Gly-CNP37處理使得生長板中的骨生長及擴(kuò)展增強(qiáng)；圖 45 展示靜脈內(nèi)(i. v.)給予大鼠的 CNP37 及 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)在血漿中具有比CNP22長得多的半衰期及高得多的生物可用性；圖 46 說明皮下(s. c.)給予大鼠的 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)在血漿中亦具有比CNP22長得多的半衰期及高得多的生物可用性；圖 47 顯示靜脈內(nèi)給予的 CNP37 及 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)在大鼠中刺激比CNP22高得多的cGMP產(chǎn)生量；圖 48 展示皮下給予的 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)及(以較低程度)CNP37實(shí)質(zhì)上比CNP22更有效地在大鼠中刺激cGMP產(chǎn)生；圖 49 展示以 Gly-CNP37 或 PE012-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)處理的野生型小鼠的體重量測(cè)值；圖 50 展示以 Gly-CNP37 或 PE012-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)處理的野生型小鼠的尾長量測(cè)值；圖 51 說明以 CNP22、CNP37 或 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)處理 FGFR3adl小鼠對(duì)身長的影響(ρ = 0.02，單尾t-檢驗(yàn)，不等變異)；
38
圖 52 展示 CNP22、CNP37 及 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)對(duì) FGFR3ach 小鼠尾長的影響；圖 53A 及 B 展示 CNP22、CNP37 及 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)對(duì) FGFR3aeh小鼠的遠(yuǎn)程長骨(A，尺骨；B，脛骨)長度的影響(ρ < 0. 01，單尾t_檢驗(yàn)，不等變異)；圖 54A 及 B 展示 CNP22、CNP37 及 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)對(duì) FGFR3aeh小鼠的近端骨(A，肱骨；B，股骨)長度的影響(ρ < 0. 01，單尾t_檢驗(yàn)，不等變異)；圖55說明給予CNP37矯正近端肢骨短小(近端肢長不成比例)，如由在FGFR3aeh 小鼠中觀察到的股骨脛骨比率所評(píng)估(P < 0.01，單尾t-檢驗(yàn)，不等變異)；圖 56 展示 CNP22、CNP37 及 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)對(duì) FGFR3ach 小鼠頭長的影響(P <0.01，單尾t-檢驗(yàn)，不等變異)；圖57展示以CNP37處理FGFR3aeh小鼠使外耳道(EAM)尺寸增加(P = 0. 03，單尾 t-檢驗(yàn)，不等變異)；圖 58 展示 CNP22、CNP37 及 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)對(duì)軟骨發(fā)育不全小鼠的脊椎長度的影響，其表達(dá)為椎骨體(例如腰椎5)延伸；圖 59 展示以 CNP37 或 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)處理 FGFR3ach 小鼠使得給藥后15分鐘cGMP血漿含量增加；圖 60 說明以 CNP22、CNP37 或 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)處理 5 周
的FGFR3aeh小鼠中切割的第II型膠原蛋白的血清含量；圖 61 展示以 CNP22、CNP37 或 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)處理 5 周
的FGFR3aeh小鼠中骨鈣化素的血清含量；圖 62 展示來自以 Gly-CNP37 或 PE012-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)處理的野生型小鼠的給藥后15分鐘的cGMP血漿含量(ρ < 0. 05)；圖 63 展示以 Gly-CNP37 或 PE012-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)處理 5 周的野生型小鼠中切割的第II型膠原蛋白的血清含量；圖64-66展示在給予野生型小鼠載體或20nmol/kg或70nmol/kg Pro-Gly-CNP37 ( "Pro-CNP38")之后cGMP、切割的第II型膠原蛋白及堿性磷酸酶的含量；圖67及68描繪在依據(jù)不同給藥療程給予載體或Pro_Gly-CNP37 ( "Pro-CNP38") 之后，切割的第II型膠原蛋白及總堿性磷酸酶含量；圖69說明在兩個(gè)個(gè)別研究(Si及S2)中在第37日相對(duì)于第1日，經(jīng) Pro-Gly-CNP37 ( "Pro-CNP38")及載體處理的動(dòng)物的身長的相對(duì)增加；圖70A及B展示在給予Pro-Gly_CNP37 (“ft~0-CNP38”)之后骨密度(A)及骨礦質(zhì)含量⑶的變化；圖71展示第36日在最后一次皮下給予CNP變體之后15分鐘的血漿cGMP含量，其中在圖 71-73 中，Gly-wtCNP37 為” CNP38”，Pro-Gly-wtCNP37 為” Pro_CNP38”，且 GHKSEVAHRFK-wtCNP27 (SEQ ID NO :144)為，，HSA-CNP27” ；圖 72 展示以 Gly-CNP37、Pro-Gly-CNP37 或 GHKSEVAHRFK-CNP27 (SEQ ID NO :144) 處理的小鼠的切割的第II型膠原蛋白的血清含量；圖 73 展示以 Gly-CNP37、Pro-Gly-CNP37 或 GHKSEVAHRFK-CNP27 (SEQ ID NO :144)處理的小鼠的堿性磷酸酶的血清含量；圖74A及B描繪在以1 μ M Gly_CNP37短期㈧或長期⑶處理后cGMP反應(yīng)的脫敏；圖 75A 顯示以 200nmol/kg Pro_Gly-CNP37 ( “Pro_CNP38”)每日處理野生型小鼠持續(xù)8日不使cGMP反應(yīng)脫敏。圖75B展示一日一次以200nmol/kg Pro_Gly-CNP37處理小鼠持續(xù)連續(xù)兩日增強(qiáng)cGMP反應(yīng)；圖76A-D展示以200nmol/kg Gly_CNP37處理野生型小鼠刺激股骨遠(yuǎn)端(軟骨及骨)(A)、股骨皮層(骨)(B)、耳翼(軟骨)(C)及腎臟⑶中的cGMP分泌。圖76E-H展示肝(E)、心臟(F)、肺(G)及腦(H)組織在所研究時(shí)點(diǎn)相對(duì)于載體對(duì)照并未顯示響應(yīng)于 Gly-CNP37的顯著cGMP分泌；圖77-82展示來自在經(jīng)每日皮下注射載體或10 μ g/kg或36 μ g/kg Pro-Gly-CNP37的正常幼年獼猴中正進(jìn)行的研究的結(jié)果。兩種劑量的Pro_Gly-CNP37均具有增加的生長板寬度(圖77)、增加的左脛骨及右脛骨長度(圖78A及B)、增加的腿長(圖 79)、增加的臂長(圖80)、增加的身長(圖81)，及增加的堿性磷酸酶血清含量(圖82)；及圖83描繪Gly_CNP37制劑的降解速率常數(shù)(K。bs)在pH 3-8及5°C、25°C及40°C 下隨PH值變化的觀察曲線圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及CNP的新穎變體，其對(duì)NEP及/或NPR-C具有降低的親和力，且對(duì)NEP 的切割作用及/或NPR-C的清除作用具有降低的敏感性；包含此等CNP變體的醫(yī)藥組合物； 及使用此等CNP變體來治療CNP反應(yīng)性病癥的方法，這些病癥包括(但不限于)骨相關(guān)病癥(諸如軟骨發(fā)育不全)及與血管平滑肌細(xì)胞及組織相關(guān)的病癥。A.定義除非另作說明，否則本申請(qǐng)案(包括說明書及申請(qǐng)專利范圍)中所用的以下術(shù)語具有下文給出的定義。除非上下文另有明確規(guī)定，否則如說明書及隨附申請(qǐng)專利范圍中所用，不定冠詞” 一”及定冠詞”該/這些”包括復(fù)數(shù)個(gè)以及單數(shù)個(gè)所指物。術(shù)語”約”或”大約”指如一般技術(shù)者所測(cè)定的特定值具有可接受的誤差，其部分視量測(cè)或測(cè)定該值的方式而定。在某些實(shí)施例中，術(shù)語”約”或”大約”指在1、2、3或4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差內(nèi)。在某些實(shí)施例中，術(shù)語”約”或”大約”指在指定值或范圍的30^^25^^20%, 15%,10%,9%,8%,7%,6%,5%,4%,3%,2%,1%>0. 5%或 0. 05% 以內(nèi)。每當(dāng)術(shù)語”約” 或”大約”置于一系列兩個(gè)或兩個(gè)以上數(shù)值中的第一個(gè)數(shù)值之前時(shí)，應(yīng)了解術(shù)語”約”或”大約，，適用于該系列中的每個(gè)數(shù)值。術(shù)語”環(huán)境溫度”及”室溫”在本文中可互換使用且指周圍環(huán)境(例如進(jìn)行反應(yīng)或儲(chǔ)存組合物的空間)的溫度。在某些實(shí)施例中，環(huán)境溫度或室溫為約15°C至約^°C，或約 15°C至約25°C，或約20°C至約28 V，或約20 V至約25°C，或約22°C至約28 V，或約22°C至約25°C的范圍。在其它實(shí)施例中，環(huán)境溫度或室溫為約15°C、16°C、17V、18°C、19°C、20°C、 21°C、22°C、23°C、24°C、25°C、26°C、27°C或 28°C。標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)術(shù)語的定義可見于參考著作中，包括Carey及Sundberg，AdvancedOrganic Chemistry (高等有機(jī)化學(xué))第3版，A及B卷(Plenum Press,紐約1992)。除非另有規(guī)定，否則本發(fā)明的實(shí)施可采用在此項(xiàng)技術(shù)的技能內(nèi)的合成有機(jī)化學(xué)、質(zhì)譜分析、制備型及分析型層析、蛋白質(zhì)化學(xué)、生物化學(xué)、重組DNA技術(shù)及藥理學(xué)的某些習(xí)知方法。例如參看 Τ· E· Creighton，Proteins :Structures and Molecular Properties (蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)禾口分子特性)(W. H. Freeman 和公司，1993) ；A. L Lehninger, Biochemistry (生物化學(xué))(Worth 出版公司，第 4 版，2004) ；Sambrook 等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè))(第 2 版，1989) ；Methods In Enzymology (酶學(xué)方法)(S. Colowick 及 N. Kaplan編，Academic Press,Inc.) ；Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington 藥典)第 18 片反(Easton，Pennsylvania :Mack Publishing Company, 1990)。本文中(無論上文或下文)所引用的所有公開案、專利及專利申請(qǐng)案均以全文引用的方式并入本文中。本文通篇使用以下氨基酸縮寫丙氨酸Ala(A)精氨酸Arg (R)天冬酰胺Asn (N)天冬氨酸Asp (D)半胱氨酸Cys (C)谷氨酰胺Gln (Q)谷氨酸Glu(E)甘氨酸Gly (G)組氨酸His(H)異亮氨酸Ile(I)亮氨酸Leu(L)賴氨酸Lys (K)甲硫氨酸Met (M)苯丙氨酸Phe (F)脯氨酸Pro(P)絲氨酸Ser (S)蘇氨酸Thr(T)色氨酸Trp (W)酪氨酸Tyr⑴纈氨酸Val (V)“多肽”及”蛋白質(zhì)”指由經(jīng)由肽鍵或肽鍵等構(gòu)物連接的氨基酸殘基、其天然存在的相關(guān)結(jié)構(gòu)變體及非天然存在的合成類似物構(gòu)成的聚合物。合成多肽可例如使用自動(dòng)化多肽合成器來合成。術(shù)語”多肽”及”蛋白質(zhì)”不限于產(chǎn)物的最小長度。術(shù)語”蛋白質(zhì)”通常指較大多肽。術(shù)語”肽”通常指較短多肽。因此，肽、寡肽、二聚體、多聚體及其類似物均包括于該定義內(nèi)。該定義包括全長蛋白質(zhì)與其片段。術(shù)語”多肽”及”蛋白質(zhì)”亦包括多肽或蛋白質(zhì)的表達(dá)后修飾，例如糖基化、乙?；⒘姿峄捌漕愃菩揎?。此外，出于本文的目的，”多肽” 可包括對(duì)原生序列的”修飾”，諸如缺失、添加、取代(其性質(zhì)上可具有保守性，或可包括用以下取代人類蛋白質(zhì)中通常存在的20種氨基酸中的任一者，或任何其它天然或非天然存在的氨基酸或非典型氨基酸)及化學(xué)修飾(例如添加肽模擬物或以肽模擬物取代)。此等修飾可為有意的，如經(jīng)由定點(diǎn)突變誘發(fā)，或經(jīng)由氨基酸的化學(xué)修飾以移除或連接化學(xué)部分，或可為意外的，諸如經(jīng)由產(chǎn)生蛋白質(zhì)的宿主引起的突變，或經(jīng)由因PCR擴(kuò)增所致的錯(cuò)誤。在本文中使用習(xí)知符號(hào)來描繪多肽序列多肽序列的左手端為氨基端；多肽序列的右手端為羧基端?！氨Ｊ匦匀〈毕抵付嚯闹械陌被峤?jīng)功能上、結(jié)構(gòu)上或化學(xué)上類似的天然或非天然氨基酸取代。在一實(shí)施例中，以下群組各自含有彼此可保守性取代的天然氨基酸(1)丙氨酸(A)、絲氨酸⑶、蘇氨酸⑴；(2)天冬氨酸⑶、谷氨酸(E)；
(3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；(4)精氨酸(R)、賴氨酸(K)；(5)亮氨酸⑴、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)；及(6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸⑴、色氨酸(W)。在另一實(shí)施例中，以下群組各自含有彼此可保守性取代的天然氨基酸(1)甘氨酸(G)、丙氨酸㈧；(2)天冬氨酸⑶、谷氨酸(E)；(3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；(4)精氨酸(R)、賴氨酸⑷；(5)亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)、丙氨酸(A)；(6)丙氨酸(F)、酪氨酸⑴、色氨酸(W)；及(7)絲氨酸⑶、蘇氨酸⑴、半胱氨酸(C)。在另一實(shí)施例中，氨基酸可如下所述來分組。(1)疏水性Met、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp ；(2)中性親水性=Cys, Ser, Thr, Asn, Gln ；(3)酸性Asp、Glu ；(4)堿性His、Lys、Arg ；(5)影響主鏈取向的殘基Gly、Pro ’及(6)芳族Trp、Tyr、Phe、Hi s。在一實(shí)施例中，本文所述的肽或多肽系使用編碼CNP變體的多核苷酸經(jīng)由重組方式產(chǎn)生。因此，本文包括編碼本文所述的任何CNP變體的多核苷酸，包含此等多核苷酸視情況連接至表達(dá)控制序列的宿主細(xì)胞或載體，及使用此等多核苷酸、載體或宿主細(xì)胞來產(chǎn)生本文的CNP變體的方法。由此等多核苷酸表達(dá)的CNP變體可藉由包括以下的方法產(chǎn)生在適于表達(dá)編碼CNP變體的多核苷酸的條件下，使宿主細(xì)胞在培養(yǎng)基中生長，及自宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基分離表達(dá)產(chǎn)物。實(shí)際表達(dá)產(chǎn)物可視任何轉(zhuǎn)譯后加工而與所編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物略微不同。“多核苷酸”系指由核苷酸單元構(gòu)成的聚合物。多核苷酸包括天然存在的核酸，諸如脫氧核糖核酸(“DNA”)及核糖核酸(“RNA”)以及核酸類似物。術(shù)語”核酸”通常系指較大多核苷酸。術(shù)語”寡核苷酸”通常系指一般不超過約50個(gè)核苷酸的較短多核苷酸。應(yīng)了解，當(dāng)將核苷酸序列以DNA序列(亦即A、T、G、C)表示時(shí)，核苷酸序列亦包括”U”置換”Τ” 的RNA序列(亦即A、U、G、C)?！眂DNA”系指與mRNA互補(bǔ)或相同的呈單股或雙股形式的DNA。“表達(dá)控制序列”指調(diào)控其所可操作地連接的核苷酸序列的表達(dá)的核苷酸序列。” 可操作地連接”系指兩個(gè)部分之間的功能關(guān)系，其中一部分的活性(例如調(diào)控轉(zhuǎn)錄的能力) 引起對(duì)另一部分的作用(例如序列的轉(zhuǎn)錄)。表達(dá)控制序列可包括(例如且不限于)啟動(dòng)子(例如誘導(dǎo)性或組成性啟動(dòng)子)、強(qiáng)化子、轉(zhuǎn)錄終止子、起始密碼子(亦即ATG)、內(nèi)含子的拼接信號(hào)及終止密碼子的序列?！爸亟M多核苷酸”指具有在天然狀態(tài)下并不聯(lián)接在一起的序列的多核苷酸。經(jīng)擴(kuò)增或組裝的重組多核苷酸可包括于適合載體中，且該載體可用于轉(zhuǎn)化適合宿主細(xì)胞。將包含重組多核苷酸的宿主細(xì)胞稱作”重組宿主細(xì)胞”。接著于重組宿主細(xì)胞中表達(dá)基因以產(chǎn)生例如”重組多肽”。重組多核苷酸亦可提供非編碼功能(例如啟動(dòng)子、復(fù)制起點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)等)。如本文中所用，”嵌合體”指包含至少兩個(gè)異源多核苷酸或多肽序列(亦即，來源于不同來源或彼此無關(guān)的天然存在的序列)的多核苷酸或多肽，這些異源多核苷酸或多肽序列系使用此項(xiàng)技術(shù)中通常已知的技術(shù)(例如重組表達(dá)或化學(xué)交聯(lián))直接或間接連接在一起。在一實(shí)施例中，異源序列可包含蛋白質(zhì)或肽直接或間接連接至CNP肽或變體，包括可自 CNP肽或變體切割的蛋白質(zhì)或肽。在一相關(guān)實(shí)施例中，CNP變體為如本文所述的嵌合體。在某些實(shí)施例中，嵌合體包括包含可切割載體蛋白或肽標(biāo)簽的CNP融合蛋白。術(shù)語”可切割載體蛋白”或”切割可切割肽標(biāo)簽”指可直接或經(jīng)由接頭間接融合至異源多肽序列，且可使用使切割可切割肽或多肽自異源多肽或蛋白質(zhì)切割或分離的試劑自異源序列移除的肽或多肽序列。在一些實(shí)施例中，可切割載體蛋白或肽標(biāo)簽改良融合蛋白或異源多肽的產(chǎn)生、純化及/或偵測(cè)。例示性可切割載體蛋白及肽標(biāo)簽包括(但不限于)人類轉(zhuǎn)錄因子 TAF12(TAF12)、酮類固醇異構(gòu)酶(KSI)、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、β -半乳糖苷酶(β-Gal)、 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、硫氧還蛋白(Trx)、殼多糖結(jié)合域(CBD)、BMP-2突變(BMPM)、 SUMO、CAT、TrpE、葡萄球菌蛋白Α、鏈球菌蛋白、淀粉結(jié)合蛋白、內(nèi)葡聚糖酶A的纖維素結(jié)合域、外葡聚糖酶Cex的纖維素結(jié)合域、生物素結(jié)合域、recA、Flag、C-MyC、聚(His)、聚(Arg)、 聚(Asp)、聚(Gin)、聚(Phe)、聚(Cys)、綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、青色熒光蛋白、生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素、抗體表位及其片段。“切割劑”為適用于自異源多肽或蛋白質(zhì)切割或分離例如可切割肽或多肽的試劑。 例示性切割劑包括(但不限于)鈀、溴化氰(CNBr)、甲酸、羥胺、梭菌蛋白酶、凝血酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胰蛋白酶樣蛋白酶、羧肽酶、腸激酶(腸肽酶)、Kex 2蛋白酶、Omp T蛋白酶、因子)(a蛋白酶、枯草桿菌蛋白、proTEV、SUMO蛋白酶、V8蛋白酶、HIV蛋白酶、鼻病毒蛋白酶、變種枯草桿菌蛋白酶、IgA蛋白酶、人類I^ce蛋白酶、膠原酶、Nia蛋白酶、脊髓灰白質(zhì)炎病毒2Apro蛋白酶、脊髓灰白質(zhì)炎病毒3C蛋白酶、genenase、弗林蛋白酶、彈性蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、皺胃酶(凝乳酶)、微生物天冬氨酸蛋白酶、木瓜酶、鈣蛋白酶、木瓜凝乳酶、無花果酶(無花果蛋白酶)、菠蘿酶(菠蘿蛋白酶)、組織蛋白酶B、卡斯蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、內(nèi)切蛋白酶Arg-C、內(nèi)切蛋白酶Glu-C、內(nèi)切蛋白酶Lys-C、胰舒血管素及纖維蛋白溶酶。在兩個(gè)或兩個(gè)以上多核苷酸或多肽序列的情形中，術(shù)語”相同”或”相同性”百分比系指當(dāng)比較及對(duì)準(zhǔn)以獲得最大對(duì)應(yīng)性時(shí)，如使用一種以下序列比較算法或藉由目測(cè)來量測(cè)，兩個(gè)或兩個(gè)以上序列或子序列相同或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸殘基。在兩個(gè)核酸或多肽的情形中，詞組”實(shí)質(zhì)上同源”或”實(shí)質(zhì)上相同”一般指當(dāng)比較及對(duì)準(zhǔn)以獲得最大對(duì)應(yīng)性時(shí)，如使用一種以下序列比較算法或藉由目測(cè)所量測(cè)，兩個(gè)或兩個(gè)以上序列或子序列具有至少40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %或98 %核苷酸或氨基酸殘基相同性。在某些實(shí)施例中，實(shí)質(zhì)同源性或相同性存在于長度為至少約25、50、100或 150個(gè)殘基的序列的區(qū)域上。在另一實(shí)施例中，這些序列在比較生物聚合物中任一者或兩者的整個(gè)長度上實(shí)質(zhì)上同源或相同。對(duì)于序列比較，通常以一個(gè)序列充當(dāng)參考序列，用于與測(cè)試序列相比較。當(dāng)使用序列比較算法時(shí)，將測(cè)試序列及參考序列輸入計(jì)算機(jī)，必要時(shí)指定子序列坐標(biāo)，且指定序列算
43法的程序參數(shù)。接著由序列比較算法依據(jù)所指定的程序參數(shù)，計(jì)算測(cè)試序列相對(duì)于參考序列的序列相同性百分比。供比較的序列的最佳對(duì)準(zhǔn)可由以下來進(jìn)行例如Smith及Waterman，Adv. Appl. Math.(高等應(yīng)用數(shù)學(xué))，2 :482(1981)的局部同源性算法、Needleman及mmsch， J. Mol. Biol.(分子生物學(xué)雜志)，48 443 (1970)的同源性對(duì)準(zhǔn)算法、Pearson及Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci.USA,85 :2444(1988)的相似性搜尋法、此等算法的計(jì)算機(jī)化實(shí)施 (Wisconsin Genetics 軟件包中的 GAP、BESTFIT、FASTA 及 TFASTA，Genetics Computer Group (遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組)，575 Science Dr.，Madison，WI)，或目測(cè)。適用算法的一實(shí)例為 PILEUP,其使用 Feng 及 Doolittle，J. Mol. Evo 1.(分子進(jìn)化學(xué)雜志)，35 :351-360 (1987) 的漸進(jìn)式對(duì)準(zhǔn)法的簡化形式且類似于Higgins及Sharp，CABI0S，5 :151-153(1989)所描述的方法。適用于產(chǎn)生序列多重對(duì)準(zhǔn)的另一算法為Clustal W(Thompson等人，Nucleic Acids Research (核酸研究)，22 :4673-4680 (1994))。適用于測(cè)定序列相同性及序列相似性百分比的算法實(shí)例為BLAST算法(Altschul等人，J. Mol. Biol.(分子生物學(xué)雜志)， 215 :403-410(1990) ；Henikoff 及 Henikoff，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 :10915(1989)； Karlin 及 Altschul，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 :5873-5787 (1993))。執(zhí)行 BLAST 分析的軟件可經(jīng)由國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information) 公開獲得。如下所述，兩個(gè)核酸序列或多肽實(shí)質(zhì)上同源或相同的另一指標(biāo)為第一核酸所編碼的多肽可與第二核酸所編碼的多肽發(fā)生免疫交叉反應(yīng)。因此，例如當(dāng)一多肽與第二多肽不同的處僅在于保守性取代時(shí)，該兩種多肽通常實(shí)質(zhì)上相同。如本文所述，兩個(gè)核酸序列實(shí)質(zhì)上相同的另一指標(biāo)為兩個(gè)分子在嚴(yán)格條件下彼此雜交?！皩?shí)質(zhì)上純”或”經(jīng)分離”指目標(biāo)物質(zhì)為主要存在物質(zhì)(亦即以摩爾濃度計(jì)，比組合物中任何其它個(gè)別大分子物質(zhì)的豐度高)，且實(shí)質(zhì)上純化的部分為目標(biāo)物質(zhì)占所存在的所有大分子物質(zhì)的至少約50% (以摩爾濃度計(jì))的組合物。在一實(shí)施例中，實(shí)質(zhì)上純的組合物指，以摩爾濃度或重量計(jì)，相關(guān)物質(zhì)占組合物中所存在大分子物質(zhì)的至少約70%、75%、 80^^85%,90^^95^^98%或更高。若組合物基本上由單一大分子物質(zhì)組成，則目標(biāo)物質(zhì)經(jīng)純化至基本均質(zhì)(藉由習(xí)知偵測(cè)方法在組合物中不可偵測(cè)到污染物質(zhì))。出于此定義的目的，溶劑物質(zhì)、小分子(< 500道爾頓)、穩(wěn)定劑(例如BSA)及元素離子物質(zhì)不被視為大分子物質(zhì)。在一實(shí)施例中，本文的化合物為實(shí)質(zhì)上純或經(jīng)分離。在另一實(shí)施例中，本文的化合物相對(duì)于其制造中所用的大分子起始物質(zhì)為實(shí)質(zhì)上純或經(jīng)分離。在另一實(shí)施例中，本文的醫(yī)藥組合物包含實(shí)質(zhì)上純或經(jīng)分離的CNP變體與一或多種醫(yī)藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑及視情況與另一生物活性劑混合。如應(yīng)用于目標(biāo)的”天然存在”指該目標(biāo)可見于自然界的事實(shí)。舉例而言，存在于生物體(包括病毒)中且未經(jīng)人類在實(shí)驗(yàn)室中有意修飾的多肽或多核苷酸序列為天然存在的。在一實(shí)施例中，”天然存在的”物質(zhì)具有人類來源。“野生型” (Wt)為提及物種的多核苷酸、多肽或蛋白質(zhì)的天然形式(包括序列)的術(shù)語。野生型形式有別于自遺傳突變產(chǎn)生的多核苷酸、多肽或蛋白質(zhì)的突變形式。 在一實(shí)施例中，作為第二多肽的”類似物”或”變體”或”衍生物”的第一多肽為與該第二多肽具有至少約50^^60%或70%序列同源性但小于100%序列同源性的多肽。此等類似物、變體或衍生物可包含非天然存在的氨基酸殘基(包括(但不限于)高精氨酸、鳥氨酸、青霉胺及正纈氨酸)以及天然存在的氨基酸殘基。此等類似物、變體或衍生物亦可由一個(gè)或復(fù)數(shù)個(gè)D-氨基酸殘基構(gòu)成，且亦可含有肽模擬物或肽鍵等構(gòu)物，諸如兩個(gè)或兩個(gè)以上氨基酸或肽模擬物殘基之間的非肽鍵。在另一實(shí)施例中，若第一多肽不為第二多肽的已知切割產(chǎn)物或不為第二多肽的已知前體，則即使第一多肽與第二多肽具有100%序列同源性或其具有野生型序列，第一多肽仍為該第二多肽的”類似物”、，，變體”或”衍生物”。在一實(shí)施例中，如本文中所用，術(shù)語”來源于”系指多肽或肽序列系基于野生型或天然存在的多肽或肽序列且可具有天然氨基酸、非天然氨基酸或肽模擬物的一或多個(gè)缺失、添加及/或取代。在一實(shí)施例中，衍生序列與野生型或天然存在的序列共享至少約 40 %、50 %、60 %或70 %但小于100 %的序列相似性。在另一實(shí)施例中，衍生物可為多肽的片段，其中該片段與野生型多肽在至少約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個(gè)氨基酸的長度上實(shí)質(zhì)上同源(例如至少約70%、75%、80%、85%、90%或95%同源)。在又一實(shí)施例中，若多肽具有野生型多肽上所不存在的部分(例如聚合物，諸如PEG)與其直接或間接連接，則即使該兩種多肽的氨基酸序列共享100%同源性，該多肽仍”來源于”該野生型多肽。如本文中所用，”NPPC來源的”多肽系指來源于利鈉肽前體C(NPPC)多肽的多肽， 其為1 個(gè)氨基酸的單鏈前原多肽且在切割后最終產(chǎn)生wtCNP22。將信號(hào)肽自NPPC移除得到原CNP，且以內(nèi)切蛋白酶弗林蛋白酶進(jìn)一步切割產(chǎn)生53個(gè)氨基酸的活性肽(CNP-53)，其經(jīng)分泌且經(jīng)未知酶再切割，產(chǎn)生22個(gè)氨基酸的成熟肽(CNP或CNP-22)。因此，CNP22本身因來源于NPPC而為”NPPC來源的”多肽。在一實(shí)施例中，NPPC來源的多肽與野生型NPPC 在相同數(shù)目的氨基酸殘基上至少約40 %、50 %、60 %、70 %、75 %、80 %、85 %、90 %或95 % 同源。進(jìn)一步預(yù)期，NPPC來源的肽可包含NPPC多肽的約1至約53個(gè)，或1至37個(gè)，或1 至35個(gè)，或1至31個(gè)，或1至27個(gè)，或1至22個(gè)，或10至35個(gè)，或約15至約37個(gè)殘基。 在一實(shí)施例中，NPPC來源的肽可包含具有來源于NPPC多肽的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、 37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52 或 53 個(gè)氨基酸的序列。術(shù)語”有效量”指足以對(duì)個(gè)體的健康狀況、病理學(xué)或疾病產(chǎn)生所需結(jié)果或用于診斷目的的劑量。所需結(jié)果可包含劑量接受者的主觀或客觀改良?！敝委熡行Я俊敝笇?duì)健康有效產(chǎn)生預(yù)定有利作用的藥劑量。任何個(gè)別情況下的適當(dāng)”有效”量均可由一般技術(shù)者使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)來決定。應(yīng)了解，用于任何特定患者的特定劑量濃度及給藥頻率均可改變且將視多種因素而定，包括所用特定化合物的活性；該化合物的生物可用性、代謝穩(wěn)定性、排泄速率及作用時(shí)長；化合物的給予模式及時(shí)間；患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別及膳食；及特定病狀的嚴(yán)重度?！爸委煛敝割A(yù)防性治療或治療性治療或診斷性治療。在某些實(shí)施例中，”治療”指出于治療、預(yù)防或診斷目的給予個(gè)體化合物或組合物?！邦A(yù)防性”治療為出于降低產(chǎn)生病變的風(fēng)險(xiǎn)的目的給予未顯示疾病征兆或僅顯示疾病早期征兆的個(gè)體的治療。可以預(yù)防性治療的形式給予本文的化合物或組合物以降低產(chǎn)生病變的可能性或若已產(chǎn)生則將病變的嚴(yán)重度降至最小?！爸委熜浴敝委煘榻o予顯示病變征兆或癥狀的個(gè)體以用于減弱或消除彼等征兆或癥狀的目的的治療。這些征兆或癥狀可為生化、細(xì)胞、組織、功能或身體、主觀或客觀征兆或癥狀。本文的化合物亦可以治療性治療的形式給予或給予用于診斷。“診斷”指鑒別病理學(xué)病狀的存在、程度及/或性質(zhì)。診斷方法在其特異性及選擇性方面不同。盡管特定診斷方法可能不提供病狀的確診，但該方法若能提供有助于診斷的正面指示則已足夠?！肮腔蜍浌窍嚓P(guān)生物標(biāo)記”或”骨或軟骨相關(guān)標(biāo)記”指生長因子、酶、蛋白質(zhì)或其它可偵測(cè)生物物質(zhì)或部分，其含量與例如軟骨更新(cartilage turnover)、軟骨形成、軟骨生長、骨吸收、骨形成、骨生長或其組合相關(guān)而增加或降低。此等生物標(biāo)記可在給予如本文所述的CNP變體之前、期間及/或之后量測(cè)。例示性骨或軟骨相關(guān)生物標(biāo)記包括(但不限于) CNP、cGMP、第II型膠原蛋白的前肽及其片段、II型膠原蛋白及其片段、I型膠原蛋白的前肽及其片段、I型膠原蛋白及其片段、骨鈣化素、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、聚集蛋白聚糖硫酸軟骨素及堿性磷酸酶?？稍谌魏芜m當(dāng)生物樣品(包括(但不限于)組織、血液、血清、血漿、腦脊髓液、滑液及尿)中量測(cè)軟骨及骨相關(guān)生物標(biāo)記。在一些實(shí)施例中，在來自經(jīng)歷功效/藥效學(xué)活體內(nèi)研究的動(dòng)物及/或來自離體研究的條件培養(yǎng)基的血液、血漿或血清中量測(cè)生物標(biāo)記。在某些實(shí)施例中，量測(cè)至少一種骨或軟骨相關(guān)生物標(biāo)記的含量，且可根據(jù)所量測(cè)生物標(biāo)記含量來調(diào)節(jié)給予個(gè)體的CNP變體的給予量或頻率。在一些實(shí)施例中，生物標(biāo)記的含量”低于目標(biāo)含量”或”高于目標(biāo)含量”。生物標(biāo)記的目標(biāo)含量為在接受CNP變體的個(gè)體中觀察到治療作用時(shí)生物標(biāo)記的含量或含量范圍。在某些實(shí)施例中，患有CNP反應(yīng)性病癥或病狀的個(gè)體的生物標(biāo)記目標(biāo)含量為在未受影響的正常個(gè)體中觀察到的生物標(biāo)記的含量或含量范圍。在其它實(shí)施例中，為指示治療作用，生物標(biāo)記的目標(biāo)含量不需要與在正常個(gè)體中觀察到的生物標(biāo)記的含量或含量范圍相等，但可在未受影響的個(gè)體中觀察到的生物標(biāo)記的”正?！焙炕蚝糠秶睦?00%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、 10%或5%以內(nèi)。舉例而言，若生物標(biāo)記含量與骨或軟骨形成或生長相關(guān)而增加，則指示治療作用的生物標(biāo)記的目標(biāo)含量可高于未經(jīng)給予CNP變體的患CNP反應(yīng)性病癥的患者中生物標(biāo)記的含量，且可視情況低于未患該病癥的個(gè)體中生物標(biāo)記的”正常”含量、大致等于該生物標(biāo)記的”正?！焙?，或高于該生物標(biāo)記的”正常”含量。在一實(shí)施例中，若生物標(biāo)記的含量低于目標(biāo)含量，則表明治療作用不足，可能需要增加所給予CNP變體的給予量或頻率。在一相關(guān)實(shí)施例中，若生物標(biāo)記高于目標(biāo)含量，則表明已給予多于必要量的CNP變體，可能需要降低所給予CNP變體的給予量或頻率。再舉一實(shí)例，若生物標(biāo)記的含量與骨或軟骨形成或生長相關(guān)而降低，則指示治療作用的生物標(biāo)記的目標(biāo)含量可低于未經(jīng)給予CNP變體的患CNP反應(yīng)性病癥的患者中生物標(biāo)記的含量，且可視情況高于未患該病癥的個(gè)體中生物標(biāo)記的”正?！焙?、大致等該生物標(biāo)記的”正?！焙浚虻陀谠撋飿?biāo)記的”正常”含量。在該種情況下，可能適用上述調(diào)節(jié)CNP 變體給予量及頻率的相反情況。“醫(yī)藥組合物”指在個(gè)體動(dòng)物(包括人類及哺乳動(dòng)物)中適用于醫(yī)藥用途的組合物。醫(yī)藥組合物包含治療有效量的CNP變體、視情況選用的另一生物活性劑，及視情況選用的醫(yī)藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑。在一實(shí)施例中，醫(yī)藥組合物包含包含以下的組合物活性成分，及構(gòu)成載體的惰性成分，以及經(jīng)由任何兩種或兩種以上成分的組合、復(fù)合或聚集，或經(jīng)由一或多種成分的解離，或經(jīng)由一或多種成分的其它類型的反應(yīng)或相互作用直接或間接產(chǎn)生的任何產(chǎn)物。因此，本文的醫(yī)藥組合物包括混合本文的化合物與醫(yī)藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑所制得的任何組合物?！搬t(yī)藥學(xué)上可接受的載體”指任何標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)藥載體、緩沖劑及其類似物，諸如磷酸鹽緩沖鹽水溶液、5%葡聚糖水溶液，及乳液(例如油/水或水/油乳液)。賦形劑的非限制性實(shí)例包括佐劑、黏合劑、填充劑、稀釋劑、崩解劑、乳化劑、濕潤劑、潤滑劑、助流劑、甜味劑、 調(diào)味劑及著色劑。適合醫(yī)藥載體、賦形劑及稀釋劑描述于Remington藥典(Remington藥典)第19版(Mack Publishing Co.，Easton，1995)中。較佳醫(yī)藥載體視活性劑的預(yù)定給予模式而定。典型給予模式包括經(jīng)腸(例如經(jīng)口)或非經(jīng)腸(例如皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)注射；或表面、經(jīng)皮或經(jīng)黏膜給予)?！搬t(yī)藥學(xué)上可接受的鹽”為可調(diào)配為醫(yī)藥用化合物的鹽，包括(但不限于)金屬鹽 (例如鈉、鉀、鎂、鈣等)及氨或有機(jī)胺的鹽?！搬t(yī)藥學(xué)上可接受”或”藥理學(xué)上可接受”指并非在生物學(xué)上或其它方面不合需要的物質(zhì)，亦即該物質(zhì)可給予個(gè)體而不會(huì)引起任何不合需要的生物作用，或不會(huì)以有害方式與含其的組合物中的任何組分或與個(gè)體的身體上或體內(nèi)所存在的任何組分相互作用。術(shù)語”單位劑型”系指適于以單一劑量形式用于人類及動(dòng)物個(gè)體的實(shí)體不連續(xù)單元，各單元以足以產(chǎn)生所需作用的量計(jì)算含有預(yù)定量的本文的化合物，視情況與醫(yī)藥學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑、載體或載體結(jié)合。本文的新穎單位劑型的規(guī)格視以下而定所用特定化合物及欲達(dá)成的效果，及宿主中與各化合物相關(guān)的藥效學(xué)?！吧頎顩r”指動(dòng)物(例如人類)體內(nèi)的狀況。生理狀況包括(但不限于)體溫， 及生理性離子強(qiáng)度的水性環(huán)境、PH值及酶。生理狀況亦包括特定個(gè)體體內(nèi)不同于大多數(shù)個(gè)體中存在的”正?！睜顩r的狀況，例如這些狀況不同于約37°C的正常人類體溫或不同于約 7.4的正常人類血液pH值?！吧韕H值”或”生理學(xué)范圍內(nèi)的pH值”指在包括約7. 0至8. 0在內(nèi)的范圍內(nèi)、較通常在包括約7. 2至7. 6在內(nèi)的范圍內(nèi)的pH值。如本文中所使用，術(shù)語”個(gè)體”包括哺乳動(dòng)物及非哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物的實(shí)例包括 (但不限于)哺乳動(dòng)物綱的任何成員人類、非人類靈長類動(dòng)物(諸如黑猩猩)，及其它猿及猴物種；農(nóng)畜，諸如牛、馬、綿羊、山羊、豬；家畜，諸如兔、犬及貓；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，包括嚙齒動(dòng)物， 諸如大鼠、小鼠及天竺鼠，及其類似動(dòng)物。非哺乳動(dòng)物的實(shí)例包括(但不限于)鳥類、魚及其類似動(dòng)物。該術(shù)語不指定特定年齡或性別。除非另有指示，否則術(shù)語”聚乙二醇”、”PEG”、”聚環(huán)氧乙烷”及”ΡΕ0”在本文中可互換使用。經(jīng)由氨基偶聯(lián)至與數(shù)值η相關(guān)的”PEOn”聚合物的CNP肽(CNP22或其變體)一般具有式CH3-[-0-CH2CH2-]n-C( = 0)-NHR，其中η為環(huán)氧乙烷單元的數(shù)目且R表示肽的剩余部分。"PEOn”聚合物可視情況在羰基碳與重復(fù)的環(huán)氧乙烷單元之間具有伸烷基(CH2)m，其中 m為1至5的整數(shù)。該種"PEOn”(例如PE012或PE024)聚合物具有單分散性，亦即，其為具有特定分子量的單一不連續(xù)聚合物。類似地，經(jīng)由氨基偶聯(lián)至與數(shù)值nK相關(guān)的"ΡΕ&ιΚ”聚合物的CNP肽一般具有式CH3-[-O-CH2CH2-]P-C( = 0)_NHR，其中ρ為大于1的整數(shù)。"ΡΕ&ιΚ” 聚合物亦可視情況在羰基碳與重復(fù)的環(huán)氧乙烷單元之間具有伸烷基(CH2)m，其中m為1至 5的整數(shù)。然而，該種” PEGnK” (例如PEG1K、PEG2K、PEG5K或PEG20K)聚合物具有多分散性，亦即含有具有分子量分布的聚合物的混合物，其中數(shù)值nK表示聚合物的數(shù)目平均分子量(Mn)(以千道爾頓為單位)。舉例而言，偶聯(lián)至CNP肽的”PEGI”表示具有數(shù)目平均分子量為約2kDa的聚合物的多分散性PEG聚合物。除非另作明確指示，否則當(dāng)指定聚合物(例如PEG)的質(zhì)量范圍(例如以kDa為單位)時(shí)，該范圍指聚合物數(shù)目平均分子量的范圍，而非多分散性混合物中多種聚合物的分子量的范圍。術(shù)語”鹵素”、，，鹵化物”或”鹵基”系指氟、氯、溴及/或碘。術(shù)語”烷基”指直鏈或支鏈飽和單價(jià)烴基，其中烷基可視情況經(jīng)一或多個(gè)如本文所述的取代基Q取代。在某些實(shí)施例中，烷基為具有1至20個(gè)(C1-JU至15個(gè)(CV15)U至 12個(gè)(CV12)U至10個(gè)(C1,)或1至6沁_(dá)6)個(gè)碳原子的直鏈飽和單價(jià)烴基，或具有3至 20 個(gè)(C3_J、3 至 15 個(gè)(C3_15)、3 至 12 個(gè)(C3_12)、3 至 10 個(gè)(C3_10)或 3 至 6 (C3_6)個(gè)碳原子的支鏈飽和單價(jià)烴基。如本文中所使用，直鏈Ch6及支鏈c3_6烷基亦稱為”低碳烷基”。烷基的實(shí)例包括(但不限于)甲基、乙基、丙基(包括所有異構(gòu)形式，包括正丙基及異丙基)、 丁基(包括所有異構(gòu)形式，包括正丁基、異丁基、仲丁基及叔丁基)、戊基(包括所有異構(gòu)形式)及己基(包括所有異構(gòu)形式)。舉例而言，Ch6烷基指具有1至6個(gè)碳原子的直鏈飽和單價(jià)烴基或具有3至6個(gè)碳原子的支鏈飽和單價(jià)烴基。術(shù)語”烷氧基”指-0-烷基。在某些實(shí)施例中，烷氧基可視情況經(jīng)一或多個(gè)如本文所述的取代基Q取代。術(shù)語”鹵代烷基”指經(jīng)一或多個(gè)鹵原子取代的烷基。在某些實(shí)施例中，鹵代烷基系經(jīng)一、二、三、四、五或六個(gè)鹵原子取代。在某些實(shí)施例中，鹵代烷基可視情況經(jīng)一或多個(gè)如本文所述的其它取代基Q取代。術(shù)語”環(huán)烷基”指可視情況經(jīng)一或多個(gè)如本文所述的取代基Q取代的環(huán)狀飽和橋聯(lián)及/或非橋聯(lián)單價(jià)烴基。在某些實(shí)施例中，環(huán)烷基具有3至20(C3_J、3至15(C3_15)、3至 12 (C3_12)、3至10 (C3_1Q)或3至7 (C3_7)個(gè)碳原子。環(huán)烷基的實(shí)例包括(但不限于)環(huán)丙基、 環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、十氫萘基及金剛烷基。術(shù)語”雜環(huán)基”或”雜環(huán)”指單環(huán)非芳族環(huán)系統(tǒng)或含有至少一個(gè)非芳族環(huán)的多環(huán)系統(tǒng)，其中一或多個(gè)非芳族環(huán)原子為獨(dú)立地選自0、S或N的雜原子，且其余非芳族環(huán)原子為碳原子。在某些實(shí)施例中，雜環(huán)基或雜環(huán)基團(tuán)具有3至20個(gè)、3至15個(gè)、3至10個(gè)、3 至8個(gè)、4至7個(gè)或5至6個(gè)環(huán)原子。在某些實(shí)施例中，雜環(huán)基為單環(huán)、雙環(huán)、三環(huán)或四環(huán)系統(tǒng)，其可包括稠合或橋聯(lián)的環(huán)系統(tǒng)，且其中氮或硫原子可視情況經(jīng)氧化，氮原子可視情況經(jīng)季銨化，且一些環(huán)可為部分或完全飽和，或?yàn)榉甲濉ｋs環(huán)基可于使得產(chǎn)生穩(wěn)定化合物的任何雜原子或碳原子處連接至主結(jié)構(gòu)。雜環(huán)基團(tuán)的實(shí)例包括(但不限于)吖啶基、氮雜草基、苯并咪唑基、苯并吲哚基、苯并異嚼唑基、苯并異_嗪基、苯并二噪烷基、苯并間二氧雜環(huán)戊烯基、苯并呋喃酮基、苯并呋喃基、苯并萘并呋喃基(benzonaphthofuranyl)、苯并吡喃酮基、苯并吡喃基、苯并四氫呋喃基、苯并四氫噻吩基、苯并噻二唑基、苯并噻唑基、苯并苯硫基、苯并三唑基、苯并硫代吡喃基、苯并嚼嗪基、苯并嘿唑基、苯并噻唑基、β -咔啉基、咔唑基、色滿基、色酮基、噌啉基、香豆素基、十氫異喹啉基、二苯并呋喃基、二氫苯并異噻嗪基、二氫苯并異_嗪基、二氫呋喃基、二氫吡喃基、二氧戊環(huán)基、二氫吡嗪基、二氫吡啶基、二氫吡唑基、二氫嘧啶基、二氫吡咯基、二氧戊環(huán)基、1，4-二噻烷基、呋喃酮基、呋喃基、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、咪唑并吡啶基、咪唑并噻唑基、吲唑基、吲哚啉基、吲嗪基、吲哚基、異苯并四氫呋喃基、異苯并四氫噻吩基、異苯并噻吩基、異色滿基、異香豆素基、異吲哚啉基、異吲哚基、異喹啉基、異噻唑烷基、異噻唑基、異嚼唑烷基、異B惡唑基、嗎啉基、萘啶基、八氫吲哚基、八氫異吲哚基、η惡二唑基、_唑烷酮基、卩惡唑烷基、嚼唑并吡啶基、嚼唑基、 環(huán)氧乙烷基(oxiranyl)、萘嵌二氮苯基、菲啶基、菲咯啉基(phenathrolinyl)、吩吡嗪基、 吩嗪基、吩噻嗪基基、吩_嗪基、酞嗪基、哌嗪基、哌啶基、4-哌啶酮基、喋啶基、嘌呤基、吡嗪基、批唑烷基、批唑基、噠嗪基、吡啶基、吡啶并吡啶基、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯啉基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、喹喔啉基、奎寧環(huán)基、四氫呋喃基(tetrahydrofuryl)、四氫呋喃基 (tetrahydrofurany 1 )、四氫異喹啉基、四氫吡喃基、四氫噻吩基、四唑基、噻二唑并嘧啶基、 噻二唑基、噻嗎啉基、噻唑烷基、噻唑基、噻吩基、三嗪基、三唑基及1，3，5-三噻烷基。在某些實(shí)施例中，雜環(huán)基團(tuán)可視情況經(jīng)一或多個(gè)如本文所述的取代基Q取代。術(shù)語”芳基”指含有至少一個(gè)芳族烴環(huán)的單環(huán)芳族基團(tuán)或多環(huán)單價(jià)芳族基團(tuán)。在某些實(shí)施例中，芳基具有6至20個(gè)(C6_2。)、6至15個(gè)(C6_15)或6至10(C6_10)個(gè)環(huán)原子。芳基的實(shí)例包括(但不限于)苯基、萘基、弗基、奧基、蒽基、菲基、芘基、聯(lián)苯及三聯(lián)苯。芳基亦指至少一個(gè)環(huán)為芳族且其它環(huán)可為飽和、部分不飽和或芳族的雙環(huán)或三環(huán)碳環(huán)，例如二氫萘基、茚基、二氫茚基及四氫萘基(萘滿基)。在某些實(shí)施例中，芳基可視情況經(jīng)一或多個(gè)如本文所述的取代基Q取代。術(shù)語”雜芳基”指含有至少一個(gè)芳族環(huán)的單環(huán)芳族基團(tuán)或多環(huán)芳族基團(tuán)，其中至少一個(gè)芳族環(huán)含有一或多個(gè)獨(dú)立地選自0、s及N的雜原子。雜芳基的各環(huán)可含有一或兩個(gè)0 原子、一或兩個(gè)S原子及/或一至四個(gè)N原子，限制條件為各環(huán)中雜原子的總數(shù)為四或四以下且各環(huán)含有至少一個(gè)碳原子。雜芳基可于使得產(chǎn)生穩(wěn)定化合物的任何雜原子或碳原子處連接至主結(jié)構(gòu)。在某些實(shí)施例中，雜芳基具有5至20個(gè)、5至15個(gè)或5至10個(gè)環(huán)原子。單環(huán)雜芳基的實(shí)例包括(但不限于)吡咯基、批唑基、批唑啉基、咪唑基、嗯唑基、異嗯唑基、 噻唑基、噻二唑基、異噻唑基、呋喃基、噻吩基、嘴二唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、噠嗪基及三嗪基。雙環(huán)雜芳基的實(shí)例包括(但不限于)吲哚基、苯并噻唑基、苯并P惡唑基、苯并噻吩基、喹啉基、四氫異喹啉基、異喹啉基、苯并咪唑基、苯并吡喃基、噴嗪基、苯并呋喃基、異苯并呋喃基、色原酮基、香豆素基、噌啉基、喹喔啉基、噴唑基、嘌呤基、吡咯并吡啶基、呋喃并吡啶基、噻吩并吡啶基、二氫異吲哚基及四氫喹啉基。三環(huán)雜芳基的實(shí)例包括(但不限于) 咔唑基、苯并吲哚基、菲咯啉基、吖啶基、菲啶基及咕噸基。在某些實(shí)施例中，雜芳基可視情況經(jīng)一或多個(gè)如本文所述的取代基Q取代。術(shù)語”視情況經(jīng)取代”意欲指基團(tuán)(包括烷基、烷氧基、鹵代烷基、環(huán)烷基、 雜環(huán)基、芳基及雜芳基)可經(jīng)一或多個(gè)取代基Q(在一實(shí)施例中，一、二、三或四個(gè)取代基Q)取代，其中各Q獨(dú)立地選自由以下組成的群氰基、鹵基、氧、硝基、(；_6烷基、 CV6烷氧基、鹵基-CV6烷基、C3_7環(huán)烷基、雜環(huán)基、C6_14芳基、雜芳基、-C (0) Re、-C (0) ORe、-C(O) NRfRg, -C (NRe) NRfRg、-ORe、-OC(O) R% -OC(O) 0R% -OC(O)NRfRg, -OC ( = NRe) NRfRg, -OS(O) R% -OS(O)2Re, -OS (0) NRfRg, -OS (0) 2NRfRg、-NRfRg, -NReC (0)Rf、-NReC (0) 0Rf, -NReC (0) NRfRg, -NReC ( = NRh) NRfRg, -NReS (0) Rf、-NReS (0) 2Rf、-NReS(O) NRfRg、-NReS (0) 2NRfRg、-SRe、-S (0) Re、-S (0) 2Re 及-S (0) 2NRfRg，其中各 Re、Rf、Rg 及 Rh 獨(dú)立地為氫、CV6烷基、C3_7環(huán)烷基、雜環(huán)基、C6_14芳基或雜芳基；或Rf及Rg連同其所連接的N原子一起形成雜環(huán)基。B. GNP 變體CNP22作為治療劑的用途受限于其在血漿中的短半衰期(J. Clin. Endocrinol. Metab.(臨床內(nèi)分泌代謝雜志)，78 1428-35 (1994))。在人類血漿中，CNP22的濃度通常小于5皮摩爾。在人體中，CNP22由NEP及NPR-C降解且自循環(huán)中清除(Growth Hormone&IGF Res. , 16 :S6-S14)。在使用全身性給予的CNP22的所有人類及動(dòng)物研究中，均已使用連續(xù)輸注來增加個(gè)體體內(nèi)的CNP22濃度。具有較長半衰期及至少類似程度功能性的CNP肽將有益于基于CNP的治療策略。CNP變體亦揭示于相關(guān)國際申請(qǐng)案第PCT/US08/84270號(hào)(以引用的方式明確并入本文中)中。本文提供對(duì)NEP及/或NPR-C具有降低的親和力，且對(duì)NEP的切割及NPR-C的清除作用具有降低的敏感性，但具有與野生型CNP22相比實(shí)質(zhì)上類似或更佳的功能性的CNP變體。CNP變體對(duì)NEP的切割及/或NPR-C的清除作用的敏感性降低將使變體的血漿或血清半衰期增加，藉此增加變體分布至目標(biāo)組織及部位且實(shí)現(xiàn)所需藥理學(xué)作用的機(jī)會(huì)。在某些實(shí)施例中，與wtCNP22相比，本文所述的CNP變體對(duì)NEP的切割及/或NPR-C的清除作用的活體外或活體內(nèi)敏感性至少降至約1/1. 5、1/2、1/2. 5、1/3、1/3. 5、1/4、1/4. 5或1/5，且與 wtCNP22相比，活體內(nèi)血漿或血清半衰期至少增至約1. 5倍、2倍、2. 5倍、3倍、3. 5倍、4倍、 4. 5倍或5倍，同時(shí)保留wtCNP22功能性的至少約50 %、60 %、70 %、80 %、90 %或100 %，或具有wtCNP22功能性至少約1. 5倍、2倍、2. 5倍、3倍、3. 5倍、4倍、4. 5倍或5倍大的功能性。可在活體外或活體內(nèi)研究中就一或多種與軟骨或骨形成或生長相關(guān)的生物標(biāo)記(例如 cGMP)的含量、在離體或活體內(nèi)研究中就特定骨的長度等來評(píng)估CNP功能性。NEP的天然底物較小且利鈉肽(約2. 2kDa至約3. 2kDa)為最大的天然底物。根據(jù)X射線結(jié)晶學(xué)分析，NEP活性位點(diǎn)深埋于中央腔隙內(nèi)部，從而有效限制底物分子大小不超過約3kDa (Oefner等人，J. Mol. Biol.(分子生物學(xué)雜志)，四6 :341-349 (2000))?；?NPR-B信號(hào)傳導(dǎo)研究，CNP-22的變體(諸如CNP_17(僅保留CNP22的環(huán)狀域Cys6-Cys22) 及CNP-53 (在N端具有31個(gè)氨基酸的延伸的CNP-22))仍可類似于2. 2kDa wtCNP-22結(jié)合并活化NPR-B。因此，本文包括在CNP22或其變體的N端及/或C端偶聯(lián)至天然聚合物(例如肽)及/或合成聚合物(例如PEG)的CNP變體，其顯示NEP抗性增強(qiáng)，但保留結(jié)合及活化NPR-B信號(hào)傳導(dǎo)受體的能力。在一實(shí)施例中，本文包括由以下通式表示的CNP變體(χ) -Cys6-Phe7-Gly8-Leu9-Lys10-Leu11-Asp12-Arg13-Ile14-Gly15-Serl6-Met17-Serl8-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22- (z) (SEQ ID NO :139)，或(χ) -Gly1-Leu2-Ser3-Lys4-Gly5-Cys6-Phe7-Gly8-Leu9-Lys10-Leu11-Asp12-Arg13-Ile H-Gly15-Ser16-Met17-Ser18-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22-(Z) (SEQ ID NO :140)，其中(χ)及(ζ)各自獨(dú)立地為本文所述的天然聚合物(例如含有至少一個(gè)氨基酸的肽序列)及/或合成聚合物(例如PEG)，使得CNP變體的總質(zhì)量的特征在于本文一般描述的范圍，例如在約2. 6kDa或2. 8kDa至約6kDa或7kDa的范圍內(nèi)。在一實(shí)施例中，Cys6至Cys22 的殘基形成環(huán)狀部分。在一實(shí)施例中，(χ)及/或(ζ)包含來源于NPPC或非CNP多肽(例如ANP、BNP、IgG等)的氨基酸延伸，其中該延伸含有1至40個(gè)、1至35個(gè)、1至31個(gè)、5至 35個(gè)、5至31個(gè)或5至15個(gè)氨基酸。在另一實(shí)施例中，CNP變體在CNP22的一或多個(gè)以下
50位置包含一或多個(gè)另一天然氨基酸、非天然氨基酸、肽模擬物及/或肽鍵等構(gòu)物的修飾及 / 或取代=GlyU Lys4、Gly5、Cys6、Phe7、Gly8、Leu9、LyslO、LeulU Ilel4、Glyl5、Serl6、 Metl7、Glyl9、Leu20 及 Gly21。 在另一實(shí)施例中，總質(zhì)量特征在于本文一般描述的范圍(例如約2. 6kDa或2. SkDa 至約6kDa或7kDa)，經(jīng)設(shè)計(jì)為增強(qiáng)對(duì)NEP降解的抗性的CNP變體系由以下通式表示
(χ) -Cys6-Phe7-Gly8-Leu9- (h) !O-Leu11-Asp12-Arg13-Ile14-Gly15-Ser16-Met17-Ser18-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22- (z) (SEQ ID NO :141)，或(χ) -Gly1-Leu2-Ser3- (b) 4 "Gly5-Cy S6-Phe7-Gl y8-Leu9- (h) 10-Leun-Asp12-Arg13-Ile H-Gly15-Ser16-Met17-Ser18-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22-(ζ) (SEQ ID NO :6)，其中(χ)為合成或天然聚合基團(tuán)，或其組合，其中合成聚合基團(tuán)的非限制性實(shí)例為 PEG(PEO)，且天然聚合基團(tuán)的非限制性實(shí)例為含有1至35個(gè)氨基酸且來源于以下的氨基酸序列NPPC或其具有取代及/或缺失的變體、ANP、BNP，或其它非CNP多肽或肽，諸如血清白蛋白、IgG、富含組氨酸的糖蛋白、纖連蛋白、纖維蛋白原、含鋅指多肽、骨織素或成纖維細(xì)胞生長因子2(FGF2)；(ζ)可不存在或可為合成或天然聚合基團(tuán)，或其組合，其中合成聚合基團(tuán)的非限制性實(shí)例為PEG，且天然聚合基團(tuán)的非限制性實(shí)例為來源于利鈉多肽(例如NPPC、CNP、ANP或 BNP)或非利鈉多肽(例如血清白蛋白或IgG)的氨基酸序列；且(b)及(h)可獨(dú)立地為該位置的野生型Lys，或可經(jīng)由保守性氨基酸取代或經(jīng)側(cè)鏈上不具有反應(yīng)性伯胺的任何天然或非天然氨基酸或肽模擬物(包括(但不限于)Arg、Gly、 6-羥基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gin、Glu或義！·)置換。在一實(shí)施例中，(b)為Arg。在另一實(shí)施例中，為提高NEP抗性，(b)不為Gly。在另一實(shí)施例中，(h)不為Arg。來源于NPPC或其變體的氨基酸序列的非限制性實(shí)例包括Arg,Glu-Arg,Gly-Ala-Asn-Lys-Lys(SEQ ID NO 7),Gly-Ala-Asn-Arg-Arg(SEQ ID NO 8),Gly-Ala-Asn-Pro-Arg(SEQ ID NO 9),Gly-Ala-Asn-Gln-Gln(SEQ ID NO: 10)，Gly-Ala-Asn-Ser-Ser(SEQ ID NO :11)，Gly-Ala-Asn-Arg-Gln(SEQ ID NO :12)，Gly-Ala-Asn-Arg-Met(SEQ ID NO :13)，Gly-Ala-Asn-Arg-Thr(SEQ ID NO :14)，Gly-Ala-Asn-Arg-Ser(SEQ ID NO :15)，Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala(SEQ ID NO :16)，Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg(SEQ ID NO :17)，Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg(SEQ ID NO :18)，Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys(SEQ ID NO 19)，Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Arg-Arg(SEQ IDNO 20)，Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-G Iu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys(SEQ ID NO :21)，及Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-G Iu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Arg-Arg(SEQ ID NO 22)。來源于非CNP多肽(諸如ANP、BNP、血清白蛋白及IgG)的氨基酸序列的非限制性實(shí)例包括Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser(SEQ ID NO 23)；Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr(SEQ ID NO 24)；Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO 25)；Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO 26)；Lys-Val-Leu-Arg-Arg-Tyr(SEQ ID NO 27)；Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His(SEQ ID NO 28)；Gly-Gln-His-Lys-Asp-Asp-Asn-Pro-Asn-Leu-Pro-Arg(SEQ ID NO 29)；Gly-Val-Pro-Gln-Val-Ser-Thr-Ser-Thr(SEQ ID NO 30)；Gly-Glu-Arg-Ala-Phe-Lys-Ala-Trp-Ala-Val-Ala-Arg-Leu-Ser-Gln(SEQ ID NO 31)；Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO :32)。在一實(shí)施例中，如本文所述，具有(χ)及/或(ζ)基團(tuán)的任何CNP變體的N端(χ) 基團(tuán)及/或C端(ζ)基團(tuán)獨(dú)立地包含含有少量(若存在)天然或非天然酸性氨基酸(例如 Asp或Glu)的氨基酸序列。在另一實(shí)施例中，(χ)及/或(ζ)富含天然或非天然堿性氨基酸(例如Lys、Arg或His)，以維持類似CNP22的pi值(pi 8. 9)的堿性pi值。在一實(shí)施例中，CNP變體的pi值在約8至約10. 5的范圍內(nèi)，旨在使得CNP變體可更容易擴(kuò)散穿過包圍骨生長板的軟骨細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)。在較窄的實(shí)施例中，CNP變體的pi值為約8. 5至約 10. 5，或約8. 5至約10，或約9至約10。在另一實(shí)施例中，(χ)及/或(ζ)富含天然或非天然極性氨基酸，旨在增強(qiáng)水溶性。 在又一實(shí)施例中，(X)及/或(Z)含有少量(若存在)天然或非天然疏水性氨基酸(例如 Ala、Val> Leu> Ile 或 Met)。在另一實(shí)施例中，CNP變體的N端以至少一個(gè)甘氨酸殘基終止，其設(shè)計(jì)在于增加血清半衰期。在相關(guān)實(shí)施例中，為防止形成焦谷氨酰胺，CNP變體的N端以甘氨酸殘基終止，或者以谷氨酰胺終止。在一實(shí)施例中，(χ)基團(tuán)含有延伸的氨基酸，其N端以至少一個(gè)甘氨酸殘基終止。在另一實(shí)施例中，(χ)及/或(ζ)不含兩個(gè)相鄰天然或非天然堿性氨基酸(例如Lys-Lys或Arg-Arg)，旨在降低對(duì)弗林蛋白酶切割的敏感性。在一實(shí)施例中，(χ)不含緊接于對(duì)應(yīng)于CNP22的Glyl的位置之前的兩個(gè)相鄰堿性氨基酸。在又一實(shí)施例中，CNP變體的(χ)基團(tuán)及/或(ζ)基團(tuán)包含來源于NPPC (例如來源于CNP53)的氨基酸序列。在一實(shí)施例中，(χ)包含來源于ANP或BNP的N端尾的氨基酸序列。在另一實(shí)施例中，(ζ)包含來源于ANP或BNP的C端尾的氨基酸序列。在另一實(shí)施例中，(χ)及/或(ζ)包含來源于非利鈉多肽的氨基酸序列，諸如，例如IgG、人類血清白蛋白 (HSA)、富含組氨酸的糖蛋白、纖連蛋白、纖維蛋白原、含鋅指多肽、TOF-2及骨靶向蛋白(例如骨織素、骨橋蛋白、骨鈣化素及涎蛋白)。在本文所述的CNP22或其變體可具有N端(χ)基團(tuán)及/或C端(ζ)基團(tuán)的任何實(shí)施例中，(X)及/或(Z)可獨(dú)立地含有來源于骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)的功能域的氨基酸序列。藉由增加CNP變體的總質(zhì)量以使其特征在于本文一般描述的范圍(例如約2.6kDa或 2. SkDa至約6或7kDa的范圍)，來源于BMP的功能域的N端及/或C端氨基酸延伸可增強(qiáng) NEP抗性，且因此增加CNP變體的血清半衰期。另外，因?yàn)槟承〣MP為誘導(dǎo)骨及軟骨形成的生長因子及細(xì)胞因子，所以來源于BMP的功能域的片段可通過不同于以CNP22或其變體的環(huán)狀域活化NPR-B的鳥苷酸環(huán)化酶功能的機(jī)制促進(jìn)軟骨細(xì)胞、軟骨或骨生長。促進(jìn)骨形成及發(fā)育、軟骨形成及發(fā)育及/或成骨細(xì)胞分化的BMP的非限制性實(shí)例包括BMP1、BMP2、BMP3、 BMP5、BMP7及BMP8a。在一實(shí)施例中，CNP22或其變體的N端及/或C端獨(dú)立地偶聯(lián)至來源于BMP1、BMP2、BMP3、BMP5、BMP7或BMP8a的C端部分中最后140個(gè)氨基酸的氨基酸序列。在一實(shí)施例中，CNP變體在CNP22或CNP17的N端及/或C端含有氨基酸延伸，包括(但不限于)DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-53)(SEQ ID NO 4)；QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37，類似物 BL) (SEQ ID NO 60)；AAWARLLQEHPNAGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CA) (SEQ ID NO 61)；AAWARLLQEHPNARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CB) (SEQ ID NO 62)；DLRVDTKSRAAWARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CC) (SEQ ID NO 63)；RGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO 40)；ERGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO 38)；GANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO 64)；GANRRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO 65)；GANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO 66)；GANSSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO 67)；GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO :144)；及SPKMVQGSG-CNP17-KVLRRH (類似物 CD)(具有來源于 BNP 的 N 端及 C 端尾的 CNP17) (SEQ ID NO 68)。在另一實(shí)施例中，CNP變體在CNP22的位置4具有K4R取代。CNP (K4R)變體的非限制性實(shí)例包括GANRRGLSEGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 AY) (SEQ ID NO 36)；GANPRGLSEGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物 Cl) (SEQ ID NO 37)；RGLSEGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 AZ) (SEQ ID NO 41)；ERGLSEGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 BA) (SEQ ID NO 39)；GANQQGLSEGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CH) (SEQ ID NO 69)；及GANSSGLSEGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CG) (SEQ ID NO 70)。在其它實(shí)施例中，CNP變體為包含CNP22或其具有氨基酸添加、缺失及/或取代的變體，及位于CNP肽N端的來源于除CNP外的多肽或蛋白質(zhì)的肽片段，或完整非CNP多肽或蛋白質(zhì)的嵌合體，其中CNP22或其變體可視情況具有一或多個(gè)氨基酸殘基的N端氨基酸延伸。在某些實(shí)施例中，CNP嵌合體包含CNP22或其具有一或多個(gè)氨基酸殘基的N端氨基酸延伸的變體。在某些實(shí)施例中，CNP嵌合體在緊接于CNP22或其變體的第一位置(在CNP22 的情況下為Gly)之前含有賴氨酸-賴氨酸(KK)殘基或GANKK殘基。在其它實(shí)施例中，CNP 嵌合體在緊接于CNP22或其變體的第一位置之前含有一或兩個(gè)不同于賴氨酸-賴氨酸的殘基?？删o接于CNP22或其變體的第一位置之前的殘基的非限制性實(shí)例包括KP、PK、PR、 PQ、QK、QQ、RR、SS、GANKP(SEQ ID NO :200)、GANPK(SEQ ID NO :201)、GANPR(SEQ ID NO :9)、 GANPQ(SEQ ID NO :202)、GANQK(SEQ ID NO :203)、GANQQ(SEQ ID NO :10)、GANRR(SEQ ID NO 8)及 GANSS(SEQ ID NO :11)。在另一實(shí)施例中，CNP變體為包含CNP22及N端肽片段的嵌合體，包括(但不限于)GHHSHEQHPHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CQ)(富含組氨酸的糖蛋白 (HRGP)片段-CNP22 嵌合體)(SEQ ID NO 76)；GAHHPHEHDTHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CR) (HRGP 片段-CNP22 嵌合體)(SEQ ID NO 77)；GHHSHEQHPHGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CX) (HRGP 片段-CNP22 嵌合體)(SEQ ID NO 78)；GQPREPQVYTLPPSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CF) (IgG1 (Fc)片段-CNP22 嵌合體)(SEQ ID NO 79)；GQHKDDNPNLPRGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CT)(人類血清白蛋白 (HSA)片段-CNP22 嵌合體)(SEQ ID NO 80)；GERAFKAWAVARLSQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CE) (HSA 片段-CNP22 嵌合體)(SEQ ID NO 81)；FGIPMDRIGRNPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物 CZ)(骨織素”NPR C 抑制劑，，片段-CNP22 嵌合體)(SEQ ID NO 82)；及GKRTGQILGSKTGPGH(GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物 DA) (FGF2” 肝素結(jié)合域” 片段-CNP22 嵌合體)(SEQ ID NO 83)。在另一實(shí)施例中，CNP變體為包含N端肽片段及CNP22 (其中精氨酸取代CNP22的 Lys4( “CNP22(K4R)”))的嵌合體，包括(但不限于)GQPREPQVYTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CK) (IgG1 (Fc)片段-CNP22(K4R)嵌合體)(SEQ ID NO 84)；GVPQVSTSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CL) (HSA 片段-CNP22 (K4R)嵌合體)(SEQ ID NO 85)；GQPSSSSQSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CM)(纖連蛋白片段-CNP22(K4R)嵌合體)(SEQ ID NO 86)；GQTHSSGTQSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CN)(纖維蛋白原片段-CNP22(K4R)嵌合體)(SEQ ID NO 87)；GSTGQWHSESGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CO)(纖維蛋白原片段-CNP22(K4R)嵌合體)(SEQ ID NO 88)；及GSSSSSSSSSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CP)(鋅指片段-CNP22 (K4R)嵌合體)(SEQ ID NO 89)。包含IgG及CNP22或其變體的嵌合體經(jīng)設(shè)計(jì)為尤其增強(qiáng)對(duì)NEP降解的抗性且減少與血清白蛋白的結(jié)合。包含HSA的表面片段的CNP嵌合體經(jīng)設(shè)計(jì)為尤其降低免疫原性且減少與血清白蛋白的結(jié)合。在N端含有富含組氨酸、無賴氨酸、無精氨酸的陽離子性序列的 HRGP-CNP22及HRGP-CNP22 (K4R)嵌合體經(jīng)設(shè)計(jì)為尤其增強(qiáng)對(duì)蛋白酶的穩(wěn)定性。含有骨織素片段的嵌合體經(jīng)設(shè)計(jì)以在骨生長板處在蛋白酶(例如弗林蛋白酶)切割后釋放骨織素片段，其中該片段將抑制清除受體NPR-C。關(guān)于包含F(xiàn)GF2肝素結(jié)合片段的嵌合體，結(jié)合于片段的肝素經(jīng)設(shè)計(jì)以保護(hù)嵌合體避免降解，從而提供較長血清半衰期。含有纖連蛋白、纖維蛋白原或鋅指片段的嵌合體經(jīng)設(shè)計(jì)為減少與血清白蛋白的結(jié)合，以及其它特征。不希望受理論束縛，如與wtCNP22相比，對(duì)NEP降解的抗性增強(qiáng)且具有類似或改良的功能性(例如結(jié)合于NPR-B及刺激cGMP信號(hào)傳導(dǎo))的分子量為約2. 6kDa或2. 8kDa至約6kDa或7kDa的CNP變體若不緊密結(jié)合于血漿蛋白(諸如血清白蛋白)，則可能更有效。 不緊密結(jié)合于血漿蛋白(例如血清白蛋白)的CNP變體可更有效地?cái)U(kuò)散穿過軟骨，到達(dá)骨生長板的軟骨細(xì)胞，且結(jié)合并活化NPR-B以進(jìn)行cGMP信號(hào)傳導(dǎo)。在一實(shí)施例中，經(jīng)設(shè)計(jì)為減少與血漿蛋白(例如血清白蛋白)的結(jié)合的CNP變體為包含CNP22或其變體及來自IgG 的肽片段的嵌合體。在另一實(shí)施例中，經(jīng)設(shè)計(jì)為減少與血漿蛋白的結(jié)合的CNP變體為包含 CNP22或CNP22(K4R)及來自多肽(例如IgG、HSA、纖連蛋白、纖維蛋白原、含鋅指多肽等) 的片段的嵌合體。在另一實(shí)施例中，經(jīng)設(shè)計(jì)為減少與血漿蛋白的結(jié)合的CNP變體包含CNP22 或其變體偶聯(lián)至親水性或水溶性聚合物。在一實(shí)施例中，親水性或水溶性聚合物為PEG (或 ΡΕ0)。在另一實(shí)施例中，親水性或水溶性聚合物(例如PEG)經(jīng)一或多個(gè)在生理?xiàng)l件下賦予聚合物負(fù)電荷的官能基(諸如羧基、硫酸根或磷酸根，或其組合)官能化。在另一實(shí)施例中，本文的CNP變體包括介于人類CNP-17(hCNP_17)至人類 CNP-53 (hCNP-53)的范圍內(nèi)，且具有來源于hCNP-53的野生型氨基酸序列的截短CNP肽。此等截短CNP肽包括DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-53)(SEQ ID NO 4)；LRVDTKSRAAffARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-52)(SEQ ID NO 146)；RVDTKSRAAffARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-51)(SEQ ID NO 147)；VDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-50)(SEQ ID NO
148)；DTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-49) (SEQ ID NO
149)；TKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-48)(SEQ ID NO:
150)；KSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-47)(SEQ ID NO:
151)；SRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-46) (SEQ ID NO:152)；RAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-45)(SEQ ID NO :153)；AAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-44)(SEQ ID NO :154)；AWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-43)(SEQ ID NO :155)；WARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-42)(SEQ ID NO :156)；ARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-41)(SEQ ID NO :157)；RLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-40)(SEQ ID NO :158)；LLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-39)(SEQ ID NO :159)；LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-38)(SEQ ID NO :160)；QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(SEQ ID NO 60)；EHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-36)(SEQ ID NO :161)；HPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-35)(SEQ ID NO :162)；PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34)(SEQ ID NO :163)；NARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-33) (SEQ ID NO :164)；ARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-32)(SEQ ID NO :165)；RKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-31)(SEQ ID NO :166)；KYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-30)(SEQ ID NO :167)；YKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-29)(SEQ ID NO :168)；KGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-28)(SEQ ID NO :169)；GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-27)(SEQ ID NO :170)；ANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-26)(SEQ ID NO :171)；NKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-25)(SEQ ID NO :172)；KKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-24)(SEQ ID NO :173)；KGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-23)(SEQ ID NO :174)；GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-22)(SEQ ID NO 1)；LSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-21)(SEQ ID NO :175)；SKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-20)(SEQ ID NO :176)；KGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-19)(SEQ ID NO :177)；GCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-18) (SEQ ID NO :178)；及CFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-17)(SEQ ID NO :2)。在某些實(shí)施例中，CNP變體不包括CNP-17、CNP-22或CNP-53。在另一實(shí)施例中，介于hCNP-17至hCNP-53范圍內(nèi)的截短CNP肽可在特定截短CNP 肽的任一或多個(gè)氨基酸位置含有如本文所述天然或非天然氨基酸或肽模擬物(例如肽鍵等構(gòu)物)的氨基酸添加、缺失及/或取代。在另一實(shí)施例中，具有野生型序列或氨基酸添加、 缺失及/或取代的截短CNP肽可在N端、C端及/或內(nèi)部位點(diǎn)偶聯(lián)至本文所述的任何部分， 包括(但不限于)靶向骨或軟骨的部分(例如二磷酸鹽、靶向骨或軟骨的肽序列(例如聚 Asp、聚Glu)、來源于骨蛋白(例如骨橋蛋白、骨鈣化素、涎蛋白)的骨靶向域的肽序列)、來源于骨形態(tài)發(fā)生蛋白(例如BMP2、BMP3、BMP5、BMP7、BMP8a)的功能域的肽序列、來源于利鈉多肽(例如NPPC、ANP、BNP)的肽序列、來源于非利鈉來源多肽(例如血清白蛋白、IgG、富含組氨酸的糖蛋白、纖連蛋白、纖維蛋白原、含鋅指多肽、FGF-2、骨織素)的肽序列、降低腎清除率的部分(例如帶負(fù)電PEG部分)、親水性聚合物(例如PEG)、碳水化合物(例如由骨生長板的細(xì)胞表面上的受體識(shí)別的碳水化合物)、疏水性酸(例如C5-C12羧酸、天然脂肪酸)、磷脂及其組合。在一實(shí)施例中，具有野生型序列或氨基酸添加、缺失及/或取代且視情況在N端、C端及/或內(nèi)部位點(diǎn)偶聯(lián)至一或多個(gè)部分的截短CNP肽具有特征在于本文一般描述的范圍(例如約2. 6kDa或2. 8kDa至約6kDa或7kDa)的總質(zhì)量。在另一實(shí)施例中，CNP變體為CNP37的衍生物，該CNP37為 QEHPNARKYKGANKK-CNP22 (SEQ ID NO 60)。CNP37 變體可在 CNP37 的 37 個(gè)位置中任一或多處含有天然或非天然氨基酸或肽模擬物(例如肽鍵等構(gòu)物)的氨基酸添加、缺失及/或取代。 依據(jù)CNP22的編號(hào)，CNP37中可進(jìn)行的取代的非限制性實(shí)例包括K4R、G5S、G5R、G8S、K10R、 G15S、S16Q、M17N、G19R及其組合。在一實(shí)施例中，CNP37衍生物含有天然氨基酸(例如天冬酰胺)或非天然氨基酸或肽模擬物對(duì)Metl7的取代，旨在部分避免甲硫氨酸的硫原子被氧化。在另一實(shí)施例中，CNP37變體含有天然或非天然非堿性氨基酸或肽模擬物對(duì)Lys8、 LyslO、Lysl4及/或Lysl5 (依據(jù)始于CNP37的N端的編號(hào))的取代，旨在部分減少白蛋白
纟口口。除氨基酸添加、缺失及/或取代的外或替代氨基酸添加、缺失及/或取代，CNP37 衍生物可在N端、C端及/或內(nèi)部位點(diǎn)偶聯(lián)至本文所述的任何部分，這些部分包括(但不限于)靶向骨/軟骨的部分(例如骨靶向肽域)、降低腎清除率的部分(例如帶負(fù)電PEG部分)、親水性聚合物(例如PEG)、包含一或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列(例如骨織素” NPR-C 抑制劑”片段)、碳水化合物(例如由骨生長板的細(xì)胞表面上的受體識(shí)別的碳水化合物)、疏水性酸(例如C5-C12羧酸及天然脂肪酸)，及其組合。在一實(shí)施例中，CNP變體為經(jīng)修飾的CNP37肽，其在弗林蛋白酶切割位點(diǎn)具有突變 /取代(加下劃線)，旨在提高對(duì)弗林蛋白酶的活體內(nèi)抗性，及/或在N端含有甘氨酸(加下劃線)，旨在提高血漿穩(wěn)定性及防止形成焦谷氨酰胺。此等CNP37變體包括(但不限于)GQEHPNARIWKGAN￡EGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物⑶)(SEQ ID NO 71)；GQEHPNARKIGAN巡GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CT) (SEQ ID NO 72)；GQEHPNARKIGAN通GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CU) (SEQ ID NO 73)；GQEHPNARKIGANEEGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CW) (SEQ ID NO 74)；GQEHPNARKIGANEKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-CNP37，類似物 DB) (SEQ ID NO: 75) ’及PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP37) (SEQ ID NO: 145)。在另一實(shí)施例中，本文的CNP變體包括可通過本文所述的融合蛋白方法產(chǎn)生的 CNP肽及其變體?？捎帽疚乃龅娜诤系鞍追椒ㄊ褂没瘜W(xué)或蛋白水解切割或切割蛋白質(zhì)自切割產(chǎn)生的CNP變體的非限制性實(shí)例包括 GDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-wtCNP53) (SEQ ID NO 179)；GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-wtCNP37)(SEQ ID NO :75)；QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(wtCNP37) (SEQ ID NO :60)；
GHKSEVAHRFK-GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (HSA 片段 _wtCNP27) (SEQ ID NO
144)；GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[CNP27(K4,5,9R)](SEQ ID NO 36)；DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP53(M48N)] (SEQ ID NO 180)；GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[Gly-CNP37(M32N) ](SEQ ID NO: 181)；QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP37(M32N)](SEQ ID NO 182)；GHKSEVAHRFK-GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[HSA-CNP27(M22N)](SEQ ID NO: 183)；GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP27(K4，5，9R，M22N)](SEQ ID NO :184)；
PDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-wtCNP53) (SEQ ID NO 185)；PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-wtCNP37) (SEQ ID NO:
145)；PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-wtCNP37)(SEQ ID NO 186)；PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(wtCNP34)(SEQ ID NO 187)；P-GHKSEVAHRFK-GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-HSA-wtCNP27)(SEQ ID NO 188)；PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Pro-CNP27(K4, 5,9R) ](SEQ ID NO :189)；MDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-wtCNP53) (SEQ ID NO 190)；MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-Gly-wtCNP37)(SEQ ID NO: 191)；MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-wtCNP37)(SEQ ID NO 192)；M-GHKSEVAHRFK-GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-HSA_wtCNP27)(SEQ ID NO 193)； MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Met_CNP27(K4,5,9R)](SEQ ID NO 194)。其它CNP變體(包括介于hCNP-17至hCNP_53范圍內(nèi)且具有野生型序列或氨基酸添加、缺失及/或取代的截短CNP肽)亦可通過本文所述的融合蛋白方法產(chǎn)生，只要融合蛋白的化學(xué)或蛋白水解切割的預(yù)定位點(diǎn)不存在于目標(biāo)CNP變體本身的氨基酸序列內(nèi)。作為一非限制性實(shí)例，可采用本文所述的融合蛋白方法使用甲酸切割來產(chǎn)生截短wtCNP34。在其它實(shí)施例中，對(duì)于具有天冬酰胺(Asn/N)殘基及/或谷氨酰胺(Gln/Q)殘基的本文所述的任何CNP肽及CNP變體，無論其是否具有野生型序列或非天然氨基酸序列，任何Asn殘基及/或任何Gln殘基均可獨(dú)立地經(jīng)任何其它天然或非天然氨基酸取代，包括保守性取代，諸如Asn經(jīng)取代為Gin。此等取代系部分地旨在最小化或避免天冬酰胺及/或谷氨酰胺發(fā)生任何可能脫酰胺作用。任何Asn殘基及/或任何Gln殘基均可獨(dú)立地經(jīng)任何其它天然或非天然氨基酸取代(包括保守性取代，諸如Asn經(jīng)取代為Gln)的CNP肽及變體的非限制性實(shí)例包括 wtCNP34、wtCNP37、Gly_wtCNP37、Pro_wtCNP37、Pro_Gly-wtCNP37、GHKSEVAHRFK-wtCNP27(SEQ ID NO 144)、Pro-GHKSEVAHRFK_wtCNP27(SEQ ID NO :188)、 PE012-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO :36)及 PE024-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO :36)。 在某些實(shí)施例中，本文所述的CNP肽及CNP變體的天冬酰胺殘基未經(jīng)谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸取代。在某些實(shí)施例中，本文所述的CNP肽及CNP變體的谷氨酰胺殘基未經(jīng)天冬酰胺、天冬氨酸或谷氨酸取代。作為一非限制性實(shí)例，Pro-Gly-wtCNP37 (PGQEHPNARKYKGANKK GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC) (SEQ ID NO 145)的天冬酰胺殘基7及/或15可獨(dú)立地經(jīng)任何其它天然或非天然氨基酸(包括谷氨酰胺)取代以避免天冬酰胺殘基脫酰胺為天冬氨酸或異天冬氨酸的任何可能性。在某些實(shí)施例中，Pro-Gly-wtCNP37的天冬酰胺殘基7及/或 15未經(jīng)谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸取代。然而應(yīng)了解，本文包括如下CNP變體其中任一或多個(gè)(至多所有)易于發(fā)生脫酰胺或類脫酰胺反應(yīng)(例如異構(gòu)化)的殘基均可經(jīng)由脫酰胺或類脫酰胺反應(yīng)以任何程度(依據(jù)轉(zhuǎn)化的殘基，至多轉(zhuǎn)化100%)轉(zhuǎn)化為其它殘基。在某些實(shí)施例中，本文包括CNP變體，其中(1)任一或多個(gè)(至多所有)天冬酰胺(Asn/N)殘基可經(jīng)由脫酰胺作用轉(zhuǎn)化為天冬氨酸或天冬氨酸鹽，及/或轉(zhuǎn)化為異天冬氨酸或異天冬氨酸鹽，依據(jù)轉(zhuǎn)化的殘基，至多轉(zhuǎn)化約 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或 100% ；或(2)任一或多個(gè)(至多所有)谷氨酰胺(Gln/Q)殘基可經(jīng)由脫酰胺作用轉(zhuǎn)化為谷氨酸或谷氨酸鹽，及/或轉(zhuǎn)化為異谷氨酸或異谷氨酸鹽，依據(jù)轉(zhuǎn)化的殘基，至多轉(zhuǎn)化約5 %、 10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%^； 100% ；或(3)任一或多個(gè)(至多所有)天冬氨酸或天冬氨酸鹽(Asp/D)殘基可經(jīng)由類脫酰胺反應(yīng)(亦稱為異構(gòu)化)轉(zhuǎn)化為異天冬氨酸或異天冬氨酸鹽，依據(jù)轉(zhuǎn)化的殘基，至多轉(zhuǎn)化約 5%,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%^； 100% ；或(4)任一或多個(gè)(至多所有)谷氨酸或谷氨酸鹽(Glu/E)殘基可經(jīng)由類脫酰胺反應(yīng)(亦稱為異構(gòu)化)轉(zhuǎn)化為異谷氨酸或異谷氨酸鹽，依據(jù)轉(zhuǎn)化的殘基，至多轉(zhuǎn)化約5%、 10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%^； 100% ；或(5)上述各項(xiàng)的組合。作為一非限制性實(shí)例，本文包括CNP變體，其中Pro-Gly-wtCNP37 [PGQEHPNARKYKG ANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC] (SEQ ID NO :145)的任一或多個(gè)(至多所有)天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸及/或谷氨酸殘基可經(jīng)由脫酰胺或類脫酰胺反應(yīng)分別轉(zhuǎn)化為(1)天冬氨酸/天冬氨酸鹽及/或異天冬氨酸/異天冬氨酸鹽、(2)谷氨酸/谷氨酸鹽及/或異谷氨酸/異谷氨酸鹽、( 異天冬氨酸/異天冬氨酸鹽，及/或(4)異谷氨酸/異谷氨酸鹽，如上所述，依據(jù)轉(zhuǎn)化的殘基，至多轉(zhuǎn)化約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、 90% 或 100%。作為另一實(shí)例，本文包括CNP變體，其中ftx)-Gly-(SEQ ID NO :145)的任一或多個(gè) (至多所有)天冬酰胺及 / 或 wtCNP37 [PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC]天冬氨酸殘基可經(jīng)由脫酰胺或類脫酰胺反應(yīng)分別轉(zhuǎn)化為(1)天冬氨酸/天冬氨酸鹽及/或異天冬氨酸/異天冬氨酸鹽、及/或( 異天冬氨酸/異天冬氨酸鹽，依據(jù)轉(zhuǎn)化的殘基，至多轉(zhuǎn)化約 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或 100%。作為另一實(shí)例，本文包括CNP 變體，其中 Gly-wtCNP37 [GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO :75)]的任一或多個(gè)(至多所有)天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸及/或谷氨酸殘基可經(jīng)由脫酰胺或類脫酰胺反應(yīng)分別轉(zhuǎn)化為(1)天冬氨酸/天冬氨酸鹽及/或異天冬氨酸/異天冬氨酸鹽、( 谷氨酸/谷氨酸鹽及/或異谷氨酸/異谷氨酸鹽、(3)異天冬氨酸/異天冬氨酸鹽，及/或(4)異谷氨酸/異谷氨酸鹽，依據(jù)轉(zhuǎn)化的殘基， 至多轉(zhuǎn)化約 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或 100%。作為又一實(shí)例，本文包括CNP 變體，其中 wtCNP37 [QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLD RIGSMSGLGC(SEQ ID NO60)]的任一或多個(gè)(至多所有)天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸及 /或谷氨酸殘基可經(jīng)由脫酰胺或類脫酰胺反應(yīng)分別轉(zhuǎn)化為(1)天冬氨酸/天冬氨酸鹽及/ 或異天冬氨酸/異天冬氨酸鹽、( 谷氨酸/谷氨酸鹽及/或異谷氨酸/異谷氨酸鹽、(3) 異天冬氨酸/異天冬氨酸鹽，及/或(4)異谷氨酸/異谷氨酸鹽，依據(jù)轉(zhuǎn)化的殘基，至多轉(zhuǎn)化約 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或 100%。作為另一實(shí)例，本文包括CNP變體，其中HSA-wtCNP27嵌合體GHKSpAHRFKGApK GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO 144)的任一或多個(gè)(至多所有)天冬酰胺、天冬氨酸及/或谷氨酸殘基可經(jīng)由脫酰胺或類脫酰胺反應(yīng)分別轉(zhuǎn)化為(1)天冬氨酸/天冬氨酸鹽及/或異天冬氨酸/異天冬氨酸鹽、(2)異天冬氨酸/異天冬氨酸鹽，及/或( 異谷氨酸 /異谷氨酸鹽，依據(jù)轉(zhuǎn)化的殘基，至多轉(zhuǎn)化約5 %、10%、20 %、30%、40 %、50%、60 %、70%、 80%、90% 或 100%。作為又一實(shí)例，本文包括CNP變體，其中Pro-HSA-wtCNP27嵌合體PGHKSgVAHRFKG ANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO :188)的任一或多個(gè)(至多所有)天冬酰胺、天冬氨酸及/或谷氨酸殘基可經(jīng)由脫酰胺或類脫酰胺反應(yīng)分別轉(zhuǎn)化為(1)天冬氨酸/天冬氨酸鹽及/或異天冬氨酸/異天冬氨酸鹽、(2)異天冬氨酸/異天冬氨酸鹽，及/或( 異谷氨酸/異谷氨酸鹽，依據(jù)轉(zhuǎn)化的殘基，至多轉(zhuǎn)化約5^^10^^20^^30^^40^^50^^60%, 70%、80%、90% 或 100%。另外，本文包括CNP變體，其中任一或多個(gè)(至多所有)甲硫氨酸(Met/M)殘基可氧化為任何化學(xué)上可行的氧化形式(例如亞砜及/或砜)，依據(jù)氧化的殘基，至多轉(zhuǎn)化約 5% ,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%^； 100%。在另一實(shí)施例中，CNP變體包含CNP22或其變體在N端及/或C端偶聯(lián)至有助于變體移位穿過細(xì)胞膜或細(xì)胞障壁的部分。在一實(shí)施例中，CNP變體在N端及/或C端偶聯(lián)至有助于輸送變體穿過細(xì)胞膜或細(xì)胞障壁(包括經(jīng)由活性肽轉(zhuǎn)運(yùn)體)的肽序列。在另一實(shí)施例中，使CNP22或其變體的N端及/或C端偶聯(lián)至化學(xué)部分，諸如天然及/或合成聚合物，以將經(jīng)修飾的CNP肽的總質(zhì)量增加至本文一般描述的范圍，例如約 2. 6kDa或2. 8kDa至約6kDa或7kDa的范圍。在一實(shí)施例中，化學(xué)部分為生物兼容性親水性或水溶性天然(例如肽、碳水化合物)或合成(例如PEG(或PEO))聚合物。在另一實(shí)施例中，使CNP22或其變體的N端及/或C端偶聯(lián)至PEG (或ΡΕ0)聚合物以產(chǎn)生特征在于本文一般描述的范圍(例如約2. 6kDa或2. 8kDa至約6kDa或7kDa)的總質(zhì)量。CNP22或其變體的聚乙二醇化旨在尤其降低免疫原性及藉由降低腎清除率及增強(qiáng)蛋白酶抗性來提高半衰期。PEG部分可連接至本文所述的CNP22或任何變體的N端及/或 C端，該變體包括(但不限于)CNP-17 (CNP22的Cys6_Cys22環(huán)化部分)、CNP37，及CNP17、 CNP22或CNP37的具有N端及/或C端氨基酸延伸、氨基酸取代及/或氨基酸缺失的變體。在一實(shí)施例中，CNP17、CNP22或CNP37或其變體的Lys4及/或LyslO殘基經(jīng)側(cè)鏈上不含反應(yīng)性伯胺的天然或非天然氨基酸(例如Arg、Gly, Ser, Gin、Glu或Cit)或肽模擬物取代， 以排除此等賴氨酸殘基的任何可能的聚乙二醇化。在一實(shí)施例中，CNP肽的Lys4及/或 LyslO殘基經(jīng)Arg取代。在另一實(shí)施例中，LyslO殘基未經(jīng)Arg取代。在另一實(shí)施例中，具有PEG(或ΡΕ0)部分及位于N端的氨基酸延伸的CNP變體(包括CNP22及其變體)在緊接于對(duì)應(yīng)于CNP22的Glyl的位置之前的位置含有精氨酸。此等聚乙二醇化CNP變體經(jīng)設(shè)計(jì)為增強(qiáng)對(duì)NEP降解的抗性、減少與血清白蛋白的結(jié)合及增強(qiáng)CNP功能活性(例如活化cGMP信號(hào)傳導(dǎo))。聚乙二醇化CNP變體的非限制性實(shí)例包括 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)、PE012-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO :36)、PE024-GANRR-CNP22(SEQ ID NO 36)、PE012-GANRR-CNP22 (SEQ ID NO 36)、PE024-GANPR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO :37)、PE012-GANPR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO :37)、PE024-GANPR-CNP22(SEQ ID NO :37)、PEOl2-GANPR-CNP22 (SEQ ID NO 37), PE024-GANQQ-CNP22 (SEQ ID NO :64)、PE012-GANQQ-CNP22 (SEQ ID NO :64)、 PE024-ER-CNP22(K4R) (SEQ ID NO :39)、PE012-ER-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO :39)、 PE024-ER-CNP22 (SEQ ID NO :39)、PE012-ER-CNP22 (SEQ ID NO :39)、PE024-R-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO :41)、PE012-R-CNP22(K4R) (SEQ ID NO :41)、PE024-R-CNP22 (SEQ ID NO :41) 及 PE012-R-CNP22 (SEQ ID NO :41)，其中 PE024 為單分散性 1. 2kDa PEG 聚合物且 PEO12 為單分散性0. 6kDa PEG聚合物。在一實(shí)施例中，PEG(或ΡΕ0)聚合物系偶聯(lián)至CNP變體的N 端。本文包括使用以下方面可不同的親水性或水溶性聚合物(例如PEG)類型(例如同聚物或共聚物；隨機(jī)共聚物、交替共聚物或嵌段共聚物；線性或分支；單分散或多分散)、 鍵聯(lián)(例如可水解鍵聯(lián)或穩(wěn)定鍵聯(lián)，諸如酰胺、亞胺、胺、亞烷基或酯鍵)、偶聯(lián)位點(diǎn)(例如在 N端及/或C端，較佳不在CNP的環(huán)化區(qū)(對(duì)應(yīng)于CNP22的殘基6-2 中任何殘基處)，及長度(例如約0. 2、0. 4或0. 6kDa至約2、3、4或5kDa)。親水性或水溶性聚合物可藉助于此項(xiàng)技術(shù)中已知的基于N-羥基丁二酰亞胺(NHS)或基于醛的化學(xué)或其它化學(xué)偶聯(lián)至CNP肽。此等CNP變體可使用以下產(chǎn)生例如wtCNP22(2. 2kDa)、僅保留wtCNP22的環(huán)化區(qū)(殘基6_22) 的CNP17、在CNP22或CNP17的N端及/或C端具有氨基酸延伸的CNP變體，或具有氨基酸取代、添加及 / 或缺失的變體，諸如 GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)、GANPR_CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 37)、R-CNP22 (SEQ ID NO :40)、R-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO :41)、ER-CNP22 (SEQ ID NO 38)及ER-CNP22(K4R) (SEQ ID NO :39)。在一實(shí)施例中，總質(zhì)量的特征在于本文一般描述的范圍(例如約2. 6kDa或2. 8kDa至約6或7kDa)的PEG-CNP變體含有經(jīng)由基于NHS 或基于醛的化學(xué)偶聯(lián)于N端及/或C端的單分散性線性PEG (或ΡΕ0)部分，經(jīng)由基于NHS 的化學(xué)偶聯(lián)于N端及/或C端的兩臂或三臂分支PEG部分。本文亦包括經(jīng)設(shè)計(jì)以降低腎清除率的帶負(fù)電PEG-CNP變體，包括(但不限于)羧酸化、硫酸化及磷酸化化合物(Caliceti， Adv. Drug Deliv. Rev.(高等藥物傳遞綜述)，55 :1洸1_77 Q003) ；Perlman, J. Clin. Endo. Metab.(臨床內(nèi)分泌代謝雜志)，88 :3227-35(2003) ；Pitkin, Antimicrob. Ag. Chemo. ,29 440-444(1986) ；Vehaskari,Kidney Int，1 (國際腎臟)，22 :127-135 (1982))。在一實(shí)施例中，PEG (或ΡΕ0)部分含有羧基、硫酸根及/或磷酸根。在另一實(shí)施例中，本文所述的偶聯(lián)至CNP變體的N端、C端及/或內(nèi)部位點(diǎn)的PEG(或ΡΕ0)部分含有一或多個(gè)在生理?xiàng)l件下帶正電荷的官能基。此等PEG部分尤其旨在改良此等聚乙二醇化CNP變體于軟骨組織的分布。在一實(shí)施例中，此等PEG部分含有一或多個(gè)一級(jí)、二級(jí)或三級(jí)氨基、季銨基及/或其它含胺(例如脲)基團(tuán)。在一實(shí)施例中，本文包括經(jīng)由基于NHS或基于醛的化學(xué)偶聯(lián)至式(CH2CH2O)nW PEG (或ΡΕ0)的CNP22或其變體，其中η為約6至約100的整數(shù)，且PEG聚合物為約0. 3kDa 至約5kDa。在另一實(shí)施例中，η為約12至約50的整數(shù)，且PEG聚合物為約0. 6kDa至約 2. 5kDa。在另一實(shí)施例中，η為約12至約對(duì)，且PEG聚合物為約0. 6kDa至約1.2kDa。在又一實(shí)施例中，PEG聚合物的末端羥基經(jīng)非反應(yīng)性基團(tuán)封端。在一特定實(shí)施例中，封端基團(tuán)為烷基，例如低級(jí)烷基，諸如甲基。在另一實(shí)施例中，本文提供具有一或多個(gè)對(duì)肽酶(包括中性內(nèi)肽酶(NEP))切割的敏感性降低的肽鍵或肽鍵等構(gòu)物的CNP變體。NEP為切割較大疏水性殘基的氨基端的底物肽鍵的膜結(jié)合鋅依賴性內(nèi)肽酶。因此，將NEP的切割位點(diǎn)處的肽鍵修飾為非天然肽鍵或非肽鍵可排除NEP切割或降低NEP切割的效率。對(duì)于ANP及CNP，報(bào)導(dǎo)NEP切割首先發(fā)生于環(huán)化區(qū)內(nèi)的CyS6_Phe7鍵，接著發(fā)生于遍及結(jié)構(gòu)的其余部分的其它處。對(duì)于BNP，報(bào)導(dǎo)切割首先發(fā)生于肽N端，接著發(fā)生于環(huán)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)。盡管報(bào)導(dǎo)CNP上的主要NEP切割位點(diǎn)為Cys6-Phe7鍵，但當(dāng)將wtCNP22于活體外暴露于NEP消化維持2. 5分鐘時(shí)，所有可能位點(diǎn)均意外水解，其中Cys6-Phe7及Gly8_Leu9肽鍵略微最不穩(wěn)定，如實(shí)例2中所述。NEP的底物特異性主要由兩個(gè)底物結(jié)合子位點(diǎn)Si，及S2’決定(Oefner等人， J. Mol. Biol.(分子生物學(xué)雜志)296 :341-349 (2000))。Sl，位點(diǎn)接受N端肽鍵經(jīng)受水解的較大疏水性ΡΓ殘基(例如Phe,Leu.Ile及Met)。S2，位點(diǎn)一般優(yōu)選稱為P2，的較小殘基 (例如Gly或Ser)。在CNP的情況下，報(bào)導(dǎo)Phe7為NEP Si，位點(diǎn)的較佳Pl，殘基，而Gly8 為S2’位點(diǎn)的較佳P2’殘基。由于此兩個(gè)子位點(diǎn)一起僅可容納特定總側(cè)鏈尺寸，因此CNP 的ΡΓ -P2’殘基的總尺寸的任何增大可能會(huì)潛在地破壞NEP結(jié)合。舉例而言，將氯原子添加于Pl，Phe7芳族環(huán)的3位(亦即3-Cl-Phe7)可潛在地修飾CNP與NEP切割位點(diǎn)(例如在Si’子位點(diǎn))之間的相互作用(例如使這些相互作用不穩(wěn)定)。將叔丁基添加至較小P2’ 殘基GlyS (亦即tBu-Gly8)可潛在地破壞CNP與S2’子位點(diǎn)之間的相互作用。因此，在一實(shí)施例中，本文的CNP變體包括ΡΓ -P2，殘基(諸如Wie7-Gly8)尺寸增大以干擾活性位點(diǎn)處的底物識(shí)別，從而降低對(duì)NEP切割的敏感性的CNP。天然氨基酸、非天然氨基酸及/或肽模擬物部分可取代一或多個(gè)較大ΡΓ疏水性殘基(包括(但不限于) Phe7、Leu9、Leull、Ilel4、Metl7&Leu20)及/或一或多個(gè)較小P2，殘基(包括(但不限于)Cys6、Gly8、Glyl5、Serl6 及 Glyl9)。本文包括在至少一個(gè)牽涉于底物識(shí)別及/或NEP切割的殘基處包含至少一個(gè)經(jīng)修飾氨基酸及/或至少一個(gè)經(jīng)修飾肽鍵的CNP變體，其中這些經(jīng)修飾氨基酸及經(jīng)修飾肽鍵可為天然氨基酸、非天然氨基酸、肽模擬物及/或肽鍵等構(gòu)物。在一實(shí)施例中，CNP上在Cys6 與Wie7之間的NEP切割位點(diǎn)經(jīng)修飾。在一相關(guān)實(shí)施例中，Cys6與Wie7之間的肽鍵(_C(= 0)-ΝΗ-)經(jīng)一個(gè)以下肽鍵等構(gòu)物置換-CH2-NH-,-C( = O)-N(R)-，其中酰氨基系經(jīng)任何以下R基團(tuán)烷基化甲基、乙基、正丙基、異
62丙基、環(huán)丙基、正丁基、異丁基、仲丁基或叔丁基，-C( = 0)-NH-CH2-,-CH2-S-,-CH2-S (0) n_，其中 η 為 1 或 2，-CH2-CH2-,-CH = CH-，-C( = 0)-CH2-,-CH(CN) -NH-,-CH(OH) -CH2-,-0_C( = 0)-ΝΗ-，或-NHC ( = 0)ΝΗ-ο在另一實(shí)施例中，CNP變體系由下式表示(χ) -Gly1-Leu2-Ser3-Lys4-Gly5- (b) 6_ (c) 7~ (d) 8-Leu9-LyS10-Leu11-Asp12-Arg13-I Ie H-Gly15-Ser16-Met17-Ser18-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22-(Z) (SEQ ID NO :90)，其中(χ)及(ζ)獨(dú)立地可不存在或可選自由以下組成的群合成骨靶向化合物，諸如二磷酸鹽；適用于靶向骨或軟骨的氨基酸序列，例如聚Asp及聚Glu ；來源于骨蛋白(諸如骨橋蛋白、骨鈣化素及涎蛋白)的骨靶向域的氨基酸序列(Wang等人，Adv. Drug Delivery Rev.，57 1049-76 (2005))；降低腎清除率的聚合分子及非聚合分子，諸如帶負(fù)電PEG ；及藉由使CNP變體的總質(zhì)量增至本文一般描述的范圍(例如約2. 6kDa或2. 8kDa至約6kDa或 7kDa)來增強(qiáng)CNP變體對(duì)NEP降解的抗性的天然聚合物(例如含有氨基酸、脂肪酸及/或碳水化合物的天然聚合物)及合成聚合物(例如PEG)；(b)及(c)可為野生型Cys6及Wie7、另一天然氨基酸或非天然氨基酸，或可含有如本文所述的肽鍵等構(gòu)物以增強(qiáng)對(duì)NEP切割的抗性；且(d)可為野生型Gly8，或可為較大天然或非天然(例如t-Bu-Gly)氨基酸或肽模擬物以減少與NEP的結(jié)合。在一實(shí)施例中，此等CNP變體在(b)、(C)及/或(d)處含有至少一個(gè)經(jīng)修飾氨基酸。即使CNP22或其變體在CyS6_Phe7具有抗NEP的肽鍵或肽鍵等構(gòu)物，但CNP內(nèi)的其它肽鍵(包括 Gly8-Leu9、Lysl0-Leull、Argl3_Ilel4、Serl6-Metl7 及 Glyl9-Leu2O 鍵) 亦可能會(huì)被切割。因此，本文包括除Cys6-Phe7鍵外亦在一或多個(gè)其它NEP切割位點(diǎn)具有肽鍵等構(gòu)物的CNP變體，其中這些肽鍵等構(gòu)物包括本文所述者。在另一實(shí)施例中，本文包括在Cys6及/或Cys22具有半胱氨酸類似物(包括(但不限于)高半胱氨酸、青霉胺、2-巰基丙酸及3-巰基丙酸)的CNP變體。在一實(shí)施例中，此等CNP變體具有由野生型Cys6或類似物與Cys22或類似物之間的二硫鍵所形成的環(huán)狀域。在另一實(shí)施例中，CNP22或其變體的一或多個(gè)殘基(至多所有殘基)經(jīng)D-氨基酸取代。以D-氨基酸取代L-氨基酸基本上將側(cè)鏈自其原始位置移動(dòng)約120度，藉此可能破壞CNP肽與NEP的結(jié)合。在一特定實(shí)施例中，Phe7處的L-Phe經(jīng)其D-對(duì)映異構(gòu)體D-Phe取代。在又一實(shí)施例中，β氨基酸(諸如3-氨基-2-苯基丙酸(或2-苯基-β-丙氨酸))置換野生型α-氨基酸I^e7。使用氨基酸將肽主鏈長度有效增加一個(gè)亞甲基單元。蛋白酶抗性可因底物構(gòu)型的變化或氨基酸側(cè)鏈之間的距離增加而引起。具有非天然α -氨基酸、β -氨基酸或肽鍵等構(gòu)物的CNP22變體的非限制性實(shí)例包括GLSKGC (CH2NH) FGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 A) (SEQ ID NO 56)、GLSKGC- (N-Me-Phe) -GLKLDRIGSMSGLGC (類似物 B) (SEQ ID NO 57)、GLSKGC- (D-Phe) -GLKLDRIGSMSGLGC (類似物 E) (SEQ ID NO 136)、GLSKGCF- (tBu-Gly) -LKLDRIGSMSGLGC (類似物 F) (SEQ ID NO 58)、GLSKGC- (3_Cl_Phe) -GLKLDRIGSMSGLGC (類似物 G) (SEQ ID NO 137)，及GLSKGC-[NHCH2CH(Ph) CO] -GLKLDRIGSMSGLGC (類似物 H，使用 3-氨基-2-苯基丙酸形成)(SEQ ID NO :59)。在另一實(shí)施例中，CNP變體具有特征在于本文一般描述的范圍(例如約2. 6kDa或 2. SkDa至約6kDa或7kDa)的總質(zhì)量，旨在增強(qiáng)對(duì)NEP降解的抗性，且這些變體由下式表示(x) -Gly1-Leu2-Ser3- (a) 4_Gly5- (b) 6_ (c) 7_ (d) 8_ (e) 9_ (f) 10- (g) H-Asp12-Arg13- (h) 14-Gly15-kr164i)17-kr18-Gly19-(j)2。-Gly21-Cys22-(Z) (SEQ ID NO :46)，其中(χ)及(ζ)獨(dú)立地可不存在或可選自由以下組成的群合成骨靶向化合物，諸如二磷酸鹽；適用于靶向骨或軟骨的氨基酸序列，諸如聚Asp及聚Glu ；來源于骨蛋白(諸如骨橋蛋白、骨鈣化素及涎蛋白)的骨靶向域的氨基酸序列；降低腎清除率的聚合及非聚合部分，諸如帶負(fù)電PEG ；含有例如氨基酸、疏水性酸及/或碳水化合物的聚合物；及合成親水性聚合物，諸如PEG;(a)可為該位置的野生型Lys，或可經(jīng)保守性氨基酸取代或在側(cè)鏈上不具有反應(yīng)性伯胺的天然或非天然氨基酸或肽模擬物(包括(但不限于)Arg、Gly、6-羥基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gin、Ser或Glu)置換，其中在一實(shí)施例中，(a)為Arg ；(b)選自Cys、及Cys6與Phe7之間的肽鍵等構(gòu)物，諸如Cys-CH2-NH ；(c)選自L_Phe ；D-Phe ；3_氨基_2_苯基丙酸；Phe的N-烷基化衍生物，其中N-烷基為甲基、乙基、正丙基、異丙基、環(huán)丙基、正丁基、異丁基、仲丁基或叔丁基；及Phe類似物， 其中Phe類似物的苯環(huán)的一或多個(gè)鄰位、間位及/或?qū)ξ幌到?jīng)一或多個(gè)選自由以下組成的群的取代基取代商素、羥基、氰基、直鏈或支鏈Cp6烷基、直鏈或支鏈CV6烷氧基、直鏈或支鏈鹵基-Cp6烷基、C3_1Q環(huán)烷基、雜環(huán)基、C6,芳基及雜芳基(實(shí)例包括(但不限于)酪氨酸、 3-氯苯丙氨酸、2，3-氯-苯丙氨酸、3-氯-5-氟-苯丙氨酸、2-氯-6-氟-3-甲基-苯丙氨酸)，或其中Phe類似物的苯環(huán)可經(jīng)另一芳基(非限制性實(shí)例包括1-萘基丙氨酸及2-萘基丙氨酸)或雜芳基(非限制性實(shí)例包括吡啶基丙氨酸、噻吩基丙氨酸及呋喃基丙氨酸) 置換；(d)選自Gly、叔丁基-Gly (tBu-Gly)、Thr、Ser、Val 及 Asn ；(e)選自Leu、Ser, Thr 及肽鍵等構(gòu)物，諸如 N-Me-Leu ；(f)可為該位置的野生型Lys，或可經(jīng)保守性氨基酸取代或在側(cè)鏈上不具有反應(yīng)性伯胺的天然或非天然氨基酸或肽模擬物(包括(但不限于)Arg、Gly、6-羥基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gin、Ser或Glu)置換，其中在一實(shí)施例中，(f)不為Arg ；(g)選自Leu及肽鍵等構(gòu)物，諸如N-Me-Leu ；
(h)選自Ile、tBu-Gly、及肽鍵等構(gòu)物，諸如 N-Me-Ile ；⑴選自僅討、￥￡11、六卯、3-(141￡1、2-氨基丁酸(Abu)及2-氨基-異丁酸(Aib)； 且(j)選自Leu、正亮氨酸(Nle)、高亮氨酸(Hleu)、Val、叔丁基-Ala (tBu-Ala)、 Ser, Thr、Arg、及肽鍵等構(gòu)物，諸如N-Me-Leu。在另一實(shí)施例中，CNP變體具有特征在于本文一般描述的范圍(例如約2. 6kDa或 2. SkDa至約6kDa或7kDa)的總質(zhì)量，旨在增強(qiáng)對(duì)NEP切割的抗性，且高等變體由下式表示(x) -Gly1-Leu2-Ser3- (a) 4_Gly5- (b) 6_ (c) 7_ (d) 8_ (e) 9_ (f) 10_ (g) H-Asp12-Arg13- (h) 14-(i) 15-Ser16-(j) 17-Ser18-Gly19-(k)20-Gly21-Cys22-(ζ) (SEQ ID NO :143)，其中(x)及(ζ)獨(dú)立地可不存在或可選自由以下組成的群合成骨靶向化合物，諸如二磷酸鹽；適用于靶向骨或軟骨的氨基酸序列，諸如聚Asp及聚Glu ；來源于骨蛋白及其衍生物(諸如骨橋蛋白、骨鈣化素、涎蛋白等的融合蛋白或肽序列)的骨靶向域的氨基酸序列； 降低腎清除率的部分，包括(但不限于)親水性或水溶性聚合物，諸如帶電PEG分子；及包含例如PEG、氨基酸、碳水化合物及/或疏水性酸的部分；(a)可為該位置的野生型Lys，或可經(jīng)保守性氨基酸取代或在側(cè)鏈上不具有反應(yīng)性伯胺的天然或非天然氨基酸或肽模擬物(包括(但不限于)Arg、Gly、6-羥基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gin、Ser或Glu)置換，其中在一實(shí)施例中，(a)為Arg ；(b)選自Cys、及Cys6與Phe7之間的肽鍵等構(gòu)物，諸如Cys-CH2-NH ；(c)選自L_Phe ；D-Phe ；3_氨基_2_苯基丙酸；Phe的N-烷基化衍生物，其中N-烷基為甲基、乙基、正丙基、異丙基、環(huán)丙基、正丁基、異丁基、仲丁基或叔丁基；及Phe類似物， 其中Phe類似物的苯環(huán)的一或多個(gè)鄰位、間位及/或?qū)ξ幌到?jīng)一或多個(gè)選自由以下組成的群的取代基取代商素、羥基、氰基、直鏈或支鏈Cp6烷基、直鏈或支鏈CV6烷氧基、直鏈或支鏈鹵基-Cp6烷基、C3_1Q環(huán)烷基、C6,芳基、雜環(huán)基及雜芳基(實(shí)例包括(但不限于)酪氨酸、 3-氯苯丙氨酸、2，3-氯-苯丙氨酸、3-氯-5-氟-苯丙氨酸、2-氯-6-氟-3-甲基-苯丙氨酸)，或其中Phe類似物的苯環(huán)可經(jīng)另一芳基(非限制性實(shí)例包括1-萘基丙氨酸及2-萘基丙氨酸)或雜芳基(非限制性實(shí)例包括吡啶基丙氨酸、噻吩基丙氨酸及呋喃基丙氨酸) 置換；(d)選自:Gly、叔丁基-Gly, Thr、Ser、Val 及 Asn ；(e)選自Leu、Ser, Thr 及肽鍵等構(gòu)物，諸如 N-Me-Leu ；(f)選自Lys、Arg、Gly、6_ 羥基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gln 及 Ser ；(g)選自Leu、Asn及肽鍵等構(gòu)物，諸如N-Me-Leu ；(h)選自Ile、叔丁基-Gly (tBu-Gly)、Asn 及肽鍵等構(gòu)物，諸如 N-Me-Ile ；⑴選自Gly、Arg、Ser 及 Asn ；(j)選自僅討、￥￡11、六卯、3-(141￡1、2-氨基丁酸(Abu)及 2-氨基-異丁酸(Aib)； 且(k)選自Leu、正亮氨酸(Nle)、高亮氨酸(Hleu)、Val、叔丁基-Ala (tBu-Ala)、 Arg、Thr、Ser及肽鍵等構(gòu)物，諸如N-Me-Leu。為改良CNP變體傳遞至骨相關(guān)病癥(例如骨骼發(fā)育不良)的目標(biāo)部位，可將CNP 變體連接(例如在N端及/或C端)至靶向骨/軟骨的部分。靶向骨/軟骨的部分的非限制性實(shí)例包括二磷酸鹽；羥基磷灰石；葡糖胺；膠原蛋白(例如X型膠原蛋白) ’聚Asp ；聚 Glu;及來源于骨蛋白(諸如骨織素、骨橋蛋白、骨鈣化素及涎蛋白)的骨靶向域的氨基酸序列。除較不易為NEP切割的外，CNP變體亦可能具有降低的對(duì)NPR-C清除受體的親和力，同時(shí)保留CNP功能性。除NEP介導(dǎo)的降解外，CNP22的半衰期亦受清除受體NPR-C 影響，該NPR-C與NPR-B的細(xì)胞外肽結(jié)合域共享58%的序列同源性。CNP22不僅緊密結(jié)合于NPR-B(7-30pM親和力)，而且亦緊密結(jié)合于NPR-C(ll_140pM) (Bennett, B. D.等人， J. Biol. Chem.(生物化學(xué)雜志)J66 :23060-67(1991) ；Koller K. J.及 Goeddel，D. V.， Circulation (循環(huán))，86 :1081-88(1992) ；Suga, S.等人，Endocrinology (內(nèi)分泌學(xué))，130 229-39 (1992))。盡管NPR-B晶體結(jié)構(gòu)尚有待報(bào)導(dǎo)，但NPR-C與NPR-A晶體結(jié)構(gòu)之間的序列同源性以及相似性(He，X. -L.等人，Science (科學(xué))，四3(55；35) :1657-62(2001) ；Ogawa, H.等人，J. Biol. Chem.(生物化學(xué)雜志)，279 Q7) :28625-31(2004) ；He, X.-L.，J. Mol. Biol.(分子生物學(xué)雜志)，361(4) :698-714(2006))表明NPR-B可能呈現(xiàn)類似的總體結(jié)構(gòu)折迭。因此，依據(jù)基于結(jié)構(gòu)的序列比對(duì)及以下相關(guān)系統(tǒng)的結(jié)晶結(jié)構(gòu)來建立NPR-B同源性模型結(jié)合于NPR-C的CNP、結(jié)合于NPR-A的ANP，及結(jié)合于NPR-C的ANP (He，X. -L.等人， Science (科學(xué))，293(5535) :1657-62(2001) ；Ogawa, H.等人，J. Biol. Chem.(生物化學(xué)雜志)，279 07) =28625-31(2004) ；He，X.-L.，J. Mol. Biol.(分子生物學(xué)雜志)，361 (4) 698-714 Q006))。依據(jù)受體似乎決定所結(jié)合肽的構(gòu)型，且就一級(jí)結(jié)構(gòu)及功能特性而言NPR-B 最接近類似于NPR-A的觀察結(jié)果，以NPR-A/ANP晶體結(jié)構(gòu)作為模型來建立NPR-B/CNP同源性模型。使用公開的CNP變體的信號(hào)傳導(dǎo)數(shù)據(jù)(美國專利第5，434，133號(hào)及美國專利申請(qǐng)公開案第2004/0138134A1號(hào))及不再結(jié)合于NPR-C的功能性ANP變體的信號(hào)傳導(dǎo)數(shù)據(jù) (Cunningham, EMBO 13 (11) 2508-15，1994)來改進(jìn)及解釋 NPR-B/CNP 模型。本文包括依據(jù)NPR-B/CNP復(fù)合物的基于同源性的結(jié)構(gòu)模型，經(jīng)設(shè)計(jì)以改良NPR-B 選擇性的CNP變體。組合結(jié)合于各種受體的利鈉肽的實(shí)驗(yàn)及計(jì)算結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)與公開的功能性數(shù)據(jù)，產(chǎn)生仍舊結(jié)合于NPR-B但可潛在地降低對(duì)NPR-C清除受體的親和力的CNP變體。舉例而言，NPR-C在環(huán)結(jié)構(gòu)中于肽結(jié)合位點(diǎn)中具有獨(dú)特插入，從而使得與NPR-A及NPR-B中的各別環(huán)殘基相比，該NPR-C的環(huán)殘基處于更靠近諸如CNP Gly8(或ANP Gly9)的肽殘基的位置。早期研究表明，ANP中的G9T突變有助于降低對(duì)NPR-C的親和力，藉此改良NPR-A選擇性(Cunningham，EMBO J. ,13(11) :2508-15 (1994))。因此，產(chǎn)生 CNP 變體以用較大殘基 (Ser, Val、Thr或Asn)置換相應(yīng)Gly8殘基，以在不影響CNP與NPR-B的結(jié)合的情況下，破壞其與NPR-C的結(jié)合。此外，依據(jù)對(duì)受體/肽復(fù)合物的詳細(xì)結(jié)構(gòu)分析，將一或多個(gè)突變引入預(yù)期與受體特異性殘基相互作用的CNP的C端(包括Glyl5至Gly21)。舉例而言，CNP22 中的G19R突變不會(huì)引起NPR-B信號(hào)傳導(dǎo)活性的顯著損失。然而，不能在不改變鄰近殘基的構(gòu)型的情況下，于NPR-C/CNP的可用晶體結(jié)構(gòu)中模擬此突變。此等觀察結(jié)果表明，G19R突變可能會(huì)選擇性破壞CNP與特定受體(諸如NPR-C)的結(jié)合。在一實(shí)施例中，CNP變體在位置1、5、8、15、19及21的一或多個(gè)Gly位點(diǎn)具有取代， 以降低構(gòu)型柔性且藉此增強(qiáng)受體特異性。對(duì)結(jié)合于NPR-C及NPR-A的ANP的晶體結(jié)構(gòu)的比較分析(0gawa,H.等人，J. Biol. Chem.(生物化學(xué)雜志),279 =28625-31 (2004) ；He,X. -L.，J. Mol. Biol.(分子生物學(xué)雜志)，361 =698-714 (2006))表明ANP的構(gòu)型柔性可在決定受體選擇性方面起到重要作用。在一實(shí)施例中，對(duì)NPR-C的親和力可能降低的功能性CNP變體具有一或多個(gè)以下氨基酸取代GlR、GlE、G5R、G5Q、G5S、F7Y、G8T、G8S、G8V、G8N、L9S、L9T、K10Cit、K10Q、K10S、 I14N、G15R、G15S、G15N、G15Cit、S16Q、M17V、M17N、G19S、G19R、G19N、L20V、L20R、L20T、 L20S、G21S、G21T 及 G21R。在一實(shí)施例中，CNP 變體在位置 1、5、7、8、9、10、14、15、16、17、19、
20及/或21具有多點(diǎn)取代，且可視情況在變體的肽序列的任何其它位置具有修飾。在另一實(shí)施例中，可將本文所述的CNP變體在N端、C端及/或內(nèi)部位點(diǎn)偶聯(lián)至部分，直至總質(zhì)量的特征在于本文一般描述的范圍(例如約2. 6kDa或2. SkDa至約6kDa或 7kDa)，以有助于靶向骨/軟骨、降低NPR-C及腎清除率、增強(qiáng)對(duì)NEP降解的抗性，及/或改良CNP功能性。在一實(shí)施例中，CNP變體未在環(huán)狀區(qū)域(對(duì)應(yīng)于CNP22的Cys6至Cys22) 內(nèi)的位點(diǎn)偶聯(lián)至聚合部分。可偶聯(lián)至CNP變體的聚合或非聚合部分的非限制性實(shí)例包括合成骨靶向化合物，諸如二磷酸鹽；骨/軟骨靶向肽序列，諸如聚Asp及聚Glu ；來源于骨蛋白 (諸如骨橋蛋白、骨鈣化素及涎蛋白)的骨靶向域的肽序列；來源于骨形態(tài)發(fā)生蛋白(諸如 BMP2、BMP3、BMP5、BMP7及BMP8a)的功能域的肽序列；來源于利鈉來源的多肽(例如NPPC、 ANP及BNP)的肽序列；其它天然聚合或非聚合部分，諸如碳水化合物、脂肪酸及磷脂；生物兼容性合成親水性聚合物，諸如PEG (或ΡΕ0)；疏水性聚合或非聚合部分，諸如庚酸及戊酸； 及其組合。例如就刺激cGMP產(chǎn)生及信號(hào)傳導(dǎo)而言，本文所述的CNP變體可具有與CNP22相比實(shí)質(zhì)上類似或更佳的功能活性。在一實(shí)施例中，CNP變體于活體外或活體內(nèi)刺激產(chǎn)生在相同濃度wtCNP22 (例如1 μ Μ)下所產(chǎn)生的cGMP量的至少約50%。在某些實(shí)施例中，CNP 變體保留野生型CNP22活體外或活體內(nèi)的cGMP刺激活性的至少約50%、60%、70%、80%、 90 %、95 %或100 %。在另一實(shí)施例中，與CNP22相比，CNP變體具有改良的cGMP刺激活性。 在某些實(shí)施例中，CNP變體于活體外或活體內(nèi)刺激產(chǎn)生在相同濃度wtCNP22(例如1 μ m)下所產(chǎn)生的 cGMP 量的至少約 110%、120%、130%、140%、150%、200%、250%、300%、350%、 400%、450%、500% 或更高。本文中視情況排除本文中所參考的任何先前公開案中特定揭示的任何利鈉(例如CNP)肽、片段及變體，及實(shí)際產(chǎn)生的任何利鈉(例如CNP)肽、片段及變體，這些先前公開案包括(但不限于):U. S. 5，434，133、U. S. 6，034，231、U. S. 6，020，168、U. S. 6，743，425、 U. S. 7，276，481、WO 94/20534、WO 02/047871、WO 2005/098490、WO 2004/047871、EP 0497368,EP 0466174，及 Furuya 等人，Biochem. Biophys. Res. Comm.(生物化學(xué)生物物理通訊)183 :964-969(1992)).所有此等文獻(xiàn)均以全文引用的方式并入本文中。在一實(shí)施例中，本文視情況排除所有已知野生型CNP-53、野生型CNP-22、野生型CNP-17、野生型BNP及人類來源及非人類來源的野生型ANP。舉例而言，在一實(shí)施例中，本文視情況排除人類CNP-17、人類CNP-22、雞CNP_22(對(duì)應(yīng)于hCNP-22 (Leu9Val))、 鱒魚及鰻魚 CNP-22 (對(duì)應(yīng)于 hCNP-22 (Leu2Trp、Ser3Asn、Lys4Arg))、蛙 CNP22-I (對(duì)應(yīng)于 hCNP-22 (Leu2Tyr、Lys4Arg、Leu9Val、Serl6Ala、Metl7Phe))、蛙 CNP22-II (對(duì)應(yīng)于 hCNP-22 (Leu2Thr、Serl6Ala))、人類 CNP-53，及豬及大鼠 CNP-53 (對(duì)應(yīng)于 hCNP-53(Glnl7HiS、Ald8Gly))。在另一實(shí)施例中，本文視情況排除藉由在人類及非人類動(dòng)物中活體內(nèi)蛋白水解切割產(chǎn)生的NPPC、原CNP及CNP-53的片段。在另一實(shí)施例中，本文視情況排除野生型人類CNP-53的以下截短片段CNP-50、CNP-46、CNP-44、CNP-39、CNP-30、 CNP-29、CNP-28、CNP-27 及 CNP-26。在另一實(shí)施例中，本文視情況排除自鯊魚物種皺唇鯊(Triakis scyllia)及小點(diǎn)貓鯊(Scyliorhinus canicula)分離或搜尋到的CNP肽及其片段(例如參看M. Takano等人，Zool. Sci.，11 :451-454(1994))，其包括RLLKDLSNNPLRFRGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-41)(SEQ ID NO :204)；LKDLSNNPLRFRGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-39)(SEQ ID NO :205)；KDLSNNPLRFRGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-38)(SEQ ID NO :206)；及GPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-22)(SEQ ID NO :207)。在另一實(shí)施例中，本文視情況排除自鯊魚物種鼠鯊(Lamna ditropis)分離或搜尋到的CNP肽及其片段(例如參看M. Takano等人，Zool. Sci.，11 :451-454 (1994))，其包括RLLKDLSNNPLRFKGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-41)(SEQ ID NO :208)；LKDLSNNPLRFKGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-39)(SEQ ID NO :209)；KDLSNNPLRFKGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-38)(SEQ ID NO :210)；FKGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-29)(SEQ ID NO :211)；及GPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-22)(SEQ ID NO :212)。在又一實(shí)施例中，本文視情況排除自鯊魚物種白斑角鯊(Squalus acanthias)分離的CNP肽及其片段(例如參看M. Takano等人，Zool. Sci.，11 :451-454 (1994))，其包括RLLQDLSNNPLRFKGRSKKGPSRSCFGLKLDRIGAMSGLGC(CNP-41)(SEQ ID NO :213)；及 GPSRSCFGLKLDRIGAMSGLGC(CNP-22)(SEQ ID NO :214)。在另一實(shí)施例中，本文視情況排除自青鏘(medaka)及河豚(puffer fish)分離的 CNP 肽，其在 K. Inoue 等人，Proc. Nat. Acad. Sci.，100 (17) 10079-10084 (2003)中命名為 ” CNP-I ”、” CNP-2 ”、” CNP-3 ” 及” CNP-4 ” GWNRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (青鏘及河豚 CNP-1) (SEQ ID NO :215)；PMVAGGGCFGMKMDRIGSISGLGC (青鏘 CNP-2) (SEQ ID NO :216)；GRSSMVGGRGCFGMKIDRIGSISGLGC (河豚 CNP-2) (SEQ ID NO :217)；GGMRSCFGVRLERIGSFSGLGC (青鏘 CNP-3) (SEQ ID NO :218)；GGLRSCFGVRLARIGSFSGLGC (河豚 CNP-3) (SEQ ID NO :219)；GGSTSRSGCFGHKMDRIGTISGMGC (青鏘 CNP-4) (SEQ ID NO :220)；及GGSSRSGCFGHKMDRIGTISGMGC (河豚 CNP-4) (SEQ ID NO :221)。在另一實(shí)施例中，本文視情況排除自鴨嘴獸(platypus)毒液分離的CNP_39 及其 CNP-22 片段，其在 G. de Plater 等人，Toxicon.，36 (6) :847-857(1998)中命名為” ovCNP-39” 及” ovCNP-39 (18-39) ” LLHDHPNPRKYKPANKKGLSKGCFGLKLDRIGSTSGLGC(ovCNP-39)(SEQ ID NO 222)；及GLSKGCFGLKLDRIGSTSGLGC(ovCNP-39(18-39)(SEQ ID NO :223)。在另一實(shí)施例中，本文視情況排除以下如US 2007/0197434中特定揭示的肽Gly-Leu-Ser-Lys-Gly-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Met-S er-Gly-Leu-Gly-Cys(SEQ ID NO :224)；
Gly-Leu-Ser-Lys-Gly-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Gln-S er-Gly-Leu-Gly-Cys(SEQ ID NO :225)；Gly-Leu-Ser-Lys-Gly-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Ala-S er-Gly-Leu-Gly-Cys(SEQ ID NO :226)；Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-M et-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys(SEQ ID NO :227)；Gly-Leu-Ser-Lys-Gly-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Met-S er-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr(SEQ ID NO :228)；及Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-A sn-Ser-Phe-Arg-Tyr(SEQ ID NO :229) 在另一實(shí)施例中，本文視情況排除US 2007/0197434中一般性揭示的SEQ ID NO: 10的肽，其中此等肽為在位置4、5、6、11、12、14及/或15具有特定天然氨基酸取代的 CNP-17變體。在又一實(shí)施例中，本文視情況排除對(duì)應(yīng)于以下的肽hCNP-53 6er47Ala)、 hCNP-53(Met48Gln)、hCNP-53 (Met48Ala)及 hCNP-53(C 端)-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr 在一實(shí)施例中，本文視情況排除如US 7,276,481中特定揭示的SEQ ID NO :1_4 及6-71的肽。在另一實(shí)施例中，本文視情況排除US 7，276，481中一般性揭示的SEQ ID NO 5 的肽，其中此等肽為在 Leu9、LyslO、LeulU Serl6、Metl7、Glyl9 及 / 或 Leu20 具有至少一個(gè)天然氨基酸取代的CNP17變體。在又一實(shí)施例中，視情況排除CNP17或其變體含有N-Me-Phe7或N-Me-Phe7及N-Me-Leull的CNP17變體。在另一實(shí)施例中，本文視情況排除融合或偶聯(lián)至生長激素(GH)、類胰島素生長因子I(IGF-I)或甲狀腺激素(TH)的如US 7，276，481中揭示的SEQ ID NO :5的CNP17變體。在另一實(shí)施例中，視情況排除CNP22融合至GH、IGF-I或TH或經(jīng)由接頭(例如肽接頭)連接至GH、IGF-I或TH的CNP22變體。在又一實(shí)施例中，視情況排除CNP17或其變體在N端或C端偶聯(lián)至生物素或熒光素的CNP17變體。在另一實(shí)施例中，本文視情況排除如US 5，434，133中特定揭示的化合物第1_27 號(hào)及SEQ ID N0:l-17、22-24、30、31及40-42的肽。在另一實(shí)施例中，本文視情況排除US 5，434，133中一般性揭示的SEQ ID NO :18-21及25-29的肽。在又一實(shí)施例中，本文視情況排除如WO 94/20534中特定揭示的SEQ ID NO :1_4及9的肽。然而，在一些實(shí)施例中，本文仍包括本文中視情況排除的利鈉(例如CNP)肽、片段及變體的使用方法，以及包含此等利鈉(例如CNP)肽、片段及變體的醫(yī)藥組合物(包括無菌醫(yī)藥組合物)。C. CNP變體的合成及純化在一些實(shí)施例中，本文所述的CNP變體藉由重組表達(dá)，使用此項(xiàng)技術(shù)中已知的某些技術(shù)(在某些實(shí)施例中)來產(chǎn)生。例如參看Sambrook，F(xiàn)ritsch及Maniatis，Molecular Cloning =A Laboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè))，第2版。冷泉灣實(shí)驗(yàn)室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)(Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)) ；DNA Cloning A Practical Approach (DNA 克隆實(shí)驗(yàn)方法)，第 I 及第 II 卷，D. N. Glover 編(1985)；及 Current Protocols in Molecular Biology (分子生物學(xué)目前方法)，John Wiley&Sons, Inc. (1994)。
在某些實(shí)施例中，藉由重組方法產(chǎn)生本文所述的CNP變體，該重組方法包含將包含編碼CNP變體多肽的第一多核苷酸連接至編碼切割可切割肽或蛋白質(zhì)的第二多核苷酸的宿主細(xì)胞在培養(yǎng)基中在使得由這些多核苷酸編碼的融合多肽得以表達(dá)的條件下培養(yǎng)，其中該融合多肽包含CNP變體多肽直接連接至切割可切割肽或蛋白質(zhì)或經(jīng)由接頭與其間接連接。在一些實(shí)施例中，用包含編碼CNP變體多肽的多核苷酸連接至編碼切割可切割肽或蛋白質(zhì)的多核苷酸的表達(dá)載體來轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。在某些實(shí)施例中，融合多肽表達(dá)為可溶蛋白質(zhì)或包涵體?？勺运拗骷?xì)胞或培養(yǎng)基分離所表達(dá)的融合多肽，且可使經(jīng)分離的融合多肽與切割切割劑接觸以釋放CNP變體。用以產(chǎn)生CNP變體的宿主細(xì)胞可為細(xì)菌、酵母、昆蟲、非哺乳動(dòng)物脊椎動(dòng)物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。細(xì)菌細(xì)胞包括(但不限于)大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞株及菌株。大腸桿菌細(xì)胞株及菌株的非限制性實(shí)例包括BL21、BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BL21 (DE3)pGro7、 ArcticExpress (DE3)、C41 [亦稱作 C41 (DE3) ]、C43 [亦稱作 C43 (DE3) ]、Origami B (DE3)、 Origami B (DE3) pLysS、KRX 及 I\mer (DE3)。在一實(shí)施例中，使用 BL21 (DE3)細(xì)胞來產(chǎn)生 CNP 變體及CNP融合蛋白。哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括(但不限于)倉鼠、猴、黑猩猩、犬、貓、牛、豬、小鼠、大鼠、兔、綿羊及人類細(xì)胞。宿主細(xì)胞可為永生化細(xì)胞(細(xì)胞株)或非永生化(原生或次生)細(xì)胞，且可為多種細(xì)胞類型中的任一種，諸如(但不限于)成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞(例如乳腺上皮細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞)、卵巢細(xì)胞(例如中國倉鼠卵巢或CHO細(xì)胞)、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、血液的形成成分(例如淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞)、軟骨細(xì)胞及其它骨源性細(xì)胞，及此等體細(xì)胞類型的前體。在適于細(xì)胞生長、表達(dá)DNA或RNA及鑒別/ 選擇表達(dá)CNP變體的細(xì)胞的條件下培養(yǎng)含有CNP變體DNA或RNA的宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，使宿主細(xì)胞在約10°C至約40°C，或約20°C至約40°C，或約30°C 至約40°C的溫度下生長或培養(yǎng)一段時(shí)間。在某些實(shí)施例中，使宿主細(xì)胞在約20°C、22°C、 25 °C ,28 30 °C、35°C或37 °C下生長或培養(yǎng)一段時(shí)間。在某些實(shí)施例中，使宿主細(xì)胞在約 35°C或37°C下生長或培養(yǎng)一段時(shí)間。使編碼CNP變體多肽(包括CNP融合蛋白)的重組多核苷酸于包含含有表達(dá)控制序列可操作地連接至待表達(dá)核苷酸序列的重組多核苷酸的表達(dá)載體中表達(dá)。表達(dá)載體包含足夠用于表現(xiàn)的順式作用組件；其它用于表達(dá)的組件可由宿主細(xì)胞或活體外表達(dá)系統(tǒng)供應(yīng)。表達(dá)載體包括此項(xiàng)技術(shù)中已知的所有表達(dá)載體，包括(但不限于)黏質(zhì)體、質(zhì)體(例如裸質(zhì)體或含于脂質(zhì)體中的質(zhì)體)及并有重組多核苷酸的病毒。經(jīng)由轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染將表達(dá)載體插入適當(dāng)宿主細(xì)胞中以便表達(dá)編碼多肽的多核苷酸(例如參看Sambrook等人(同上文))。預(yù)期用于產(chǎn)生CNP變體(包括可切割CNP融合蛋白)的表達(dá)載體的非限制性實(shí)例包括 pjexpress、pjexpress401、pjexpress404、pET_15b、pET_21a、pET_22b、pET_31b、 pET-32a、pET-41a、pMAL、pMAL_c2X、pQE-30、pET-SUMO 及 pTYBll。特定構(gòu)建體的表達(dá)可產(chǎn)生呈包涵體形式的可溶CNP變體(包括CNP融合蛋白)或不可溶CNP變體(包括CNP融合蛋白)。在一些實(shí)施例中，使用異丙基β -D-I-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)性載體來增強(qiáng)編碼CNP變體或CNP融合蛋白的多核苷酸的表達(dá)。在一些實(shí)施例中，使宿主細(xì)胞在IPTG 存在下，在約10°C至約40 V，或約20 V至約40 V，或約30 V至約40 V的溫度下生長或培養(yǎng)一段時(shí)間。在某些實(shí)施例中，使宿主細(xì)胞在1 16存在下，在約201、221、251、281、301、35°C或37°C下生長或培養(yǎng)一段時(shí)間。在某些實(shí)施例中，使宿主細(xì)胞，在ImM IPTG存在下，在約35°C或37°C下生長或培養(yǎng)一段時(shí)間。在其它實(shí)施例中，使宿主細(xì)胞與濃度為約0. 4mM至約2mM，或約0. 4mM至約1. 5mM, 或約0. 4mM至約ImM的IPTG—起培養(yǎng)。在某些實(shí)施例中，IPTG濃度為約0. 4,0. 5,0. 6,0. 7、 0. 8,0. 9、1、1. 1,1. 2,1. 3,1. 4,1. 5,1. 6,1. 7,1. 8,1. 9 或 2mM。在一實(shí)施例中，IPTG 濃度為約 ImM。在某些實(shí)施例中，本文所述的CNP變體重組表達(dá)為包含CNP變體多肽及可切割載體蛋白或可切割標(biāo)簽(例如肽標(biāo)簽)的融合蛋白，其中該融合蛋白包含CNP變體多肽直接連接至可切割載體蛋白或標(biāo)簽或經(jīng)由接頭與其間接連接。使用載體蛋白或標(biāo)簽有助于例如檢測(cè)、分離及/或純化融合蛋白?？汕懈钶d體蛋白及標(biāo)簽包括(但不限于)組氨酸(例如六His)標(biāo)簽；人類轉(zhuǎn)錄因子TAF12(TAF12)、TAF12片段、TAF12組蛋白折疊域、TAF12的突變體及其片段、TAF12 (C/A)、TAF12 (D/E)、TAF12 (4D/4E)、TAF12 (6D/6E)、TAF12 (10D/10E)、 TAF12 (C/A 及 D/E)、TAF12 (C/A 及 4D/4E)、TAF12 (C/A 及 6D/6E)、TAF12 (C/A 及 10D/10E)； 酮類固醇異構(gòu)酶(KSI)；麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP) ； 半乳糖苷酶(β-Gal)；谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)；硫氧還蛋白(Trx)；殼多糖結(jié)合域(CBD) ；ΒΜΡ-2、ΒΜΡ-2突變體、ΒΜΡ-2 (C/A)； SUMO ；及其突變體及片段。表達(dá)構(gòu)建體可表達(dá)包含CNP變體及載體蛋白或標(biāo)簽的融合蛋白。標(biāo)簽可為賦予融合蛋白適用特性的氨基酸序列。在一實(shí)施例中，標(biāo)簽為配位體結(jié)合域，其可用以藉由將融合蛋白施加至含有該配位體的分離介質(zhì)來純化融合蛋白。舉例而言，可將包含谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)域的融合蛋白施加至含有連接有谷胱甘肽的分離介質(zhì)的層析管柱。作為另一實(shí)例，可將包含麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)作為標(biāo)簽的融合蛋白施加至含有麥芽糖的分離介質(zhì)。作為另一實(shí)例，可將包含聚組氨酸標(biāo)簽的融合蛋白施加至鎳柱，藉此聚組氨酸標(biāo)簽螯合于鎳柱有助于純化融合蛋白。在另一實(shí)施例中，標(biāo)簽為配位體。舉例而言，融合蛋白可包含谷胱甘肽作為標(biāo)簽且施加至含有連接有谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的分離介質(zhì)的層析管柱。適用于融合蛋白的載體蛋白及標(biāo)簽的非限制性實(shí)例包括(但不限于)人類轉(zhuǎn)錄因子 TAF12(TAF12)、酮類固醇異構(gòu)酶(KSI)、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、β -半乳糖苷酶(β-Gal)、 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、硫氧還蛋白(Trx)、殼多糖結(jié)合域(CBD)、BMP_2突變體(BMPM)、 SUMO、CAT、TrpE、葡萄球菌蛋白Α、鏈球菌蛋白、淀粉結(jié)合蛋白、內(nèi)葡聚糖酶A的纖維素結(jié)合域、外葡聚糖酶Cex的纖維素結(jié)合域、生物素結(jié)合域、recA, Flag、聚(His)、聚(Arg)、聚 (Asp)、聚(Gin)、聚(Phe)、聚(Cys)、綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、青色熒光蛋白、生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素、抗體表位，及其突變體及片段。為產(chǎn)生目標(biāo)CNP變體，載體蛋白或標(biāo)簽可藉助于化學(xué)切割、蛋白酶切割或切割蛋白質(zhì)自切割自融合蛋白切割。例示性化學(xué)及蛋白水解切割切割劑(切割位點(diǎn)在括號(hào)中)包括(但不限于)甲酸(Asp-Pro)、溴化氰(CNBr) (Met-X)、羥胺(Asn-Gly)、因子 fe(IEGR-X) (SEQ ID NO :230)、腸激酶(DDDDK-X) (SEQ ID NO 231), ProTEV(EXXYXQ-G) (SEQ ID NO: 232)，及SUMO蛋白酶。由于特定種類化學(xué)切割的性質(zhì)，因此使用甲酸來進(jìn)行切割可產(chǎn)生 Pro-CNP, CNBr可產(chǎn)生Met經(jīng)取代為Asn的CNP，且羥胺可產(chǎn)生Gly-CNP。或者，藉由使用不表達(dá)為融合蛋白的CNP變體的特定構(gòu)建體(例如pET-21a-CNP)，可避免化學(xué)或蛋白酶切割。 pET-21a-CNP的表達(dá)可產(chǎn)生Met-CNP?；蚰承┤诤系鞍?例如含有內(nèi)含肽CBD的融合蛋白)可經(jīng)歷自切割來產(chǎn)生CNP。在其它實(shí)施例中，融合蛋白在CNP變體與載體蛋白或標(biāo)簽(例如肽標(biāo)簽) 之間包含切割可切割肽接頭。在某些實(shí)施例中，切割可切割肽接頭選自Asp-Pro、 Asn-Gly、Met-X、Val-Asp-Asp-Arg (SEQ ID NO 233), Gly-Ser-Asp-Arg (SEQ ID NO: 234)、Ile-Thr-Asp-Arg(SEQ ID NO :235) , Pro-Gly-Asp-Arg(SEQ ID NO :236)、 Ile-Glu-Gly-Arg-X(SEQ ID NO :230) , Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-X (SEQ ID NO :231)、 Glu-X-X-Tyr-X-Gln-Gly(SEQ ID NO :232), Ala-Phe-Leu-Gly-Pro-Gly-Asp-Arg(SEQ ID NO 237)，及 MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHTCDDDDKHMD (pET_15b 接頭)(SEQ ID NO :95)，其中 X 表示氨基酸。在一些實(shí)施例中，切割可切割肽接頭系藉由選自由以下組成的群的切割切割劑切割鈀、溴化氰(CNBr)、甲酸、羥胺、梭菌蛋白酶、凝血酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胰蛋白酶樣蛋白酶、羧肽酶、腸激酶(腸肽酶)、Kex 2蛋白酶、Omp T蛋白酶、因子)(a蛋白酶、枯草桿菌蛋白、proTEV、SUMO蛋白酶、V8蛋白酶、HIV蛋白酶、鼻病毒蛋白酶、變種枯草桿菌蛋白酶、IgA蛋白酶、人類I^ace蛋白酶、膠原酶、Nia蛋白酶、脊髓灰白質(zhì)炎病毒2Apro蛋白酶、 脊髓灰白質(zhì)炎病毒3C蛋白酶、genenase、弗林蛋白酶、彈性蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、皺胃酶(凝乳酶)、微生物天冬氨酸蛋白酶、木瓜酶、鈣蛋白酶、木瓜凝乳酶、無花果酶(無花果蛋白酶)、菠蘿酶(菠蘿蛋白酶)、組織蛋白酶B、卡斯蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、內(nèi)切蛋白酶 Arg-C、內(nèi)切蛋白酶Glu-C、內(nèi)切蛋白酶Lys-C、胰舒血管素及纖維蛋白溶酶。在某些實(shí)施例中，可切割載體蛋白、標(biāo)簽(例如肽標(biāo)簽)或肽接頭系使用甲酸來切割以自融合蛋白釋放CNP變體。在一些實(shí)施例中，甲酸濃度為約至約20%，或約至約15%，或約2%至約15%，或約至約10%，或約2%至約10%，或約至約5%，或約2%至約5%。在某些實(shí)施例中，甲酸濃度為約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、 10%、11%、12%、13%、14%或15%。在某些實(shí)施例中，甲酸濃度為約2%、5%或10%。在其它實(shí)施例中，在甲酸存在下，在約20°C至約80°C，或約30°C至約75°C，或約 40°C至約75°C，或約50°C至約75°C，或約50 V至約70 V，或約55°C至約70°C，或約50 V至約60°C的溫度下進(jìn)行CNP融合蛋白切割。在一些實(shí)施例中，在甲酸存在下，在約20°C、22°C、 25°C、30°C、35°C、37°C、40°C、42°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C或 80°C下進(jìn)行切割。在某些實(shí)施例中，在甲酸存在下，在約501、551、601、651或701下進(jìn)行切割。在某些實(shí)施例中，在甲酸存在下，在約55°C或70°C下進(jìn)行切割。在其它實(shí)施例中，甲酸存在下CNP融合蛋白的切割進(jìn)行約3小時(shí)至約48小時(shí)，或約5小時(shí)至約48小時(shí)，或約5小時(shí)至約36小時(shí)，或約5小時(shí)至約M小時(shí)，或約5小時(shí)至約 18小時(shí)，或約20小時(shí)至約M小時(shí)，或約6小時(shí)至約10小時(shí)的時(shí)段。在某些實(shí)施例中，甲酸存在下的切割進(jìn)行約5小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、15小時(shí)、18小時(shí)、20小時(shí)或M小時(shí)。在一些實(shí)施例中，CNP融合蛋白的切割在約2 %、5 %或10 %甲酸存在下，在約55°C 下進(jìn)行約20小時(shí)至約36小時(shí)，或在約60°C下進(jìn)行約15小時(shí)至約M小時(shí)，或在約65°C下進(jìn)行約10小時(shí)至約21小時(shí)，或在約70°C下進(jìn)行約6小時(shí)至約18小時(shí)。在某些實(shí)施例中， CNP融合蛋白的切割在約2%甲酸存在下，在約55°C下進(jìn)行約20小時(shí)至約M或36小時(shí)，或在約60°C下進(jìn)行約15小時(shí)至約M小時(shí)，或在約65°C下進(jìn)行約10小時(shí)至約18小時(shí)，或在約70°C下進(jìn)行約6小時(shí)至約10小時(shí)。本文提供使用甲酸來切割CNP融合蛋白以得到高CNP變體產(chǎn)率的溫和條件。本文所述使用甲酸來切割融合蛋白的條件亦適用于切割包含除CNP外的多肽或蛋白質(zhì)的融合蛋白，其中這些融合蛋白含有Asp-Pro肽鍵。在其它實(shí)施例中，在CNP融合蛋白的化學(xué)切割(例如使用甲酸)或蛋白水解切割之前，先以緩沖液及/或去污劑處理可溶性CNP融合蛋白或CNP融合蛋白包涵體。緩沖液的非限制性實(shí)例包括B-PER II;經(jīng)稀釋B-PER II (例如1/20稀釋度)；B-PER ;B_PER磷酸鹽緩沖液；含有Tris的緩沖液(例如25mM Tris, pH 7. 5)；含有Tris及NaCl的緩沖液(例如25mM TrisU50mM NaCl, pH 7.9)；及PBS。在一實(shí)施例中，緩沖液為B-PER II。去污劑的非限制性實(shí)例包括辛基蔗糖、Triton X-100、Tween-20、NP-40及CA-630。去污劑可位于緩沖液中(例如，含去污劑的25mM Tris緩沖液(pH 7.5))。在某些實(shí)施例中，去污劑為 Triton X-100 或 CA-630。應(yīng)了解，上述任何方法及條件可與上述任何其它方法及條件組合使用來產(chǎn)生本文所揭示的CNP變體。在其它實(shí)施例中，本文所述的CNP變體系使用肽合成器合成且根據(jù)此項(xiàng)技術(shù)中已知的方法，例如根據(jù)Atherton^SSkppardjSolid Phase Peptide Synthesis :a Practical Approach (固相肽合成實(shí)驗(yàn)方法)JRL Press (Oxford, England (1989))的方法進(jìn)行純化。肽可基于例如CNP的以下肽序列來合成=G1LSOi或R)GC6F7G8L(K或R或Nle或 6-0H-Nle)LDRIGSMSGLGC 2。例示性CNP變體包括(但不限于)類似物A(GLSKGC(CH2NH)FGLKLDRIGSMSGLGC) (SEQ ID NO :56)通過將 C6 的主鏈”-C =0”基團(tuán)轉(zhuǎn)化為”-CH2”基團(tuán)來制得；類似物B (GLSKGC (N-Me-Phe) GLKLDRIGSMSGLGC) (SEQ ID NO 57 通過將 F7 的主鏈” -NH”基團(tuán)轉(zhuǎn)化為” -N-CH3"基團(tuán)來制得；類似物E (GLSKGC (D-Phe) GLKLDRIGSMSGLGC) (SEQ ID NO : 136)通過在 F7 使用 D-Phe來制得；類似物F(GLSKGCF(tBu-Gly)LKLDRIGSMSGLGC) (SEQ ID NO :58)通過在 G8 使用叔丁基-Gly來制得；類似物G(GLSKGC (3-Cl-Phe) GLKLDRIGSMSGLGC) (SEQ ID NO 137)通過將氯原子添加至F7的苯環(huán)的間位來制得(類似變體可通過以Cl、F、Br、OH及/或CH3對(duì)W1W的苯環(huán)進(jìn)行鄰位、間位及/或?qū)ξ蝗〈鷣懋a(chǎn)生)；且類似物H (GLSKGC [NHCH2CH (Ph) CO] GLKLDRIGSMSGLGC) (SEQ ID NO 59)通過在 F7 使用(士)-3-(氨基)-2-苯基丙酸來制得。具有例如氨基酸延伸、天然或非天然氨基酸或肽鍵等構(gòu)物的取代，及/或與聚合物或疏水部分的偶聯(lián)的CNP變體的實(shí)例包括(但不限于)類似物J C6-CH2-NH、N-Me-L9、N-Me-L20(SEQ ID NO :91)類似物K N-Me-L9、N-Me_L20(SEQ ID NO :92)類似物L(fēng) N-Me-L9、N-Me-L11、N-Me-L20(SEQ ID NO :93)類似物M N-Me_L9、N-Me-Lll (SEQ ID NO :94)類似物Z K4R、F7Y(SEQ ID NO :95)類似物AAK4R、G8V (SEQ ID NO :96)
類似物ABK4R、G8S (SEQ ID NO 97)類似物ACK4R、G8T (SEQ ID NO 98)類似物ADK4R、L9T (SEQ ID NO 99)類似物AEK4R、G15R(SEQ ID NO :100)類似物AFK4R、G15Cit(SEQ ID NO :101)類似物AGK4R、M17V(SEQ ID NO :102)類似物AHK4R(SEQ ID NO :35)類似物AJK4R、L20V (SEQ ID NO 103)類似物AKK4R、L20t-Bu_Ala(SEQ ID NO :104)類似物ATG1E、K4E (SEQ ID NO 105)類似物AVG1E、K4E-戊酸(連接于 N 端)(SEQ ID NO 106)類似物AWG1E、K4E-庚酸(連接于 N 端)(SEQ ID NO 107)類似物AXCNP17 ( Δ N 端)(SEQ ID NO 2)類似物AYGANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)類似物AZR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 41)類似物 BBGlE-庚酸(連接于 N 端)(SEQ ID NO 108)類似物BCGlE-戊酸(連接于 N 端)(SEQ ID NO 109)類似物BFK4R、KlOCit (SEQ ID NO :110)類似物BGK4R、KlOQ (SEQ ID NO :111)類似物BHK4R、KlOR (SEQ ID NO :112)類似物BJK4R、Gl5N (SEQ ID NO 113)類似物BKK4R、G15S(SEQ ID NO :114)類似物BLCNP-37 (SEQ ID NO :60)CNP-53(SEQ ID NO 4)類似物CAAAWARLLQEHPNA-CNP22 (SEQ ID NO :61)類似物CBAAWARLLQEHPNAR-CNP22 (SEQ ID NO :62)類似物CCDLRVDTKSRAAWAR-CNP22 (SEQ ID NO :63)類似物CDSPKMVQGSG-CNPI7-KVLRRH (N 端及 C 端 BNP 尾)(SEQ ID NO 68)類似物CEGERAFKAWAVARLSQ-CNP22 (HSA-CNP22) (SEQ ID NO :81)類似物CFGQPREPQVYTLPPS-CNP22 (SEQ ID NO :79)PEG (24K) -CNP22PEG (20K) -CNP22PEG (5K) -CNP22PEG (2K) -CNP22PEG(2K) -CNP17PEG (IK)-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO :36)PEG(IK) -CNP22PE04- (PE012) 3 (分支)-CNP22PE012-CNP22
PE012-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO 36)PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)；及SEQ ID NO :1至6及；34至144，及其包含至多1、2、3、4或5個(gè)其它修飾的變體。在一實(shí)施例中，CNP變體經(jīng)由在Cys6與Cys22之間形成二硫鍵來環(huán)化。Cys6可為半胱氨酸類似物，諸如高半胱氨酸或青霉胺。在另一實(shí)施例中，CNP變體可通過頭至尾、側(cè)鏈至側(cè)鏈、側(cè)鏈至頭或側(cè)鏈至尾形成的共價(jià)鍵來環(huán)化。在一實(shí)施例中，在位于或靠近肽的N 端的氨基酸與位于或靠近肽的C端的氨基酸(在此上下文中稱作”末端”氨基酸)之間形成共價(jià)鍵。在另一實(shí)施例中，在兩個(gè)末端氨基酸的側(cè)鏈之間形成共價(jià)鍵。在另一實(shí)施例中， 在一個(gè)末端氨基酸的側(cè)鏈與另一末端氨基酸的末端基團(tuán)之間，或在兩個(gè)末端氨基酸的末端基團(tuán)之間形成共價(jià)鍵。末端胺與末端羧基的頭至尾環(huán)化可使用多種方法來進(jìn)行，例如使用對(duì)硝基苯酯、 2，4，5-三氯苯酯、五氟苯酯、疊氮化物法、混合酸酐法、HATU、碳二亞胺(例如DIC、EDC或 DCC)及催化劑(諸如 HOBt、HONSu 或 HoAt)，或樹脂上環(huán)化(on-resin cyclization)。另外，環(huán)狀結(jié)構(gòu)可經(jīng)由涉及CNP變體的氨基酸殘基的側(cè)鏈及/或末端氨基酸殘基的橋聯(lián)基團(tuán)形成。橋聯(lián)基團(tuán)為允許肽的兩個(gè)部分環(huán)化的化學(xué)部分。橋聯(lián)基團(tuán)的非限制性實(shí)例包括酰胺、硫醚、硫酯、二硫化物、脲、氨基甲酸酯、磺酰胺及其類似物。此項(xiàng)技術(shù)中已知并入具有此等橋聯(lián)基團(tuán)的單元的多種方法。舉例而言，可在N端氨基或側(cè)鏈氨基與C端羧酸或側(cè)鏈(例如賴氨酸或鳥氨酸的側(cè)鏈，及谷氨酸或天冬氨酸的側(cè)鏈)羧基之間形成內(nèi)酰胺橋(亦即環(huán)狀酰胺)?？稍贑端羧基或側(cè)鏈羧基與半胱氨酸或半胱氨酸類似物的側(cè)鏈硫醇基之間形成硫酯?；蛘?，可藉由摻入羊毛硫氨酸(硫代二丙氨酸)殘基以連接藉由硫醚鍵共價(jià)鍵合在一起的丙氨酸殘基來形成交聯(lián)。在另一方法中，諸如二羧酸(例如辛二酸(suberic acid/octanedioic acid))的交聯(lián)劑可連接氨基酸側(cè)鏈的官能基(諸如游離氨基、羥基及硫醇基)。亦可使用酶催化環(huán)化。舉例而言，已報(bào)導(dǎo)可使用短桿菌酪肽(tyrocidine)合成酶的硫酯酶域來環(huán)化硫酯前體，可使用枯草桿菌蛋白突變體來環(huán)化肽羥乙酸苯丙氨酰基酰胺酯，且可使用抗體連接酶16G3來環(huán)化對(duì)硝基苯基酯。關(guān)于肽環(huán)化的回顧，請(qǐng)參看Davies， J. Peptide Sci.(肽科學(xué)雜志)，9 :471-501 (2003)，其以全文引用的方式并入本文中。在某些實(shí)施例中，最終環(huán)化產(chǎn)物具有至少約70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、95 %、 96%、97%、98%或至少約99%的純度。D.經(jīng)化學(xué)修飾的CNP變體CNP22或其變體的化學(xué)修飾可可能賦予經(jīng)修飾CNP肽以有利特性，諸如穩(wěn)定性及半衰期增加及免疫原性降低(有關(guān)對(duì)治療蛋白的化學(xué)修飾的一般論述，請(qǐng)參看 Wmrmazie (藥物)，57(1) :5_29 (2002))。舉例而言，使天然或合成的聚合或非聚合部分 (例如PEG)連接至CNP肽以將CNP肽的總質(zhì)量增至本文一般描述的范圍(例如約2. 6kDa 或2. 8kDa至約6kDa或7kDa的范圍)可降低經(jīng)修飾肽對(duì)外肽酶及/或內(nèi)肽酶(例如 NEP)活體內(nèi)切割的敏感性。除聚乙二醇化、糖基化及其它化學(xué)衍生化程序(例如藉由磷酸化、酰胺化、羧基化、乙?；?、甲基化及產(chǎn)生酸加成鹽來進(jìn)行修飾)外，酰胺、酯及N-酰基衍生物亦可潛在地遮蔽免疫原性區(qū)域及/或蛋白水解敏感區(qū)域Science (科學(xué))，303 480-482(2004))ο化學(xué)修飾的實(shí)例包括(但不限于)用于改良穩(wěn)定性及蛋白酶抗性且降低免疫原性的Bednarsaki的聚合物添力口法及Altus Corporation的交聯(lián)法。Bednarsaki顯示聚合物添加可改良蛋白質(zhì)的溫度穩(wěn)定性(J. Am. Chem. Soc.(美國化學(xué)學(xué)報(bào))，114(1) 378-380(199 )，且Altus Corporation發(fā)現(xiàn)戊二醛交聯(lián)可改良酶穩(wěn)定性。多肽的化學(xué)修飾可以非特異性方式(產(chǎn)生衍生物質(zhì)的混合物)，或以位點(diǎn)特異性方式(例如基于野生型大分子反應(yīng)性引導(dǎo)的衍生化，及/或使用定點(diǎn)突變誘發(fā)與化學(xué)修飾的組合的位點(diǎn)選擇性修飾)，或者使用所表達(dá)蛋白質(zhì)連接法來進(jìn)行(Curr.Opin. Biotechnol.(生物技術(shù)目前觀點(diǎn))，I3 (4) =297-303 (2002)) 聚乙二醇化CNP變體在一實(shí)施例中，為增強(qiáng)穩(wěn)定性(例如對(duì)NEP降解的抗性)，使CNP22或其變體(包括具有氨基酸添加、取代及/或缺失的變體)偶聯(lián)至親水性天然或合成聚合物，以將經(jīng)修飾 CNP肽的總質(zhì)量增至約2. 6kDa或2. 8kDa至約4、5、6、7kDa或7kDa以上的范圍。在某些實(shí)施例中，所添加的親水性聚合物具有約0. 6,0. 8、1、1. 2,1. 4,1. 6,1. 8、2、2. 2,2. 4,2. 6,2. 8、 3,3. 2,3. 4,3. 6,3. 8、4、4· 2,4. 4,4. 6,4. 8kDa 或約 5kDa 的總質(zhì)量。在一實(shí)施例中，親水性聚合物具有水溶性，以便與其偶聯(lián)的CNP肽在水性(例如生理)環(huán)境下不會(huì)沉淀出來。此外，親水性聚合物具有生物兼容性，亦即不會(huì)在活體內(nèi)引起損傷、毒性或免疫反應(yīng)。親水性聚合物可為分支或未分支聚合物。在一實(shí)施例中，親水性聚合物未分支。CNP22或其變體可能與親水性聚合物在各種位點(diǎn)偶聯(lián)，包括(但不限于)(1)僅在N端；⑵僅在C端；(3)僅在內(nèi)部位點(diǎn)(例如Lys4) ； (4)在N端與C端；(5)在N端及內(nèi)部位點(diǎn)；及(6)在C端及內(nèi)部位點(diǎn)。在一實(shí)施例中，CNP22或其變體僅在N端偶聯(lián)至親水性聚合物。在另一實(shí)施例中，僅在內(nèi)部位點(diǎn)(例如Lys4)偶聯(lián)。在另一實(shí)施例中，在N端及內(nèi)部位點(diǎn)(例如Lys4)偶聯(lián)。在又一實(shí)施例中，為達(dá)成更佳功能性，CNP肽不在環(huán)狀域(對(duì)應(yīng)于CNP22的Cys6至Cys22)內(nèi)的位點(diǎn)(例如LyslO)偶聯(lián)至親水性聚合物。若與親水性聚合物的偶聯(lián)系基于與CNP肽上的反應(yīng)性伯氨基形成鍵，則可藉由以側(cè)鏈上不含反應(yīng)性伯氨基的天然或非天然氨基酸或肽模擬物(諸如Gly、Ser, Arg、Asn、Gin、Asp、Glu或瓜氨酸 (Cit))取代Lys4及/或LyslO來防止在內(nèi)部位點(diǎn)(例如Lys4及/或LyslO)偶聯(lián)。在一特定實(shí)施例中，Lys4及/或LyslO經(jīng)Arg置換。在另一實(shí)施例中，LyslO未經(jīng)Arg置換。親水性聚合物的非限制性實(shí)例包括自帶有羧酸的單體(例如甲基丙烯酸(MA) 及丙烯酸(AA))形成的聚合物；聚乙烯醇；自帶有羥基的單體(例如甲基丙烯酸羥乙酯 (HEMA)、甲基丙烯酸羥丙酯(HPMA)、羥丙基甲基丙烯酰胺，及甲基丙烯酸3-三甲基硅烷基丙酯(TMSPMA))形成的聚合物；聚環(huán)氧烷；聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)；聚(乙二醇) (PEG)；聚(丙二醇)；單C1-Cltl烷氧基-PEG(例如單甲氧基-PEG)；三氟乙磺?；鶈渭籽趸?PEG ；芳氧基-PEG ；PEG丙烯酸酯(PEGA) ；PEG甲基丙烯酸酯；PEG丙醛；雙丁二酰亞氨基碳酸酯PEG ;2_甲基丙烯酰氧基乙基-磷酸膽堿(MPC)與N-乙烯基吡咯啶酮(VP)的共聚物；羥基官能性聚(N-乙烯基吡咯啶酮)(PVP) ；SIS-PEG(SIS為聚苯乙烯-聚異丁烯-聚苯乙烯嵌段共聚物)；聚苯乙烯-PEG;聚異丁烯-PEG ；PCL-PEG(PCL為聚己內(nèi)酯)； PLA-PEG(PLA為聚乳酸)；PMMA-PEG(PMMA為聚(甲基丙烯酸甲酯))；PDMS-PEG(PDMS為聚二甲基氧環(huán)己酮(polydimethyloxanone)) ；PVDF-PEG(PVDF 為聚偏二氟乙烯)；PLUR0NIC 界面活性劑(聚環(huán)氧丙烷-共-聚乙二醇) ’聚(伸丁二醇) ’聚(L-賴氨酸-g-乙二醇)(PLL-g-PEG)；聚(L-賴氨酸-g-透明質(zhì)酸)(PLL-g-HA)；聚(L-賴氨酸-g-磷酰膽堿)(PLL-g-PC) ’聚(L-賴氨酸-g-乙烯基吡咯啶酮)(PLL-g-PVP)；聚(乙亞胺-g-乙二醇)(PEI-g-PEG)；聚(乙亞胺-g_透明質(zhì)酸)(PEI-g-HA)；聚(乙亞胺-g-磷酰膽堿) (PEI-g-PC)；聚(乙亞胺-g-乙烯基吡咯啶酮)(PEI-g-PVP) ；PLL-共-HA、PLL-共-PC、 PLL-共-PVP、PEI-共-PEG、PEI-共-HA、PEI_ 共 _PC、PEI_ 共-PVP、纖維素及其衍生物(例如羥乙基纖維素)；聚葡萄糖；糊精；透明質(zhì)酸及其衍生物(例如透明質(zhì)酸鈉)；彈性蛋白； 殼聚糖；丙烯酸硫酸酯；丙烯酸磺酸酯；丙烯酸氨基苯磺酸酯；甲基丙烯酸硫酸酯；甲基丙烯酸磺酸酯；甲基丙烯酸氨基苯磺酸酯；其聚合物及共聚物；及其組合的聚合物及共聚物。在一特定實(shí)施例中，親水性聚合物為聚(乙二醇)(PEG)，亦稱聚(環(huán)氧乙烷) (PEO)。如本文中所用，術(shù)語”PEG”或”ΡΕ0”包括可用于衍生多肽的PEG的所有形式(分支及未分支)，包括(但不限于)單(C1-Cltl)烷氧基-PEG及芳氧基-PEG。在一實(shí)施例中，PEG-CNP偶聯(lián)物包含式(CH2CH2O)n的PEG(或ΡΕ0)聚合物，其中η 為約6至約100的整數(shù)，且PEG聚合物為約0. 3kDa至約5kDa。在另一實(shí)施例中，η為約12 至約50的整數(shù)，且PEG聚合物為約0.6kDa至約2. 5kDa。在另一實(shí)施例中，η為約12至約 24，且PEG聚合物為約0. 6kDa至約1. 2kDa。在另一實(shí)施例中，PEG聚合物的末端羥基經(jīng)非反應(yīng)性基團(tuán)封端。在一特定實(shí)施例中，封端基團(tuán)為烷基，例如低級(jí)烷基，諸如甲基，以使PEG 聚合物以烷氧基終止。在一實(shí)施例中，PEG聚合物未分支。在另一實(shí)施例中，CNP22或其變體僅在N端偶聯(lián)至PEG聚合物。PEG及PEO視其制備方式而可能包括具有分子量分布的分子，亦即，其可能具有多分散性。聚合制劑的大小/質(zhì)量分布在統(tǒng)計(jì)學(xué)上可由其重量平均分子量(Mw)及其數(shù)目平均分子量(Mn)表征，其比率系稱作多分散性指數(shù)(Mw/Mn)。Mw及Mn可藉由質(zhì)譜法量測(cè)。偶聯(lián)至大于1. 5kDa的PEG部分的PEG-CNP變體可因母體PEG分子的多分散性質(zhì)而顯示分子量范圍。舉例而言，在mPEGI (Sunbright ME-020HS, NOF Co.)的情況下，PEG分子的分子量分布于約1. 5kDa至約3kDa的范圍內(nèi)，多分散性指數(shù)為1. 036。相反，使用皮爾斯生物技術(shù) (Pierce Biotechnology)(洛克福德，伊利諾斯州)的 MS (PEG)n 試劑(n = 4、8、12 或 24， 表示為例如”ΡΕ012”或”ΡΕ0Μ”)偶聯(lián)至CNP22或其變體的PEG具有單分散性，具有不連續(xù)鏈長及規(guī)定分子量。用于產(chǎn)生包含PEG部分的多肽的方法為此項(xiàng)技術(shù)中所已知(例如參看美國專利 5，824，784)。制備聚乙二醇化CNP肽的方法一般包含以下步驟(a)使CNP22或其變體與聚乙二醇化試劑在適于將PEG連接至CNP肽(例如在N端)的條件下反應(yīng)，及(b)獲得反應(yīng)產(chǎn)物。因?yàn)閷?duì)CNP肽進(jìn)行聚乙二醇化可顯著改變其與NPR-B的結(jié)合，所以可視PEG部分的大小及聚乙二醇化的位置而定，探索不同種類的PEG及聚乙二醇化反應(yīng)條件?？捎糜趯?duì) CNP肽進(jìn)行聚乙二醇化的化學(xué)包括使用甲氧基-PEG(0-[(N- 丁二酰亞氨基氧基羰基)-甲基]-0’-甲基聚乙二醇)的NHS酯對(duì)肽的反應(yīng)性伯胺進(jìn)行?；Ｒ约籽趸?PEG-NHS或甲氧基-PEG-SPA進(jìn)行?；a(chǎn)生消除初始伯胺的任何電荷的酰胺鍵。以符號(hào)”PE012”或”ΡΕ0Μ” 表示的PEG-CNP肽，以及以符號(hào)”PEG1K”、”PEG (”、”PEG ”或”PEG20K”表示的肽系經(jīng)由肽上的伯氨基與經(jīng)NHS酯活化、甲氧基封端的PEG試劑反應(yīng)來進(jìn)行聚乙二醇化。PEG-CNP變體亦可藉由其它方法，例如經(jīng)由涉及肽上的伯氨基及PEG醛(諸如PEG-丙醛)或其單C1-Cltl 烷氧基或芳氧基衍生物的還原性胺化來制備(參看美國專利5，252，714)。不同于核糖體蛋白質(zhì)合成，合成肽的合成系自C端進(jìn)行至N端。因此，Boc-PEG(含有第三丁氧羰基(Boc))為一種將PEG連接至肽的C端的方法(R.B.Merrifield，J.Am. Chem. Soc.(美國化學(xué)學(xué)報(bào))，85 (14) :2149-2154 (1963))?；蛘呖刹捎肍moc (弗基甲氧羰基)化學(xué)(E. Atherton 及 R. C. Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis :a Practical Approach (固相肽合成實(shí)驗(yàn)方法)，IRL Press (Oxford，England (1989))。制備PEG-CNP變體的本發(fā)明方法提供聚合物-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的實(shí)質(zhì)上均質(zhì)混合物。純化之后，不連續(xù)PEG-CNP制劑對(duì)于生物特性的活體外及活體內(nèi)測(cè)試足夠純。如本文中所表明，某些PEG-CNP變體顯示對(duì)NEP切割的敏感性降低及實(shí)質(zhì)上類似或更佳的功能性 (例如刺激cGMP產(chǎn)生)。如本文所述，使用適當(dāng)聚乙二醇化試劑/CNP肽比率及反應(yīng)條件進(jìn)行的CNP22或其變體的聚乙二醇化反應(yīng)提供PEG-CNP衍生物。聚乙二醇化的性質(zhì)及程度可使用例如PAGE 及HPLC分析來測(cè)定。在某些實(shí)施例中，至少約50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %或99 %的 CNP22或其變體在N端經(jīng)單聚乙二醇化。為優(yōu)化聚乙二醇化對(duì)CNP肽的生物特性的有利影響，可改變聚合物長度、構(gòu)型(例如分支或線性)，及/或PEG部分的官能化(例如添加帶負(fù)電基團(tuán))。針對(duì)NEP抗性、藥物動(dòng)力學(xué)及生物活性(例如結(jié)合NPR-B及刺激cGMP產(chǎn)生的能力)對(duì)聚乙二醇化CNP變體進(jìn)行測(cè)試?？衫缬诨铙w外在基于大鼠軟骨肉瘤細(xì)胞的軟骨發(fā)育不全模型中，及于活體內(nèi)在鼠類軟骨發(fā)育不全動(dòng)物模型中進(jìn)一步測(cè)試顯示獲改良NEP抗性及CNP22的cGMP刺激活性的至少約50%的聚乙二醇化CNP變體。 E.使用CNP變體的方法、CNP變體的醫(yī)藥組合物，及給藥途徑使用CNP變體的方法骨相關(guān)病癥成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)在骨形成方面起重要作用，且FGF受體基因(FGFR 1、 2及3)的突變導(dǎo)致多種遺傳性骨骼畸形(Curr. Biol.(目前生物學(xué))，5 :500-507 (1995))。 特別是，F(xiàn)GFR-3的活化突變?cè)斐砷L骨病癥，包括軟骨發(fā)育不全(人類遺傳性侏儒癥的最常見形式)(Nature (自然)，371 :252-254(1994) ；Cell (細(xì)胞)，78 :335_；342 (1994))，較輕度病癥軟骨發(fā)育低下(Ann. N. Y. Acad. Sci.(紐約科學(xué)年報(bào)),785 182-187 (1996))，及較嚴(yán)重及新生兒致死性第I型及第II型侏儒癥性發(fā)育不全(TD) (Hum. Mol. Genet.(人分子遺傳學(xué))，5 :509-512(1996) ；Nat. Genet.(自然遺傳學(xué))，9 :321-3 (1995))。過度表達(dá) FGF-2 且從而活化FGFR-3的小鼠模型顯示長骨縮短及巨頭畸形(Mol. Biol. Cell (分子生物學(xué)，細(xì)胞)，6 :1861-73(1995))。與此模型相符，缺乏FGFR-3的小鼠顯示顯著的骨骼過度生長與較寬生長板(Nature Genet.(自然遺傳學(xué))，12 :390-397 (1996))。使用CNP、NPR-B及NPR-C的互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)表明肽配位體、相應(yīng)受體與骨生長之間的聯(lián)系。在轉(zhuǎn)殖基因小鼠中藉由提高血漿濃度的CNP來活化NPR-B引起骨骼過度生長(Nat. Med.(自然醫(yī)學(xué))，10 :80-86 0004))，此在組織學(xué)上類似于FGFR-3基因敲除小鼠的生長板軟骨的情形(Nat. Genet.，4 :390-397 (1996))。在NPR-C基因敲除小鼠中，應(yīng)消除NPR-C 介導(dǎo)的CNP清除；與此預(yù)測(cè)相符，基因敲除動(dòng)物顯示延長的長骨及延長的椎骨與脊柱隆凸 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 :7403-08 (1999))。相反，CNP基因敲除的小鼠因長骨及椎骨較短而矮化(表型在組織學(xué)上類似于軟骨發(fā)育不全)，且因咬合異常及肺受小胸腔限制而致使死亡率增加(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98 :4016-4021 (2001))。與所提出的 CNP 作為 NPR-B的活化劑的作用相符，NPR-B基因敲除小鼠與CNP基因敲除小鼠具有相同矮化骨骼表型及增加的死亡率(Proc. Natl. Acad. Sci USA, 101 17300-05 (2004))。此外，在軟骨中具有活化FGFR-3的軟骨發(fā)育不全的小鼠模型中，軟骨細(xì)胞中CNP的靶向過度表達(dá)對(duì)抗侏儒癥 Wasoda等人，Nat. Med.(自然醫(yī)學(xué))，10 :80-86 (2004))。另外，已顯示CNP在調(diào)節(jié)軟骨內(nèi)骨生長及軟骨細(xì)胞活性方面起作用，包括(但不限于)軟骨細(xì)胞增殖及分化、抑制有絲分裂原活化蛋白(MAP)激酶/MEK(Raf-I)激酶信號(hào)傳導(dǎo)路徑及促進(jìn)軟骨內(nèi)骨化Wasoda等人， Nat. Med.(自然醫(yī)學(xué))，10 :80-86(2004)).此等結(jié)果表明CNP/NPR-B系統(tǒng)的活化為治療人類軟骨發(fā)育不全的潛在治療策略。本文的CNP變體藉由刺激基質(zhì)產(chǎn)生、使軟骨細(xì)胞增殖及分化及增強(qiáng)長骨生長而適用于治療患骨相關(guān)病癥(諸如骨骼發(fā)育不良)的哺乳動(dòng)物，包括人類。CNP反應(yīng)性骨相關(guān)病癥及骨骼發(fā)育不良的非限制性實(shí)例包括軟骨發(fā)育不全、軟骨發(fā)育低下、身材矮小、侏儒癥、骨軟骨發(fā)育不全、致死性軟骨發(fā)育不全、成骨不全、軟骨成長不全、斑點(diǎn)狀軟骨發(fā)育異常、同型合子軟骨發(fā)育不全、斑點(diǎn)狀軟骨發(fā)育異常、屈肢骨發(fā)育不良、先天性致死性低磷酸酯酶癥、周產(chǎn)期致死型成骨不全、短肋骨綜合征多指綜合征、軟骨發(fā)育低下、肢根型斑點(diǎn)狀軟骨發(fā)育異常、詹森型干骺端發(fā)育不良(Jansen-type metaphyseal dysplasia)、生HH本 ^ 勾 ^^良(spondyloepiphyseal dysplasia congenita) > 骨發(fā)育不全癥(atelosteogenesis)、骨畸形性發(fā)育不良(diastrophic dysplasia)、 先天性短股骨、朗格型肢中部發(fā)育不良(Langer-type mesomelic dysplasia)、尼弗哥特型肢中部發(fā)育不良(Nievergelt-type mesomelic dysplasia)、綜合征羅比撓綜合征(Robinow syndrome)、綜合征萊茵哈特綜合征(Reinhardt syndrome)、肢端發(fā)育不全(acrodysostosis)、周圍性骨發(fā)育不全、克尼斯特發(fā)育不良(Kniest dysplasia)、纖維軟骨發(fā)生(fibrochondrogenesis)、綜合征羅伯茨綜合征(Roberts syndrome)、肢端肢中發(fā)育不全、短肢畸形、莫基奧綜合征(Morquio syndrome)、克尼斯特綜合征(Kniest syndrome)、后生營養(yǎng)性發(fā)育不良(metatrophic dysplasia)及脊椎干骺端發(fā)育不良 (spondyloepimetaphyseal dysplasia)。此外，CNP變體適用于生長激素的輔助物或替代物以便治療特發(fā)性身材矮小及其它骨骼發(fā)育不良。另外，CNP變體適用于治療其它骨相關(guān)病狀及病癥，諸如佝僂病、低磷酸鹽血癥性佝僂病[包括X染色體連鎖低磷酸鹽血癥性佝僂病(亦稱為抗維生素D佝僂病)及常染色體顯性低磷酸鹽血癥性佝僂病]，及軟骨病[包括腫瘤誘發(fā)的軟骨病(亦稱為致癌軟骨病或致癌低磷酸鹽血性軟骨病)]。本文的CNP變體亦可用以治療骨關(guān)節(jié)炎。骨關(guān)節(jié)炎為關(guān)節(jié)軟骨的退化性疾病且通常發(fā)生于老年人中。骨關(guān)節(jié)炎涉及軟骨破壞及由關(guān)節(jié)組件退化所致的骨與軟骨的增生性變化，其中該變化導(dǎo)致繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎(例如滑膜炎)。在骨關(guān)節(jié)炎中，作為軟骨的功能性實(shí)體的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)減少，且軟骨細(xì)胞數(shù)目減少(Arth. Iiheum. 46 (8) 1986-1996 (2002)) 0 藉由促進(jìn)基質(zhì)產(chǎn)生、軟骨細(xì)胞生長及分化，CNP變體適用于在患關(guān)節(jié)炎(包括骨關(guān)節(jié)炎)的個(gè)體中抗衡FGF-2的不當(dāng)作用及增加基質(zhì)合成，藉此治療關(guān)節(jié)炎，包括骨關(guān)節(jié)炎。血管平滑肌病癥
CNP及其它血管活性肽(包括ANP、BNP及尿舒血管素(urodilatin))具有血管擴(kuò)張及利尿特性且在心血管內(nèi)穩(wěn)定中起重要作用(J. Cardiovasc. Pharmaco 1.(心血管藥物學(xué)雜志)，117 =1600-06(1998) ；Kidney Int.(國際腎臟)，49 :1732-37(1996)； Am. J. Physiol.(美國生理學(xué)雜志)，275 :H1826_1833 (1998))。CNP廣泛分布于心血管系統(tǒng)中，尤其以高濃度分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞中(J. Cardiovasc. Wiarmacol.(心血管藥物學(xué)雜志)，117 :1600-06(1998))。CNP為血管平滑肌(尤其在冠狀循環(huán)中)的有效松弛劑 (Biochem. Biophys. Res. Commun.，(生物化學(xué)生物物理研究通訊)205 :765-771 (1994))， 且為平滑肌細(xì)胞增殖的抑制劑(Biochem. Biophys. Res. Commun.，(生物化學(xué)生物物理研究通訊)177 :927-931 (1991))。盡管CNP的血管擴(kuò)張作用的效力不如ANP強(qiáng)(約1 100) (Hypertens. Res.(高血壓研究)，21 :7_13 (1998) ；Am. J. Physiol.(美國生理學(xué)雜志)，
275:L645-L652(1998))，但在發(fā)炎性心血管病理學(xué)中，CNP mRNA回應(yīng)于剪切應(yīng)力而增加(FEBS Lett. (FEBS 通信)，373 :108-110 (1995))，且 CNP 的血菜含量升高(Biochem. Biophys. Res. Commun.，(生物化學(xué)生物物理研究通訊)198 1177-1182 (1994))。已顯示 CNP經(jīng)由抑制巨噬細(xì)胞浸潤于兔的受損頸動(dòng)脈中來抑制發(fā)炎(Circ.Res.(循環(huán)研究)， 91 :1063-1069^00 ),且經(jīng)由NPR-B/cGMP依賴性路徑直接抑制心臟成纖維細(xì)胞增殖 (Endocrinology (內(nèi)分泌學(xué))，144 :2279-2284 (2003)) CNP的心血管作用系經(jīng)由NPR亞型NPR-B及NPR-C的活化來介導(dǎo) (Endocrinology (內(nèi)分泌學(xué))，130 :229-239 (1992))，NPR-C 占活體內(nèi)表達(dá)的 NPR 的 95% (Science (科學(xué))，293 1657-1662 (2001))。CNP/NPR-B 路徑在心血管系統(tǒng)中引起 cGMP (公認(rèn)第二信使)升高。NPR-C的C端的37個(gè)氨基酸部分具有與異源三聚G蛋白Gi相互作用的共同序列(J. Biol. Chem.(生物化學(xué)雜志)，274 17587-17592 (1999))，已顯示該異源三聚G蛋白Gi調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶及磷脂酶C活性(J. Biol. Chem.(生物化學(xué)雜志)，
276:22064-70(2001) ；Am. J. Physiol.(美國生理學(xué)雜志)，278 :G974-980 (2000) J. Biol. Chem.(生物化學(xué)雜志)，271 19324-19329 (1996)) CNP經(jīng)由NPR-C的活化及G蛋白調(diào)節(jié)的內(nèi)向性整流K+通道的開啟來介導(dǎo)平滑肌超極化及松弛(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100 :1426-1431(2003)).同樣，CNP在心臟成纖維細(xì)胞中具有重要抗增殖作用，且經(jīng)由與 NPR-C相互作用使平滑肌細(xì)胞超極化來調(diào)節(jié)局部血液流動(dòng)及全身血壓(R. Rose及I Giles, J. Physiol.(生理學(xué)雜志)586 :353-366 (2008))。CNP22通過結(jié)合于血管平滑肌細(xì)胞上的NPR-B來刺激cGMP的產(chǎn)生，cGMP充當(dāng)細(xì)胞內(nèi)第二信使以最終使得血管松弛?；贑NP的降血壓作用，本文的CNP變體適用于治療高血壓、充血性心臟衰竭、心原性水腫、腎水腫、肝原性水腫、急性及慢性腎功能不全等。另外， cGMP信號(hào)傳導(dǎo)的活化抑制血管平滑肌細(xì)胞的生長。因此，本文的CNP變體可用以治療由血管平滑肌細(xì)胞的異常生長所致的病狀或疾病，包括(但不限于)再狹窄及動(dòng)脈硬化。上述研究表明，CNP可為用于血管平滑肌松弛及重塑的潛在治療候選物。CNP對(duì)于某些病癥的藥理作用部分地歸因于血管保護(hù)作用而非血管擴(kuò)張活性(Am. J. Respir. Crit. Care Med.(美國呼吸道重癥監(jiān)護(hù)醫(yī)學(xué)雜志)，170 :1204-1211 (2004))。因此，本文的CNP變體適用于治療CNP可具有血管保護(hù)作用的病狀，例如血管平滑肌病癥，該血管保護(hù)作用包括(但不限于)誘導(dǎo)平滑肌松弛及抑制巨噬細(xì)胞浸潤于心臟組織中。在一實(shí)施例中，使用 CNP變體來治療心臟衰竭，包括(但不限于)急性代償失調(diào)性心臟衰竭及急性充血性心臟衰竭。在另一實(shí)施例中，使用CNP變體來治療哮喘、心肌癥及冠狀動(dòng)脈再狹窄(藉由增強(qiáng)平滑肌細(xì)胞松弛及減少平滑肌細(xì)胞增殖)。CNP變體的醫(yī)藥組合物在其它實(shí)施例中，本文提供醫(yī)藥組合物，其包含CNP變體及一或多種醫(yī)藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體及/或稀釋劑。在某些實(shí)施例中，這些組合物進(jìn)一步包含一或多種其它生物活性劑(例如蛋白酶、受體酪氨酸激酶及/或清除受體NPR-C的抑制劑)。在一些實(shí)施例中，組合物包含純度為至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、 96%、97%、98%或99%的所需CNP變體。在某些實(shí)施例中，組合物含有少于約10%、5%、 4^^3^^2^^1%或0.5%大分子污染物，諸如其它哺乳動(dòng)物(例如人類)蛋白質(zhì)及其它 CNP變體。賦形劑、載體及稀釋劑的非限制性實(shí)例包括載體、液體、緩沖劑、等張劑、添加劑、 穩(wěn)定劑、防腐劑、增溶劑、界面活性劑、乳化劑、濕潤劑、佐劑等。組合物可含有液體(例如水、乙醇)；各種緩沖劑內(nèi)容物(例如Tris-HCl、磷酸鹽、乙酸鹽緩沖劑、檸檬酸鹽緩沖劑)、 PH值及離子強(qiáng)度的稀釋劑；去污劑及增溶劑(例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)；抗氧化劑(例如甲硫氨酸、抗壞血酸、偏亞硫酸氫鈉)；防腐劑(例如硫柳汞(Thimerosol)、苯甲醇、間甲酚)；及增積物質(zhì)(bulking substance)(例如乳糖、甘露糖醇、蔗糖)。在此項(xiàng)技術(shù)中已知在醫(yī)藥組合物的制劑中使用賦形劑、稀釋劑及載體；例如參看Remington’ s Pharmaceutical Sciences (Remington 藥典)，第 18 版，第 1435-1712 頁,Mack Publishing Co. (Easton，Pennsylvania(1990))，其系以其全文引用的方式并入本文中。舉例而言，載體包括(但不限于)稀釋劑、載體及佐劑，以及植入運(yùn)載體，及不與活性成分反應(yīng)的惰性無毒固體或液體填充劑及囊封材料。載體的非限制性實(shí)例包括磷酸鹽緩沖鹽水、生理鹽水、水及乳液(例如油/水乳液)。載體可為含有例如乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇及其類似物)、植物油及其混合物的溶劑或分散介質(zhì)。在一些實(shí)施例中，組合物為液體制劑。在某些實(shí)施例中，制劑包含濃度范圍為約 0. lmg/ml 至約 20mg/ml，或約 0. 5mg/ml 至約 20mg/ml，或約 lmg/ml 至約 20mg/ml，或約 0. lmg/ml 至約 10mg/ml，或約 0. 5mg/ml 至約 10mg/ml，或約 lmg/ml 至約 10mg/ml 的 CNP 變體。在其它實(shí)施例中，組合物包含緩沖溶液或緩沖劑以維持含CNP的溶液或懸浮液的 PH值在所需范圍內(nèi)。緩沖溶液的非限制性實(shí)例包括磷酸鹽緩沖鹽水、Tris緩沖鹽水及亨克氏緩沖鹽水(Hank's buffered saline)。緩沖劑包括(但不限于)乙酸鈉、磷酸鈉及檸檬酸鈉。亦可使用緩沖劑的混合物。在某些實(shí)施例中，緩沖劑為乙酸/乙酸鹽或檸檬酸/檸檬酸鹽。適用于組合物中的緩沖劑的量部分視所用特定緩沖劑及溶液或懸浮液的所需PH值而定。舉例而言，乙酸鹽為在PH 5下比在pH 6下更有效的pH值緩沖劑，因此在pH 5的溶液中可使用比PH 6的溶液中所用較少的乙酸鹽。在一些實(shí)施例中，緩沖劑具有約IOmM 士 5mM 的濃度。在某些實(shí)施例中，組合物的PH值為約pH 3至約pH 7.5,或約pH 3. 5至約pH 7， 或約pH 3. 5至約pH 6. 5，或約pH 4至約pH 6，或約pH 4至約pH 5，或?yàn)榧spH 5.0 士 1.0。在其它實(shí)施例中，組合物含有等張調(diào)節(jié)劑以使得溶液或懸浮液等張且更兼容以便注射。等張劑的非限制性實(shí)例包括NaCl、葡聚糖、葡萄糖、丙三醇、山梨糖醇、木糖醇及乙醇。在某些實(shí)施例中，等張劑為NaCl。在某些實(shí)施例中，NaCl濃度為約160士20mM，或約
81140mM士 20mM，或約 120 士 20mM，或約 IOOmM士 20mM，或約 80mM士 20mM，或約 60mM士 20mM。在其它實(shí)施例中，組合物包含防腐劑。防腐劑包括(但不限于)間甲酚及苯甲醇。 在某些實(shí)施例中，防腐劑濃度為約0.4% 士0.2%，或約士0.5%，或約1.5% 士0.5%， 或約 2. 0% 士0. 5%。在其它實(shí)施例中，組合物含有抗吸附劑(例如以減輕CNP變體吸附至玻璃或塑料)。抗吸附劑包括(但不限于)苯甲醇、聚山梨醇酯20及聚山梨醇酯80。在某些實(shí)施例中，抗吸附劑濃度為約0. 001 %至約0. 5%，或約0. 01 %至約0. 5%，或約0. 1 %至約1 %，或約0.5%至約1%，或約0.5%至約1. 5%，或約0.5%至約2%，或約1%至約2%。在其它實(shí)施例中，組合物包含穩(wěn)定劑。穩(wěn)定劑的非限制性實(shí)例包括丙三醇、甘油、 硫甘油、甲硫氨酸及抗壞血酸及其鹽。在一些實(shí)施例中，當(dāng)穩(wěn)定劑為硫甘油或抗壞血酸或其鹽時(shí)，穩(wěn)定劑濃度為約0. 至約1%。在其它實(shí)施例中，當(dāng)穩(wěn)定劑為甲硫氨酸時(shí)，穩(wěn)定劑濃度為約0. 01 %至約0. 5 %，或約0. 01 %至約0. 2 %。在其它實(shí)施例中，當(dāng)穩(wěn)定劑為丙三醇時(shí)， 穩(wěn)定劑濃度為約5%至約100% (純)。在其它實(shí)施例中，組合物含有抗氧化劑。例示性抗氧化劑包括(但不限于)甲硫氨酸及抗壞血酸。在某些實(shí)施例中，抗氧化劑與CNP變體的摩爾比為約0. 1 1至約15 1， 或約1 1至約15 1，或約0.5 1至約10 1，或約1 1至約10 1，或約3 1至約 10 1。組合物中可使用醫(yī)藥學(xué)上可接受的鹽，包括(但不限于)無機(jī)酸鹽(例如鹽酸鹽、 氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽)、有機(jī)酸鹽(例如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽、甲磺酸鹽、甲苯磺酸鹽)，及胺鹽(例如異丙胺、三甲胺、二環(huán)己胺、二乙醇胺)。醫(yī)藥學(xué)上可接受的鹽的全面討論可見于 Remington’ s Pharmaceutical Sciences (Remington 藥典)，第 18 版， Mack Publishing Company, (Easton, Pennsylvania(1990))中。醫(yī)藥組合物可以各種形式給予，諸如錠劑、膠囊、顆粒劑、粉末、溶液、懸浮液、乳液、軟膏及經(jīng)皮貼片。組合物的劑型可據(jù)組合物的所需給予模式來調(diào)整。對(duì)于經(jīng)口給予，組合物可采用例如錠劑或膠囊(包括軟凝膠膠囊)的形式，或可為例如水性或非水性溶液、懸浮液或糖漿。供經(jīng)口給予的錠劑及膠囊可包括一或多種常用賦形劑、稀釋劑及載體，諸如甘露糖醇、乳糖、葡萄糖、蔗糖、淀粉、玉米淀粉、糖精鈉、滑石、纖維素、碳酸鎂及潤滑劑(例如硬脂酸鎂、硬脂酰反丁烯二酸鈉)。必要時(shí)，可將調(diào)味劑、著色劑及/或甜味劑添加至固體及液體制劑中。用于經(jīng)口制劑的其它可選成分包括(但不限于)防腐劑、懸浮劑及增稠劑。 經(jīng)口制劑亦可具有腸溶衣以保護(hù)CNP變體不受胃部的酸性環(huán)境影響。制備固體及液體劑型的方法為已知，或本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見(例如參看上文所參考的Remington藥典 (Remington 藥典))。供非經(jīng)腸給予的制劑可制備為例如液體溶液或懸浮液，制備為適于在注射之前溶解或懸浮于液體介質(zhì)中的固體形式，或制備為乳液。舉例而言，可根據(jù)此項(xiàng)技術(shù)中已知的技術(shù)，使用適合稀釋劑、載體、溶劑(例如緩沖水溶液、林葛爾氏溶液(Ringer’ s solution), 等張氯化鈉溶液)、分散劑、濕潤劑、乳化劑、懸浮劑及其類似物來調(diào)配無菌可注射溶液及懸浮液。另外，可使用無菌不揮發(fā)性油、脂肪酸酯、多元醇及/或其它非活性成分。作為其它實(shí)例，供非經(jīng)腸給予的制劑包括無菌可注射水溶液，其可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑，及使制劑與預(yù)定接受者的血液等張的溶質(zhì)；及水性及非水性無菌懸浮液，其可含有懸浮劑及增稠劑。包含CNP變體的組合物亦可為凍干制劑。在某些實(shí)施例中，凍干制劑包含緩沖劑及膨脹劑，及視情況選用的抗氧化劑。例示性緩沖劑包括(但不限于)乙酸鹽緩沖劑及檸檬酸鹽緩沖劑。例示性膨脹劑包括(但不限于)甘露糖醇、蔗糖、聚葡萄糖、乳糖、海藻糖及聚維酮(PVP K24).在某些實(shí)施例中，甘露糖醇的量為約3%至約10%，或約4%至約8%， 或約4 %至約6 %。在某些實(shí)施例中，蔗糖的量為約6 %至約20 %，或約6 %至約15 %，或約 8%至約12%。例示性抗氧化劑包括(但不限于)甲硫氨酸及抗壞血酸。本文亦提供試劑盒，其含有例如包含液體(例如無菌可注射液體)制劑或固體 (例如凍干固體)制劑的瓶、小瓶、安瓿、管、藥筒及/或針筒。這些試劑盒亦可含有醫(yī)藥學(xué)上可接受的載體或運(yùn)載體(例如溶劑、溶液及/或緩沖液)以便將固體(例如凍干固體) 制劑復(fù)原成溶液或懸浮液以便給予(例如通過注射)，包括(但不限于)在針筒中復(fù)原凍干制劑以便注射或?qū)饪s物稀釋至較低濃度。此外，可自例如包含含有CNP的組合物的無菌散劑、顆粒劑或錠劑制備臨時(shí)注射溶液及懸浮液。試劑盒亦可包括分配裝置，諸如噴霧器， 或注射分配裝置、筆式注射器、自動(dòng)注射器、無針注射器、針筒及/或針。作為一非限制性實(shí)例，試劑盒可包括具有單腔室或雙腔室的針筒。對(duì)于單腔室針筒，單腔室可含有備用于注射的液體CNP制劑，或固體(例如凍干固體)CNP制劑或CNP變體于相對(duì)較小量的適合溶劑系統(tǒng)(例如丙三醇)中的液體制劑，其可復(fù)原成溶液或懸浮液以便注射。對(duì)于雙腔室針筒，一個(gè)腔室可含有醫(yī)藥學(xué)上可接受的載體或運(yùn)載體(例如溶劑系統(tǒng)、溶液或緩沖液)，且另一腔室可含有固體(例如凍干固體)CNP制劑或CNP變體于相對(duì)較小量的適合溶劑系統(tǒng)(例如丙三醇)中的液體制劑，其可使用來自第一腔室的載體或運(yùn)載體復(fù)原成溶液或懸浮液以便注射。作為另一實(shí)例，試劑盒可包括一或多個(gè)筆式注射器或自動(dòng)注射器裝置，及雙腔室藥筒。藥筒的一個(gè)腔室可含有醫(yī)藥學(xué)上可接受的載體或運(yùn)載體(例如溶劑系統(tǒng)、溶液或緩沖液)，且另一腔室可含有固體(例如凍干固體)CNP制劑或CNP變體于相對(duì)較小量的適合溶劑系統(tǒng)(例如丙三醇)中的液體制劑，其可使用來自第一腔室的載體或運(yùn)載體復(fù)原成溶液或懸浮液以便注射。藥筒可包含足以歷經(jīng)所需時(shí)段(例如1日、2日、3日、1周、2周、3 周、4周等)給藥的量的CNP變體。可調(diào)節(jié)筆式注射器或自動(dòng)注射器以自藥筒給予所需量的 CNP制劑。另外，可將包含CNP變體的醫(yī)藥組合物調(diào)配為緩慢釋放、控制釋放或持續(xù)釋放系統(tǒng)以便歷經(jīng)所需時(shí)段(諸如1周、2周、3周、1個(gè)月、2個(gè)月或3個(gè)月)維持相對(duì)恒定的劑量濃度。如在此項(xiàng)技術(shù)中所已知，緩慢釋放、控制釋放及持續(xù)釋放制劑可使用例如生物可降解的聚合系統(tǒng){其可包含例如親水性聚合物[例如聚丙交酯、聚乙交酯、聚(丙交酯-乙交酯)]}來制備，且可采用例如微粒、微球體或脂質(zhì)體的形式。給藥劑量及頻率如本文中所用，術(shù)語活性劑(例如CNP變體)的”治療有效量”指向患者提供治療益處的量。該量可在個(gè)體之間不同及可視許多因素(包括患者的總體身體狀況)而定。熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者使用公開可得的材料及程序可容易地確定CNP變體的治療有效量。舉例而言，基于患有軟骨發(fā)育不全的0-17歲兒童014名女性及189名男性)的生長圖表 (其列出年齡別身高(height for age)、頭圍及體節(jié)生長(segmental growth))，用于療法的CNP變體的量應(yīng)得到可接受的生長速率(Horton WA等人，Standard growth curves for achondroplasia(軟骨發(fā)育不全的標(biāo)準(zhǔn)生長曲線)，J. Pediatr.(兒科雜志)，93 435-8(1978))。⑶C圖表可用以評(píng)估年齡別體重及身高別體重或年齡別BMI。亦可量測(cè)使用實(shí)質(zhì)上較長療程獲得的次要結(jié)果。血清半衰期長于野生型CNP22的CNP變體可潛在地以低于CNP22的頻率給予。特定個(gè)體的給藥頻率可視多種因素(包括所治療的病癥，及個(gè)體的狀況及對(duì)療法的反應(yīng))而變。在某些實(shí)施例中，約每日一次、每兩日一次、每三日一次或每周一次給予個(gè)體含有CNP 變體的醫(yī)藥組合物。在一實(shí)施例中，為治療骨相關(guān)病癥(例如骨骼發(fā)育不良，包括軟骨發(fā)育不全)，給予患者每日或每周劑量的CNP變體直至成人為止及/或貫穿成人期。本文所述的CNP變體可以治療有效劑量給予患者以治療、改善或預(yù)防骨相關(guān)病癥 (例如骨骼發(fā)育不良，包括軟骨發(fā)育不全)及CNP可提供血管保護(hù)作用的病狀(例如血管平滑肌病癥)?？捎诩?xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中藉由標(biāo)準(zhǔn)藥理學(xué)程序，諸如藉由測(cè)定LD5tl(對(duì) 50%群體致死的劑量)及ED5tl (在50%群體中治療有效的劑量)來測(cè)定CNP變體的安全性及治療功效。毒性作用與治療作用之間的劑量比率為治療指數(shù)且其可以比率LD5tZED5tl形式表示。顯示大治療指數(shù)的活性劑通常較佳。獲自細(xì)胞培養(yǎng)分析法及動(dòng)物研究的數(shù)據(jù)可用以調(diào)配供人類使用的劑量范圍。該劑量通常處于循環(huán)濃度(包括ED5tl)的范圍內(nèi)，其中毒性極小或最小。該劑量可視所用劑型及所用給藥途徑而在此范圍內(nèi)變化。治療有效劑量可由細(xì)胞培養(yǎng)分析法及動(dòng)物研究測(cè)定。在某些實(shí)施例中，本文所述的CNP變體系以約5或10nmol/kg至約300nmol/kg， 或約20nmol/kg至約200nmol/kg范圍內(nèi)的劑量給予。在一些實(shí)施例中，以約5、10、15、20、 25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、125、130、140、150、160、 170、175、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、350、400、450、500、 750、1000、1250、1500、1750或2000nmol/kg的劑量或治療醫(yī)師認(rèn)為適當(dāng)?shù)钠渌鼊┝拷o予 CNP 變體。在其它實(shí)施例中，以約 5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、 150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、 900、950或1000口8/1^或約 1,1. 25,1. 5、2、2· 5、3、3· 5、4、4· 5、5、5· 5、6、6· 5、7、7· 5、8、8· 5、 9、9. 5或10mg/kg的劑量，或治療醫(yī)師認(rèn)為適當(dāng)?shù)钠渌鼊┝拷o予CNP變體。本文所述的CNP 變體的劑量可根據(jù)本文所述的給藥頻率/給藥頻率來給予，這些頻率包括(但不限于)每日、每周2或3次、每周、每2周、每3周、每月等。對(duì)于特定個(gè)體，給予/給予CNP變體的頻率可視包括以下的多種因素而變化所治療的病癥、及個(gè)體的狀況、及對(duì)療法的反應(yīng)?？梢詥未蝿┝炕蛞悦看谓o藥多次劑量的形式給予CNP變體。在某些實(shí)施例中，以如下頻率給予CNP變體單次劑量或多次劑量、每日、每隔一日、每3日、每周2次、每周3次、每周、每兩周、每3周、每月、每6周、每2個(gè)月、每3個(gè)月，或治療醫(yī)師認(rèn)為適當(dāng)?shù)念l率。在一些實(shí)施例中，給予CNP變體以便留出生長期(例如軟骨生成)，接著為恢復(fù)期 (例如骨生成)。舉例而言，可靜脈內(nèi)、皮下，或藉由另一模式每日或每周多次給予CNP變體持續(xù)一段時(shí)間，接著為無治療時(shí)期，接著重復(fù)該循環(huán)。在一些實(shí)施例中，初始治療期(例如每日或每周多次給予CNP變體)持續(xù)3日、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、 10周、11周或12周。在一相關(guān)實(shí)施例中，無治療時(shí)期持續(xù)3日、1周、2周、3周或4周。在某些實(shí)施例中，CNP變體的給藥療程為每日給藥持續(xù)3日，接著3日不給藥；或每日或每周多次給藥持續(xù)1周，接著3日或1周不給藥；或每日或每周多次給藥持續(xù)2周，接著1或2 周不給藥；或每日或每周多次給藥持續(xù)3周，接著1、2或3周不給藥；或每日或每周多次給藥持續(xù)4、5、6、7、8、9、10、11或12周，接著1、2、3或4周不給藥。給藥模式可以多種方式(諸如通過皮下、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)或鞘內(nèi)注射)來給予個(gè)體CNP變體或包含其的醫(yī)藥組合物。在一實(shí)施例中，藉由一日一次單次皮下、 靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)或鞘內(nèi)注射來給予CNP變體。亦可通過在疾病部位或其附近直接注射來給予CNP變體。此外，可通過在目標(biāo)作用部位(例如異常骨或發(fā)育不全骨)植入儲(chǔ)積器來給予CNP變體?；蛘?，可于舌下方經(jīng)舌下(例如舌下錠劑)或通過吸入肺中(例如吸入劑或氣霧劑噴霧)、通過傳遞至鼻腔中(例如鼻內(nèi)噴霧)、通過傳遞至眼內(nèi)(例如滴眼劑)或通過經(jīng)皮傳遞(例如藉助于皮膚貼片)來給予CNP變體。CNP變體亦可以微球體、微囊、脂質(zhì)體(不帶電或帶電(例如陽離子型))、 聚合微粒(例如聚酰胺、聚丙交酯、聚乙交酯、聚(丙交酯-乙交酯))、微乳液及其類似物的形式經(jīng)口給予。另一給藥方法通過滲透泵(例如Alzet泵)或微型泵(例如Alzet微型滲透泵) 來給予，這些泵允許控制、連續(xù)及/或緩釋傳遞CNP變體或醫(yī)藥組合物持續(xù)預(yù)定時(shí)期。滲透泵或微型泵可植入目標(biāo)部位(例如肢干的長骨、骨骺等)或目標(biāo)部位附近的皮下。如上所說明，CNP變體可用以治療由血管平滑肌細(xì)胞異常生長引起的病狀或疾病， 包括(但不限于)再狹窄及動(dòng)脈硬化。為將CNP變體局部傳遞至患病身體血管(例如血管)，可借助植入于患病部位的醫(yī)學(xué)裝置(例如血管內(nèi)支架)來傳遞CNP變體。在一實(shí)施例中，將CNP變體浸漬于安置于血管內(nèi)支架上的聚合基質(zhì)或聚合涂層內(nèi)。在另一實(shí)施例中， CNP變體包含在形成于血管內(nèi)支架內(nèi)且由CNP變體可擴(kuò)散穿過的多孔聚合膜或聚合層覆蓋的儲(chǔ)集器或通道內(nèi)。如在此項(xiàng)技術(shù)中所已知，聚合基質(zhì)、涂層、膜或?qū)涌砂辽僖环N生物可降解(例如親水性)聚合物。在另一實(shí)施例中，CNP變體可含于血管內(nèi)支架體中的微孔內(nèi)?？勺匝軆?nèi)支架通過爆發(fā)式釋放、脈沖釋放、控制釋放或持續(xù)釋放或其組合來傳遞CNP 變體。舉例而言，血管內(nèi)支架可依次以爆發(fā)式釋放及持續(xù)釋放的方式將CNP變體局部傳遞至患病部位。持續(xù)釋放可持續(xù)多達(dá)約2周、1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月或1年的時(shí)期。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白，CNP變體或其組合物亦可通過其它模式給予。CNP變體或其組合物的最有效給藥模式的決定在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能范圍內(nèi)。CNP變體可以醫(yī)藥制劑形式給予，這些醫(yī)藥制劑適用于例如經(jīng)口(包括頰內(nèi)及舌下)、經(jīng)直腸、經(jīng)鼻、表面、經(jīng)肺、經(jīng)陰道或非經(jīng)腸(包括肌肉內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、皮下及靜脈內(nèi))給予，或呈適于通過吸入或吹入給予的形式。視預(yù)定給藥模式而定，醫(yī)藥制劑可呈固體、半固體或液體劑型，諸如錠劑、栓劑、丸劑、膠囊、散劑、液體、懸浮液、乳液、乳膏、軟膏、 洗劑及其類似物?？梢赃m于單次給予精確劑量的單位劑型提供制劑。這些制劑包含有效量的CNP變體，及一或多種醫(yī)藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體及/或稀釋劑，及視情況選用的一或多種其它生物活性劑。組合療法在一實(shí)施例中，CNP變體可與一或多種適用于治療、改善或預(yù)防CNP反應(yīng)性病狀或病癥(諸如骨相關(guān)病癥(例如骨骼發(fā)育不良)及血管平滑肌病癥)的其它活性劑組合使用。 其它活性劑可增強(qiáng)CNP變體的作用及/或除CNP變體的作用外亦發(fā)揮其它藥理學(xué)作用。可與本文所述的CNP變體組合使用的活性劑的非限制性實(shí)例為其它利鈉肽(例如BNP)，及肽酶及蛋白酶(例如NEP及弗林蛋白酶)、NPR-C及酪氨酸激酶(例如FGFR-3)的抑制劑(例如拮抗劑)。NEP抑制劑可通過防止CNP變體的NEP切割來延長變體的半衰期。NEP抑制劑的實(shí)例包括(但不限于)塞奧芬及坎沙曲。共同使用NPR-C抑制劑亦可經(jīng)由抑制NPR-C對(duì)變體的清除來延長CNP變體的半衰期。NPR-C抑制劑的非限制性實(shí)例為片段reiPMDRIGRNPR(SEQ ID NO 82)，其將在目標(biāo)部位(例如骨生長板)于reiPMDRIGRNPR-CNP22嵌合體(類似物 CZ) (SEQ ID NO 82)或包含CNP22的變體(例如相對(duì)于CNP22含有氨基酸取代、添加及/或缺失的變體)的類似嵌合體的蛋白水解切割后釋放。共同使用酪氨酸激酶抑制劑可通過抑制酪氨酸激酶受體FGFR-3(—種軟骨細(xì)胞及骨生長的負(fù)調(diào)節(jié)劑)來增強(qiáng)CNP的效果。酪氨酸激酶抑制劑的非限制性實(shí)例包括U. S. 6，329，375及6，344，459中所揭示者。為在組合療法中達(dá)成適當(dāng)治療結(jié)果，一般將給予個(gè)體有效產(chǎn)生所需治療結(jié)果(例如恢復(fù)骨生長)的組合量的CNP組合物與其它治療劑。此方法可涉及同時(shí)給予CNP組合物與其它治療劑。同時(shí)給予可藉由給予包括CNP變體與其它治療劑的單一組合物或藥理學(xué)蛋白質(zhì)制劑來達(dá)成。或者，其它治療劑可與CNP變體的藥理學(xué)制劑(例如錠劑、注射液或飲齊U)大致在同時(shí)分別服用。亦可將CNP變體調(diào)配于適于攝取的食物(諸如核仁巧克力蛋糕 (brownies)、薄餅或蛋糕)中。在其它替代療程中，給予CNP變體可在給予其它治療劑之前或之后，間隔數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)范圍內(nèi)的時(shí)間進(jìn)行。在分別給予其它治療劑及CNP組合物的實(shí)施例中，一般將確保CNP變體及其它治療劑在彼此適當(dāng)?shù)臅r(shí)間內(nèi)給予，以使CNP變體及其它治療劑可對(duì)患者發(fā)揮協(xié)同或加成的有利作用。舉例而言，可在其它治療劑的約0. 5-6小時(shí)內(nèi)(之前或之后) 給予CNP組合物。在一實(shí)施例中，CNP組合物在其它治療劑的約1小時(shí)內(nèi)(之前或之后)給予。鑒別及監(jiān)測(cè)患者群體可建立鑒別適于CNP療法的個(gè)體及確定指定患者對(duì)CNP療法是否有反應(yīng)的療程。 舉例而言，對(duì)于治療骨相關(guān)病癥，可量測(cè)生長指標(biāo)，諸如子宮內(nèi)(in utero)及新生兒的長骨生長量測(cè)值，及骨生長生物標(biāo)記(諸如CNP、cGMP、膠原蛋白II、骨鈣化素及增殖細(xì)胞核抗原 (PCNA))的量測(cè)值。一種CNP信號(hào)傳導(dǎo)標(biāo)記為cGMP (鳥苷3’，5’環(huán)狀單磷酸)。在CNP結(jié)合并活化其同源受體NPR-B之后，此細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)分子的含量增加?？勺訡NP暴露后的細(xì)胞培養(yǎng)抽提物(活體外)、自CNP暴露后的骨外植體研究(離體)的條件培養(yǎng)基，及皮下、靜脈內(nèi)或經(jīng)由此項(xiàng)技術(shù)中已知的其它給藥途徑給予CNP的數(shù)分鐘內(nèi)的血漿(活體內(nèi))量測(cè)提高的cGMP含量。亦可量測(cè)軟骨及骨特異性分析物(或軟骨及骨相關(guān)標(biāo)記)來評(píng)估CNP功效。舉例而言，切割的第II型膠原蛋白的片段為軟骨更新的軟骨特異性標(biāo)記。第II型膠原蛋白為軟骨的主要有機(jī)組分且在軟骨更新之后，第II型膠原蛋白的片段(切割的膠原蛋白)釋放于循環(huán)中，且隨后分泌于尿中。軟骨更新之后形成新骨?？闪繙y(cè)的骨形成的骨特異性生物標(biāo)記為第I型原膠原的N端前肽(PINP)。因?yàn)榈贗型膠原蛋白為骨基質(zhì)中的主要有機(jī)組分，所以第I型膠原蛋白的合成為骨形成中的重要步驟。在膠原蛋白合成期間，前肽自原膠原分子釋放且可在血清中檢測(cè)到。另外，可量測(cè)第I型膠原蛋白的片段作為骨吸收標(biāo)記。軟骨及骨形成及生長的其它可能生物標(biāo)記包括聚集蛋白聚糖硫酸軟骨素(軟骨更新的軟骨特異性標(biāo)記)、第II型膠原蛋白的前肽(軟骨形成的軟骨特異性標(biāo)記)、堿性磷酸酶(骨特異性)及骨鈣化素(骨形成的骨特異性標(biāo)記)。可使用市售試劑盒，例如在來自功效/藥效學(xué)活體內(nèi)研究及來自離體研究的條件培養(yǎng)基的血清中量測(cè)軟骨及骨相關(guān)生物標(biāo)記。在一實(shí)施例中，在已給予CNP變體的個(gè)體中分析或量測(cè)至少一種骨或軟骨相關(guān)生物標(biāo)記的含量以監(jiān)測(cè)CNP變體在活體內(nèi)對(duì)骨及軟骨形成及生長的作用。舉例而言，至少一種骨或軟骨相關(guān)生物標(biāo)記的含量增加可表明給予CNP變體對(duì)骨生長具有積極作用且為適用于與CNP活性降低相關(guān)的骨骼發(fā)育不良及其它骨或軟骨相關(guān)疾病或病癥的治療。例示性骨或軟骨相關(guān)生物標(biāo)記包括(但不限于):CNP(例如內(nèi)源性含量的CNP)、cGMP、第II型膠原蛋白的前肽及其片段、第II型膠原蛋白及其片段、骨鈣化素、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、第 I型原膠原的前肽(PINP)及其片段、第I型膠原蛋白及其片段、聚集蛋白聚糖硫酸軟骨素及堿性磷酸酶。在一實(shí)施例中，通過自將給予、正給予或已給予CNP變體的個(gè)體獲得生物樣品來量測(cè)生物標(biāo)記?？墒褂么隧?xiàng)技術(shù)中已知的技術(shù)來量測(cè)生物標(biāo)記，這些技術(shù)包括(但不限于) 蛋白質(zhì)印跡分析(Western Blot)、酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)及酶活性分析法。生物樣品可為血液、血清、尿液或其它生物流體。本文的其它態(tài)樣及細(xì)節(jié)將自以下實(shí)例顯而易見，這些實(shí)例意欲說明而不具限制性。實(shí)施例實(shí)例1CNP變體的合成使用本文所述的方法制備CNP變體。在CNP22的野生型序列的各別氨基酸殘基處， 以天然或非天然氨基酸或肽模擬物進(jìn)行取代，如表1_3(展示于實(shí)施例3中)中所示。在某些變體中，將額外氨基酸添加至完整野生型CNP22序列或野生型CNP22序列的一部分的N 末端及/或C末端(參看表3)。亦制備PEG (或ΡΕ0)部分偶聯(lián)至CNP22或其變體的N端的CNP變體(參看實(shí)施例 3中所示的表4)。聚乙二醇化試劑可獲自表5中所示的商業(yè)來源。表 5—喪貨商產(chǎn)品名稱名稱MW(Da)聚乙二醇化試劑
Sunbright~^pfg90k ~CH3(CH2CH20)450-(CH2)5
N0F ME-200CSmPEG20K20，_ COO-NHS
SunbrightmPFG,K,000 CH3(CH2CH20)110-(CH2)5
N0F ME-050CSmPEG5K5，_ COO-NHS
(甲基-PEG12)[CH3(CH2CH20)12]3-(CH2
Pierce 3-PEG4-NHS； ^^' J2,400 CH20)4-NHC0(CH2)3-C00
酯3棚4-NHS
SunbrightmPFG2K2 000 CH3(CH2CH20)45-(CH2)5C
N0F ME-020HSmPEG2K2，000 00_NHS
SunbrightniPFG2K2 non CH3(CH2CH20)45-(CH2)5C
N0F ME-020CSmPEG2K2'000 OO-NHS
SunbrightmPFr,1K! nnn CH3(CH2CH20)23-C0(CH2)
NOF ME-OlOHSmPEG1K1^00 2COO-NHS
甲某
TV Z^A XTTTC廣、…,ΟΠΛ CH3(CH2CH20)24-(CH2)2C
Pierce PEG24-NHSMS(PEG)241,200 ‘ v ’
酯
EZ連接的ρρ012φ物生物素
Pierce NHS-PEG12-^ J940 -(CH2CH20)12-(CH2)2C00-
生物素胃 NHS
Pierce Pmi2-NHSMS(PEG)12690 =^2Oi2O) G(Oi2)I
酉旨
EZ連接的生物素
Pierce NHS-PEG4-生PE04-生物素 590 -(CH2CH20)4-(CH2)2C0〇-物素 NHS 單(乳糖基酰
Pierce 氨基)LSS590
_單(丁二酰亞_
權(quán)利要求
1. 一種C型利鈉肽(CNP)的變體，其系選自由以下組成的群GDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-CNP53)(SEQ ID NO 179)；PDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-CNP53) (SEQ ID NO 185)；MDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-CNP53)(SEQ ID NO 190)；DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP-53(M48N)](SEQ ID NO 180)；LRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-52)(SEQ ID NO:146)；RVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-51)(SEQ ID NO:147)；VDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-50) (SEQ ID NO:148)；DTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-49)(SEQ ID NO :149)； TKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-48)(SEQ ID NO :150)； KSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-47)(SEQ ID NO 151)； SRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-46)(SEQ ID NO :152)； RAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-45)(SEQ ID NO :153)； AAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-44)(SEQ ID NO :154)； AWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-43)(SEQ ID NO :155)； WARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-42)(SEQ ID NO :156)； ARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMS GLGC(CNP-41)(SEQ ID NO :157)； RLLQEHPNARKYKGANKKGL SKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-40)(SEQ ID NO :158)； LLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-39)(SEQ ID NO :159)； LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-38)(SEQ ID NO :160)； QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(SEQ ID NO :60)； EHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-36)(SEQ ID NO 161)； HPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-35)(SEQ ID NO :162)； PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34) (SEQ ID NO 163)； NARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-33)(SEQ ID NO :164)； ARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-32)(SEQ ID NO :165)； RKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-31)(SEQ ID NO :166)； KYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-30)(SEQ ID NO :167)； YKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-29)(SEQ ID NO :168)； KGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-28)(SEQ ID NO :169)； GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-27)(SEQ ID NO :170)； ANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-26)(SEQ ID NO :171)；NKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-25)(SEQ ID NO :172)； KKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-24)(SEQ ID NO :173)； KGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-23)(SEQ ID NO :174)； LSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-21)(SEQ ID NO :175)； SKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-20)(SEQ ID NO :176)； KGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-19)(SEQ ID NO :177)； GCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-18)(SEQ ID NO :178)；QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP37(M32N)](SEQ ID NO :182)； PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-CNP37)(SEQ ID NO :186)； MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-CNP37)(SEQ ID NO :192)； GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-CNP37)(SEQ ID NO :75)； GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[Gly-CNP37(M32N)](SEQ ID NO 181)； PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP37)(SEQ ID NO :145)； MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-Gly-CNP37)(SEQ ID NO 191)； GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(HSA-CNP27)(SEQ ID NO :144)； GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[HSA-CNP27(M22N)](SEQ ID NO :183)]； PGHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-HSA-CNP27)(SEQ ID NO :188)； MGHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-HSA-CNP 27)(SEQ ID NO :193)； GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[CNP27(K4,5,9R)](SEQ ID NO :36)； GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP27(K4，5，9R，M22N)] (SEQ ID NO :184)； PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Pro-CNP27(K4, 5,9R)](SEQ ID NO :189)； MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Met-CNP27(K4, 5,9R)](SEQ ID NO :194)； PEG1K-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEG1K-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO :36)； PEG1K-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[PEG1K-CNP27 (K4,5,9R, M22N) ] (SEQ ID NO :184)； PEGlK-PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEGlK-Pro-CNP27(K4,5,9R) ](SEQ ID NO :189)； PEG1K-MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEG1K-Met-CNP27(K4,5,9R) ](SEQ ID NO :194)； PE012-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PE012-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO :36)； PE012-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[PE012-CNP27 (K4,5,9R, M22N) ] (SEQ ID NO :184)； PE012-PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PE012-Pro-CNP27(K4,5,9R)](SEQ ID NO :189)； PE012-MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PE012-Met-CNP27(K4,5,9R)] (SEQ ID NO :194)； PE024-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PE024-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO :36)； PE024-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[PE024-CNP27(K4,5,9R,M22N)](SEQ ID NO :184)； PE024-PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PE024-Pro-CNP27(K4, 5, 9R) ](SEQ ID NO 189)；及PE024-MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PE024-Met-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO :194)。
2.一種醫(yī)藥組合物，其包含CNP變體，及醫(yī)藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑。
3.如權(quán)利要求2所述的組合物，其為凍干制劑。
4.如權(quán)利要求3所述的組合物，其中所述凍干制劑是用包含pH值為約4至約6的緩沖液的制劑制備的。
5.如權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述緩沖液是檸檬酸/檸檬酸鹽緩沖液或乙酸/ 乙酸鹽緩沖液。
6.如權(quán)利要求4或5所述的組合物，其中該凍干制劑用進(jìn)一步包含等張調(diào)節(jié)劑或膨脹劑的制劑制備。
7.如權(quán)利要求6所述的組合物，其中等張調(diào)節(jié)劑或膨脹劑選自甘露醇、蔗糖、山梨醇及其組合。
8.如權(quán)利要求4-7任一所述的組合物，其中該凍干制劑用進(jìn)一步包含抗氧化劑的制劑制備。
9.如權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述抗氧化劑選自甲硫氨酸、抗壞血酸、抗壞血酸的鹽形式、硫甘油及其組合。
10.如權(quán)利要求2-9任一所述的組合物，其中該CNP變體是權(quán)利要求1所述的CNP變體。
11.一種如權(quán)利要求1所述的CNP變體或如權(quán)利要求2-10任一所述的藥物組合物， 用于治療選自骨關(guān)節(jié)炎、低磷酸鹽血癥性佝僂病、軟骨發(fā)育不全、軟骨發(fā)育低下、身材矮小、侏儒癥、骨軟骨發(fā)育不全、致死性軟骨發(fā)育不全、成骨不全、軟骨成長不全、斑點(diǎn)狀軟骨發(fā)育異常、同型合子軟骨發(fā)育不全、斑點(diǎn)狀軟骨發(fā)育異常、屈肢骨發(fā)育不良、先天性致死性低磷酸酯酶癥、圍產(chǎn)期致死型成骨不全、短肋骨多指綜合征、軟骨發(fā)育低下、肢根型斑點(diǎn)狀軟骨發(fā)育異常、詹森型干骺端發(fā)育不良(Jansen-type metaphyseal dysplasia), 先天性椎體骨飯結(jié)構(gòu)不良(spondyloepiphyseal dysplasia congenita)、骨發(fā)育不全癥 (atelosteogenesis)、骨畸形性發(fā)育不良(diastrophic dysplasia)、先天性短股骨、朗格型肢中部發(fā)育不良(Langer-type mesomelic dysplasia)、尼弗哥特型肢中部發(fā)育不良 (Nievergelt-type mesomelic dysplasia)、羅比接綜合征(Robinow syndrome)、萊茵哈特綜合征(Reinhardt syndrome)、肢端發(fā)育不全(acrodysostosis)、周圍性骨發(fā)育不全、克尼斯特發(fā)育不良(Kniest dysplasia)、纖維軟骨發(fā)生(f ibrochondrogenesis)、羅伯茨綜合征(Roberts syndrome)、肢端肢中發(fā)育不全(acromesomelic dysplasia)、短肢畸形、莫基奧綜合征(Morquio syndrome)、克尼斯特綜合征(Kniest syndrome)、后生營養(yǎng)性發(fā)育不良 (metatrophic dysplasia) ^Wffi^FtliJiM^W^· E^ (spondyloepimetaphyseal dysplasia) 的骨相關(guān)病癥或骨骼發(fā)育不良。
12.如權(quán)利要求11所述的CNP變體或藥物組合物，其中該骨相關(guān)病癥或骨骼發(fā)育不良為軟骨發(fā)育不全。
13.一種如權(quán)利要求1所述的CNP變體或如權(quán)利要求2-10任一所述的藥物組合物，用于治療選自高血壓、再狹窄、動(dòng)脈硬化、急性代償失調(diào)性心臟衰竭、充血性心臟衰竭、心原性水腫、腎水腫、肝原性水腫、急性腎功能不全及慢性腎功能不全的血管平滑肌病癥。
14.一種重組產(chǎn)生CNP變體的方法，其包括使包含編碼CNP變體多肽的第一多核苷酸連接至編碼可切割肽或蛋白質(zhì)的第二多核苷酸的宿主細(xì)胞，在培養(yǎng)基中，在可以讓所述多核苷酸編碼的融合多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)，其中該融合多肽包含該CNP變體多肽直接連接至該可切割肽或蛋白質(zhì)或經(jīng)由接頭與其間接連接。
15.如權(quán)利要求14的方法，其中該宿主細(xì)胞經(jīng)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化，該表達(dá)載體包含編碼該 CNP變體多肽的多核苷酸連接至編碼該可切割肽或蛋白質(zhì)的該多核苷酸。
16.如權(quán)利要求14或15的方法，其中使用異丙基β-D-l-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG)-誘導(dǎo)型載體來增強(qiáng)編碼該融合多肽的該多核苷酸的表達(dá)。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中在約20°C至約40°C的溫度下，在約0.4mM至約 1.5mM IPTG存在下培養(yǎng)該宿主細(xì)胞一段時(shí)間。
18.如權(quán)利要求15-17任一所述的方法，其中該載體為質(zhì)體。
19.如權(quán)利要求18的方法，其中該質(zhì)體選自pjexpress、pjexpress401、 pjexpress404、pET_15b、pET_21a、pET_22b、pET_31b、pET_32a、pET_41a、pMAL、pMAL_c2X、 pQE-30、pET-SUMO及 pTYB11。
20.如權(quán)利要求14-19任一所述的方法，其中該可切割肽或蛋白質(zhì)選自組胺酸標(biāo)簽、 人類轉(zhuǎn)錄因子TAF12、TAF12片段、TAF12組蛋白折疊域、TAF12的突變體及其片段、TAF12 (C/ A)、TAF12 (D/E)、TAF12 (4D/4E)、TAF12 (6D/6E)、TAF12 (10D/10E)、TAF12 (C/A 及 D/E)、 TAF12(C/A 及 4D/4E)、TAF12 (C/A 及 6D/6E)、TAF12(C/A 及 10D/10E)、酮類固醇異構(gòu)酶、麥芽糖結(jié)合蛋白、半乳糖苷酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、硫氧還蛋白、殼多糖結(jié)合域、BMP-2、 ΒΜΡ-2突變體、BMP-2 (C/A)，及其突變體及片段。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中該可切割肽或蛋白質(zhì)選自人類轉(zhuǎn)錄因子TAF12、 TAF12片段、TAF12組蛋白折疊域、TAF12的突變體及其片段、TAF12 (C/A), TAF12 (D/E), TAF12(4D/4E)、TAF12(6D/6E)、TAF12(10D/10E)、TAF12(C/A 及 D/E)、TAF12(C/A 及 4D/4E)、 TAF12 (C/A 及 6D/6E)及 TAF12 (C/A 及 10D/10E)。
22.如權(quán)利要求14-21任一所述的方法，其中用切割劑切割所述可切割肽或蛋白。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述切割劑選自甲酸、溴化氰(CNBr)、羥胺、蛋白質(zhì)自切割、因子敘、腸激酶、ProTEV和SUMO蛋白酶。
24.如權(quán)利要求14-23任一所述的方法，其特征在于，該宿主細(xì)胞為細(xì)菌。
25.如權(quán)利要求M的方法，其中該細(xì)菌宿主細(xì)胞為大腸桿菌(E.coli)。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中該大腸桿菌細(xì)胞選自BL21、BL21(DE3)、 BL21 (DE3)pLysS、BL21 (DE3) pGro7、ArcticExpress (DE3)、C41 (DE3)、C43 (DE3)、Origami B(DE3)、Origami B(DE3)pLysS、KRX 及 Tuner(DE3)。
27.如權(quán)利要求沈所述的方法，其中該大腸桿菌細(xì)胞為BL21(DE3)。
28.如權(quán)利要求14-27任一所述的方法，其中該融合多肽表達(dá)為可溶蛋白質(zhì)或包涵體。
29.如權(quán)利要求14- 任一所述的方法，其進(jìn)一步包含自該宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基分離該所表達(dá)的融合多肽。
30.如權(quán)利要求四所述的方法，其進(jìn)一步包含使該經(jīng)分離的融合多肽與選自由以下組成的群的切割劑接觸甲酸、溴化氰(CNBr)、羥胺、蛋白質(zhì)自切割、因子)Ca、腸激酶、ftx)TEV 及SUMO蛋白酶。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中該切割劑為甲酸。
32.如權(quán)利要求30或31所述的方法，其中在約至約10%甲酸存在下，在約50°C至約70°C的溫度下，由該經(jīng)分離的融合多肽與切割劑接觸。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中在甲酸存在下，進(jìn)行該接觸約5小時(shí)至約36小時(shí)。
34.如權(quán)利要求14-33任一所述的方法，其產(chǎn)生選自由以下組成的群的CNP變體R-CNP22 (K4R)(類似物 AZ) (SEQ ID NO 41)；ER-CNP22 (K4R)(類似物 ΒΑ) (SEQ ID NO :39)； GANPR-CNP22 (K4R)(類似物 Cl) (SEQ ID NO 37)； GANQQ-CNP22 (K4R)(類似物 CH) (SEQ ID NO 69)； AAWARLLQEHPNA-CNP22 (類似物 CA) (SEQ ID NO 61)； AAWARLLQEHPNAR-CNP22 (類似物 CB) (SEQ ID NO 62)； DLRVDTKSRAAWAR-CNP22 (類似物 CC) (SEQ ID NO 63)； GQPREPQVYTLPPS-CNP22 (類似物 CF) (SEQ ID NO 79)； GERAFKAWAVARLSQ-CNP22 (類似物 CE) (SEQ ID NO 81)； GHHSHEQHPHGANQQ-CNP22 (類似物 CQ) (SEQ ID NO 76)； GQEHPNARIWKGANPK-CNP22 (類似物 CS) (SEQ ID NO 71)； GQEHPNARIWKGANQK-CNP22 (類似物 CT) (SEQ ID NO :130)； GAHHPHEHDTHGANQQ-CNP22 (類似物 CR) (SEQ ID NO 77)； GQTHS SGTQSGANQQ-CNP22 (K4R)(類似物 CN) (SEQ ID NO 87)； SPKMVQGSG-CNP17-KVLRRH(類似物 CD) (SEQ ID NO :68)； PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34)； GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[CNP27(K4,5,9R)](SEQ ID NO :36)； GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP27(K4，5，9R，M22N)] (SEQ ID NO :184)； PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Pro-CNP27(K4, 5,9R) ](SEQ ID NO :189)； MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Met-CNP27(K4, 5,9R) ](SEQ ID NO :194)； GDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-CNP53)(SEQ ID NO 179)；PDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-CNP53) (SEQ ID NO 185)；MDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-CNP53)(SEQ ID NO 190)；DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP-53(M48N)](SEQ ID NO 180)；QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(SEQ ID NO :60)； QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP37(M32N)](SEQ ID NO :182)； PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-CNP37)(SEQ ID NO :186)； MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-CNP37)(SEQ ID NO :192)； GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-CNP37)(SEQ ID NO :75)； GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[Gly-CNP37(M32N)](SEQ ID NO 181)； PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP37)(SEQ ID NO :145)； MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-Gly-CNP37)(SEQ ID NO 191)； GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(HSA-CNP27)(SEQ ID NO :144)； GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [HSA-CNP27(M22N)](SEQ ID NO :183)； PGHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-HSA-CNP27)(SEQ ID NO :188)；及 MGHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-HSA-CNP27) (SEQ ID NO :193)。
35.如權(quán)利要求14-34任一所述的方法，其不產(chǎn)生CNP-22或CNP-53。
36.一種根據(jù)如權(quán)利要求14-33任一所述的方法產(chǎn)生的CNP變體，其中該CNP變體選自R-CNP22 (K4R)(類似物 AZ) (SEQ ID NO 41)； ER-CNP22 (K4R)(類似物 BA) (SEQ ID NO 39)； GANPR-CNP22 (K4R)(類似物 Cl) (SEQ ID NO 37)； GANQQ-CNP22 (K4R)(類似物 CH) (SEQ ID NO 69)； AAWARLLQEHPNA-CNP22 (類似物 CA) (SEQ ID NO 61)； AAWARLLQEHPNAR-CNP22 (類似物 CB) (SEQ ID NO 62)； DLRVDTKSRAAWAR-CNP22 (類似物 CC) (SEQ ID NO 63)； GQPREPQVYTLPPS-CNP22 (類似物 CF) (SEQ ID NO 79)； GERAFKAWAVARLSQ-CNP22 (類似物 CE) (SEQ ID NO 81)； GHHSHEQHPHGANQQ-CNP22 (類似物 CQ) (SEQ ID NO 76)； GQEHPNARIWKGANPK-CNP22 (類似物 CS) (SEQ ID NO 71)； GQEHPNARIWKGANQK-CNP22 (類似物 CT) (SEQ ID NO :130)； GAHHPHEHDTHGANQQ-CNP22 (類似物 CR) (SEQ ID NO 77)； GQTHSSGTQSGANQQ-CNP22 (K4R)(類似物 CN) (SEQ ID NO 87)； SPKMVQGSG-CNP17-KVLRRH(類似物 CD) (SEQ ID NO :68)； PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34)； GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[CNP27(K4,5,9R)](SEQ ID NO :36)； GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP27(K4, 5，9R，M22N)]； PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Pro-CNP27(K4, 5，9R)]； MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Met_CNP27(K4, 5，9R)]；GDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSM SGLGC(Gly-CNP53)(SEQ ID NO 179)；PDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-CNP53) (SEQ ID NO 185)；MDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-CNP53)(SEQ ID NO 190)；DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP-53(M48N)](SEQ ID NO 180)；QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(SEQ ID NO :60)； QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP37(M32N)](SEQ ID NO :182)； PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-CNP37)(SEQ ID NO :186)； MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-CNP37)(SEQ ID NO :192)； GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-CNP37)(SEQ ID NO :75)； GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[Gly-CNP37(M32N)](SEQ ID NO 181)； PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP37)(SEQ ID NO :145)； MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-Gly-CNP37)(SEQ ID NO 191)；GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(HSA-CNP27)(SEQ ID NO :144)；GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[HSA-CNP27(M22N)](SEQ ID NO :183)；PGHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-HSA-CNP27)(SEQ ID NO :188)；及MGHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-HSA-CNP27)(SEQ ID NO :193)。
37.一種包含表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，該載體包含編碼CNP變體多肽的第一多核苷酸連接至編碼可切割肽或蛋白質(zhì)的第二多核苷酸。
38.如權(quán)利要求37的宿主細(xì)胞，其中該可切割肽或蛋白質(zhì)選自組胺酸標(biāo)簽、人類轉(zhuǎn)錄因子TAF12、TAF12片段、TAF12組蛋白折疊域、TAF12的突變體及其片段、TAF12(C/A)、 TAF12(D/E)、TAF12(4D/4E)、TAF12(6D/6E)、TAF12(1OD/10E)、TAF12(C/A 及 D/E)、TAF12(C/ A及4D/4E)、TAF12 (C/A及6D/6E)、TAF12 (C/A及10D/10E)、酮類固醇異構(gòu)酶、麥芽糖結(jié)合蛋白、β -半乳糖苷酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、硫氧還蛋白、殼多糖結(jié)合域、ΒΜΡ-2、ΒΜΡ-2突變體、BMP-2 (C/A)，及其突變體及片段。
39.如權(quán)利要求37或38所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是細(xì)菌。
40.如權(quán)利要求39所述的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)菌宿主細(xì)胞是大腸桿菌。
41.如權(quán)利要求40的宿主細(xì)胞，其中所述大腸桿菌選自BL21、BL21(DE3)、BL21(DE3) pLysS、BL21 (DE3)pGro7、ArcticExpress (DE3)、C41 (DE3)、C43 (DE3)、Origami B (DE3)、 Origami B(DE3)pLysS、KRX 及 Tuner(DE3)。
42.如權(quán)利要求41所述的宿主細(xì)胞，其中所述大腸桿菌是BL21(DE3)。
43.如權(quán)利要求37-42任一所述的宿主細(xì)胞，其中所述載體是質(zhì)粒。
44.如權(quán)利要求43的宿主細(xì)胞，其中所述質(zhì)粒選自pJeXpreSS、pJeXpreSS401、 pjexpress404、pET_15b、pET_21a、pET_22b、pET_31b、pET_32a、pET_41a、pMAL、pMAL_c2X、 pQE-30、pET-SUMO及 pTYBll。
45.如權(quán)利要求37-44任一所述的宿主細(xì)胞，其中在細(xì)胞培養(yǎng)前用載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
46.如權(quán)利要求37-45任一所述的宿主細(xì)胞，其中在適于表達(dá)由所述多核苷酸編碼的融合多肽的條件下，于培養(yǎng)基中培養(yǎng)該宿主細(xì)胞，其中該融合多肽包含該CNP變體多肽直接連接至該可切割肽或蛋白質(zhì)或經(jīng)由接頭與其間接連接。
47.如權(quán)利要求46的宿主細(xì)胞，其中該融合多肽表達(dá)為可溶蛋白質(zhì)或包涵體。
48.如權(quán)利要求46或47所述的方法，其中從該宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基分離該所表達(dá)的融合多肽。
49.如權(quán)利要求48所述的宿主細(xì)胞，其中使該經(jīng)分離的融合多肽與選自由以下組成的群的切割劑接觸甲酸、溴化氰(CNBr)、羥胺、蛋白質(zhì)自切割、因子fe、腸激酶、ftx)TEV及 SUMO蛋白酶。
50.如權(quán)利要求37-49任一所述的宿主細(xì)胞，其中該CNP變體多肽不是CNP-22或 CNP-53。
51.一種評(píng)估CNP肽或變體對(duì)個(gè)體中至少一種骨或軟骨相關(guān)生物標(biāo)記含量的影響的方法，其包括分析來自已給予CNP肽或變體的個(gè)體的生物樣品中至少一種骨或軟骨相關(guān)生物標(biāo)記的該含量。
52.如權(quán)利要求51的方法，其進(jìn)一步包含對(duì)該個(gè)體給予該CNP肽或變體，隨后分析該至少一種骨或軟骨相關(guān)生物標(biāo)記的該含量。
53.一種治療CNP反應(yīng)性病狀或病癥的方法，其包括對(duì)個(gè)體給予CNP肽或變體，及監(jiān)測(cè)該個(gè)體中至少一種骨或軟骨相關(guān)生物標(biāo)記的含量，其中該至少一種骨或軟骨相關(guān)生物標(biāo)記的該含量增加，表示該CNP肽或變體對(duì)該個(gè)體或該病狀或病癥具有治療作用。
54.如權(quán)利要求53所述的方法，其進(jìn)一步包括調(diào)整該CNP肽或變體的給藥量或給藥頻率，其中i)若所述至少一種骨或軟骨相關(guān)生物標(biāo)記的所述含量低于目標(biāo)含量，則增加該CNP肽或變體的給藥量或給藥頻率；或 )若所述至少一種骨或軟骨相關(guān)生物標(biāo)記的所述含量高于目標(biāo)含量，則降低所述 CNP肽或變體的給藥量或給藥頻率。
55.如權(quán)利要求51-M任一所述的方法，其中所述至少一種骨或軟骨相關(guān)生物標(biāo)記選自CNP、cGMP、II型膠原蛋白的前肽及其片段、II型膠原蛋白及其片段、骨鈣化素、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、1型原膠原的前肽(PINP)及其片段、I型膠原蛋白及其片段、聚集蛋白聚糖硫酸軟骨素及堿性磷酸酶。
56.如權(quán)利要求51-55任一所述的方法，其中所述CNP肽或變體選自 R-CNP22 (K4R)(類似物 AZ) (SEQ ID NO 41)；GANRR-CNP22 (K4R)(類似物 AY) (SEQ ID NO 36)； AAWARLLQEHPNA-CNP22 (類似物 CA) (SEQ ID NO 61)； AAWARLLQEHPNAR-CNP22 (類似物 CB) (SEQ ID NO 62)； DLRVDTKSRAAWAR-CNP22 (類似物 CC) (SEQ ID NO 63)； GQPREPQVYTLPPS-CNP22 (類似物 CF) (SEQ ID NO 79)； GERAFKAWAVARLSQ-CNP22 (類似物 CE) (SEQ ID NO 81)； GHHSHEQHPHGANQQ-CNP22 (類似物 CQ) (SEQ ID NO 76)； GQEHPNARIWKGANPK-CNP22 (類似物 CS) (SEQ ID NO 71)； GQEHPNARIWKGANQK-CNP22 (類似物 CT) (SEQ ID NO :130)； GAHHPHEHDTHGANQQ-CNP22 (類似物 CR) (SEQ ID NO 77)； GQTHSSGTQSGANQQ-CNP22 (K4R)(類似物 CN) (SEQ ID NO 87)； SPKMVQGSG-CNP17-KVLRRH(類似物 CD) (SEQ ID NO :68)；GDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-CNP53)(SEQ ID NO 179)；PDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-CNP53) (SEQ ID NO 185)；MDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-CNP53)(SEQ ID NO 190)；DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP-53(M48N)](SEQ ID NO 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57.如權(quán)利要求56所述的方法，其中所述CNP肽或變體不是CNP-22或CNP-53。
全文摘要
本申請(qǐng)公開文本提供一種C型利鈉肽(CNP)的變體、包含CNP變體的醫(yī)藥組合物，及制造CNP變體的方法。這些CNP變體適用于治療CNP反應(yīng)性疾病的治療劑，這些疾病包括(但不限于)骨相關(guān)病癥，諸如骨骼發(fā)育不良(例如軟骨發(fā)育不全)，及血管平滑肌病癥(例如再狹窄及動(dòng)脈硬化)。
文檔編號(hào)G01N33/53GK102481330SQ201080023189
公開日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月20日
發(fā)明者A·O·奧克哈馬菲, C·P·普賴斯, D·J·文特, M·C·維拉德, S·卡斯蒂略, 美佳·青柳-史考伯, 龍世農(nóng) 申請(qǐng)人:生物馬林藥物股份有限公司