專利名稱：放射性標(biāo)記的肽的制備方法
放射性標(biāo)記的肽的制備方法本發(fā)明涉及放射性標(biāo)記的碳化合物的技術(shù)領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明涉及放射性標(biāo)記的肽的制備方法，以及放射性標(biāo)記的異氰基羧酸用于制備放射性標(biāo)記的肽的用途?，F(xiàn)在，固相和液相化學(xué)的發(fā)展使得制備分子量為3000-10000Da且偶合產(chǎn)率大于 99. 5%的序列確定的胎和蛋白成為可能。在Merrifield設(shè)計(jì)固相合成的1963年，待合成的肽經(jīng)連接基，即可分離的錨固基，偶合至由交聯(lián)聚合物構(gòu)成的不溶性載體樹脂上。該氨基酸以所需序列先后依次與激活的C-末端和大量過(guò)量的分別附接在最后的氨基酸的氨基官能團(tuán)偶合。剩余的反應(yīng)物和副產(chǎn)物可以從反應(yīng)容器中清除，因?yàn)橹虚g產(chǎn)物或產(chǎn)物結(jié)合至不溶性樹脂上。在最后的步驟中，連接基從樹脂上分離，從而肽以游離形式存在。不僅固相肽合成而且液相肽合成都涉及到復(fù)雜的保護(hù)基化學(xué)。該氨基酸的α -氨基保護(hù)基必須暫時(shí)被保護(hù)以用于偶合，因?yàn)榘被嵩隰人峒せ詈罂赡軙?huì)與自身發(fā)生反應(yīng)。 在偶合后，必須快速且溫和地分離該保護(hù)基，由此可以進(jìn)行后續(xù)偶合。在有機(jī)體中，向化學(xué)結(jié)構(gòu)中引入一個(gè)或多個(gè)放射性核素的、生理學(xué)上呈活性的肽和蛋白奠定了制備放射性藥物的基礎(chǔ)。該有機(jī)體至少在化學(xué)上同一的放射性藥物中不區(qū)分放射性藥物和相應(yīng)的非放射性標(biāo)記的化合物，從而該放射性藥物可以在生理學(xué)上進(jìn)行代謝。通過(guò)放射性核素的分解，可以對(duì)該放射性藥物進(jìn)行示蹤，并且在視覺上呈現(xiàn)。放射性標(biāo)記的肽對(duì)于正電子發(fā)射斷層成像術(shù)(PET)而言是有重要意義的示蹤物， 正電子發(fā)射斷層成像術(shù)是一種核醫(yī)學(xué)方法，其生成活有機(jī)體的切片圖像。在PET中，由記錄的分解結(jié)果的時(shí)空分布推斷出放射性藥物在體內(nèi)的空間分布，并且可以對(duì)過(guò)程如吸收、分布、代謝和排出進(jìn)行成像。放射性藥物的可用性受到放射性核素的短的半衰期(一般為小于2小時(shí))的限制。放射性核素11C具有特別短的半衰期，僅為約20分鐘。不期望的放射性的衰減在制備放射性核素時(shí)在回旋加速器中就已經(jīng)開始，并且持續(xù)至制備放射性藥物時(shí)、將其供應(yīng)至PET 場(chǎng)所時(shí)和最后直到給藥患者和測(cè)量時(shí)。為了實(shí)現(xiàn)圍繞回旋加速器的盡可能寬的供應(yīng)半徑(Lieferradius)(要提供的正電子發(fā)射斷層成像術(shù)位于該供應(yīng)半徑中)，放射性藥物在其制備出后必須存在盡可能高的放射性。這可以通過(guò)由放射性核素制備放射性藥物的盡可能短的時(shí)間來(lái)實(shí)現(xiàn)，因?yàn)榉派湫缘乃p對(duì)于所給定的放射性核素而言取決于時(shí)間。然而大多數(shù)用于肽的放射性標(biāo)記方法是多步驟的、耗時(shí)的，難以自動(dòng)化，并且僅呈現(xiàn)出很小的放射化學(xué)產(chǎn)率。普遍的制備放射性藥物的方法利用經(jīng)由甲基化試劑11CH3I的途徑，從而用11C放射性標(biāo)記例如胺或羧酸以及氨基酸(Denutte et al. , 1983 ；Vandersteene und Siegers，1996)。但是此時(shí)，在回旋加速器中產(chǎn)生的11CO2還必須在兩步過(guò)程中與LiAlH4 和HI反應(yīng)成11CH3L在第三步中該放射性標(biāo)記的甲基化試劑才可以轉(zhuǎn)移至要標(biāo)記的藥物。 由于放射性藥物的合成如此漫長(zhǎng)，最初由11CD2提供的放射性損失了大部分。對(duì)于18F-標(biāo)記領(lǐng)域中的新PET造影劑而言，一個(gè)重要技術(shù)由所謂的“點(diǎn)擊化學(xué) (Klick Chemie) ”開創(chuàng)。該方法實(shí)現(xiàn)了放射性造影劑在單個(gè)步驟中的合成(Devaraj et al. ,2009 ；Li et al. ,2007) 在 Bruus-Jensen 的論文(2006)中，HYNIC-官能化的肽和蛋白作為前體用于合成"F-和"mTc-標(biāo)記的放射性藥物。使用锝或氟標(biāo)記的放射性藥物，如 18F-B-氟-DOPA或18F-氟-2-去氧基-D-葡萄糖，當(dāng)然可以在有機(jī)體內(nèi)與其類似的未標(biāo)記的初始分子進(jìn)行區(qū)別。本發(fā)明的目的在于，提供一種高效快速的合成方法，該方法在短的制備時(shí)間內(nèi)提供高產(chǎn)率的放射性標(biāo)記的天然肽和合成肽。該目的通過(guò)放射性標(biāo)記的肽的制備方法得以實(shí)現(xiàn)，該方法包括以下步驟(a)提供在有機(jī)溶劑中的前體分子，所述前體分子選自由氨基酸、肽和伯胺所組成的組；(b)向所述前體分子中加入具有羧基官能團(tuán)的放射性標(biāo)記的化合物；(c)激活所述放射性標(biāo)記的化合物的羧基官能團(tuán)；和(d)連接所述激活的放射性標(biāo)記的化合物與前體分子以形成所述放射性標(biāo)記的肽，其中所述放射性標(biāo)記的化合物為異氰基羧酸。此外，本發(fā)明涉及放射性標(biāo)記的異氰基羧酸用于制備放射性標(biāo)記的肽的用途。各從屬權(quán)利要求包括本發(fā)明的有利的技術(shù)方案。

圖1顯示了使用氨基官能團(tuán)經(jīng)保護(hù)基9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)封閉的氨基酸的常規(guī)固相-肽合成。圖2顯示了使用標(biāo)記的異氰基羧酸的根據(jù)本發(fā)明的固相-肽合成。本發(fā)明的主題為放射性標(biāo)記的肽的制備方法，包括以下步驟(a)提供在有機(jī)溶劑中的前體分子，所述前體分子選自由氨基酸、肽和伯胺所組成的組；(b)向所述前體分子中加入具有羧基官能團(tuán)的放射性標(biāo)記的化合物；(c)激活所述放射性標(biāo)記的化合物的羧基官能團(tuán)；和(d)連接所述激活的放射性標(biāo)記的化合物與前體分子以形成所述放射性標(biāo)記的肽，其中所述放射性標(biāo)記的化合物為異氰基羧酸。術(shù)語(yǔ)“肽”，如本文中所使用的，表示由至少兩個(gè)經(jīng)酰胺鍵或肽鍵彼此連接的氨基酸所構(gòu)成的有機(jī)化合物。術(shù)語(yǔ)“肽”包括由最多10個(gè)氨基酸構(gòu)成的寡肽、由多于10個(gè)氨基酸構(gòu)成的多肽和由多于100個(gè)氨基酸構(gòu)成的巨肽(Makrop印tide)，以及獨(dú)立于一級(jí)結(jié)構(gòu)、 二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白。肽包括合成的有機(jī)化合物和天然存在的有機(jī)化合物。肽可以通過(guò)化學(xué)方式以及通過(guò)生物合成進(jìn)行制備。術(shù)語(yǔ)“前體分子”，如在本文中所使用的，表示肽合成的單體、寡聚體和多聚體起始分子，包括氨基酸、肽和/或通式為RNH2的伯胺。術(shù)語(yǔ)“羧基官能團(tuán)”，如在本文中所使用的，表示通式為-COOH的羧酸或通式為-COO-的羧酸根的官能團(tuán)。術(shù)語(yǔ)“激活羧基官能團(tuán)”，如在本文中所使用的，表示羧酸轉(zhuǎn)化成反應(yīng)性物質(zhì)。
術(shù)語(yǔ)“異氰基羧酸”，如在本文中所使用的，表示包括羧基-COOH或羧酸根-C00—和異氰基-CN的有機(jī)化合物。異氰基羧酸具有例如總通式CNR1R2CCOOH或CNR1R2CCOOXq
基團(tuán)R、R1, R2等，如在本文中所使用的，表示相同或不同的芳香族、雜芳族和脂族基團(tuán)以及氮化合物、商素化合物和氫。脂族基團(tuán)包括非環(huán)狀支鏈和無(wú)支鏈的、環(huán)狀和非環(huán)狀的、飽和和不飽和的碳化合物。X包括金屬離子，如堿金屬離子和堿土金屬離子，如鋰。為了制備放射性標(biāo)記的肽，在本發(fā)明的方法中使用了放射性標(biāo)記的異氰基羧酸。 異氰基羧酸的異氰基-而不是氨基酸的氨基-必須在肽合成中不被保護(hù)基所封閉。因此節(jié)省了寶貴的反應(yīng)時(shí)間，而在借助氨基酸連接的常規(guī)合成中則需要該反應(yīng)時(shí)間使得1.)保護(hù)基在額外的反應(yīng)步驟中附著(anlagern)至氨基上，和2.)在連接氨基酸和肽后在進(jìn)一步的反應(yīng)步驟中分離該保護(hù)基。因此，通過(guò)本發(fā)明的方法縮短了肽合成的持續(xù)時(shí)間。通過(guò)本發(fā)明方法縮短的肽合成時(shí)間，將會(huì)減少由于時(shí)間函數(shù)的放射性核素天然分解所引起的放射化學(xué)產(chǎn)率損失。因此，可以減少在合成放射性標(biāo)記的肽中使用的放射性起始物質(zhì)的量，從而節(jié)省了成本，并且減少了合成時(shí)放射化學(xué)試劑的用量(Belastimg)。借助放射性標(biāo)記的異氰基羧酸制備放射性標(biāo)記的肽以非常簡(jiǎn)單并且以較低的消耗進(jìn)行。因此，本發(fā)明的方法可以直接在診所或放射性操作中利用。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，有機(jī)溶劑包括二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、四氫呋喃、乙酸乙酯、乙腈和/或其組合。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該放射性標(biāo)記的異氰基羧酸包含放射性標(biāo)記的碳， 優(yōu)選"C。異氰基羧酸通過(guò)用放射性標(biāo)記的二氧化碳(如11CO2)羧基化CNR1R2CH或CNR1R2CX 進(jìn)行制備。放射性核素也可以在放射性標(biāo)記的異氰基羧酸的最后合成步驟中引入，放射性標(biāo)記的異氰基羧酸可以直接用于本發(fā)明的肽合成中。因此，在異氰基羧酸合成中已經(jīng)節(jié)省了反應(yīng)時(shí)間，由此減少了因放射性核素分解引起的放射化學(xué)產(chǎn)率損失，并且減少了所使用的放射性標(biāo)記的異氰基羧酸的量。因此再次節(jié)省了成本，并且在肽合成中減少了放射化學(xué)試劑的用量。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法還包括以下步驟(al)將分別包括羧基官能團(tuán)的另一種氨基酸或未標(biāo)記的異氰基羧酸加入所提供的前體分子中；(a2)激活另一種氨基酸或未標(biāo)記的異氰基羧酸的羧基官能團(tuán)；(a3)將所提供的前體分子與另一種氨基酸或未標(biāo)記的異氰基羧酸經(jīng)酰胺鍵 (Amidbindung)連接成肽；禾口(a4)重復(fù)步驟(al)至(a3)直到實(shí)現(xiàn)所需大小的肽。在該實(shí)施方案的步驟(al)至(a4)中，接著本發(fā)明方法的步驟(a)通過(guò)將其他單體氨基酸加入至前體分子(即氨基酸、肽或伯胺)中合成寡聚體前體分子和多聚體前體分子，如寡肽和多肽。因此，在本發(fā)明的方法中，該放射性標(biāo)記的異氰基羧酸可以加入至任意長(zhǎng)度的前體分子中(參見上述步驟(b))。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，異氰基羧酸為α-異氰基羧酸。術(shù)語(yǔ)“α-異氰基羧酸”，如在本文中所使用的，表示在同一碳原子上包括羧基或羧酸根(Carboxylat)和異氰基的有機(jī)化合物(IUPAC-名稱2-異氰基羧酸)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，羧基官能團(tuán)的激活包括異氰基羧酸和/或另一種氨基酸轉(zhuǎn)化成反應(yīng)性物質(zhì)，包括活性酯、酐、五氟苯基酯、硫代酸酯、咪唑化合物(Imidazolid)、 酰鹵(Carbonsaurehalogenid)和/或二甲基氨基吡啶。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，異氰基羧酸與偶合試劑反應(yīng)成活性酯，其中該偶合試劑包括胍鐺試劑(Guanidiniumreagenz)，脲鐺試劑⑴roniumreagenz)，優(yōu)選2-(H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3_四甲基脲鐺(Uronium)六氟磷酸鹽(HBTU)、0_ (苯并三唑-1-基)-N， N, N' , N'-四甲基脲鐺四氟硼酸鹽(TBTU)或2-(1Η-7-氮雜苯并三唑-1-基)-1，1，3， 3-四甲基脲鐺六氟磷酸鹽(HATU)、苯并三唑試劑，優(yōu)選1-羥基苯并三唑試劑(HOBt)、亞銨試劑(Immoniumreagenz)、碳二亞胺試劑、優(yōu)選N，N’_ 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)或二異丙基碳二亞胺(DIPCDI)、咪唑鐺試劑(Imidazoliumreagenz)、有機(jī)含磷試劑、酸性鹵化試劑，膦試劑(Phosphoniumreagenz)，優(yōu)選苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲基氨基)-膦-六氟磷酸鹽(Β0Ρ ；也作為Castros-試劑已知)或苯并三唑基-氧基三吡咯烷膦六氟磷酸鹽 (PyBOP)，嗎啉試劑，優(yōu)選N-甲基嗎啉(NMM)，氯甲酸酯(鹽)試劑(Chloroformatreagenz) 和/或及其組合。HOBt是有利的，因?yàn)镠OBt加速肽鍵的形成，抑制外消旋作用，并且使得例如Asn和 Gln側(cè)鏈不脫水。借助DCC，氨基酸在原位轉(zhuǎn)化成活性酯，該活性酯是穩(wěn)定的，使得其可以分離出來(lái)并進(jìn)行色譜分析。特別優(yōu)選使用HOBt和DCC的混合物。DCC在形成反應(yīng)性很強(qiáng)的酰基異脲時(shí)激活了羧酸。?；愲迮cHOBt反應(yīng)成HOBt-活性酯，其保存了絕大部分的起始反應(yīng)性。HOBt-活性酯受到肽或另一種氨基酸的氨基官能團(tuán)的親核性攻擊。在分離水時(shí)形成了肽鍵。?；愲宓闹苯愚D(zhuǎn)化不是很有利，因?yàn)榉磻?yīng)性過(guò)高以致于發(fā)生了外消旋。將DIPEA添加至HOBt中起到催化劑的作用，這減少了 HOBt的外消旋趨勢(shì)。作為DCC的備選，還常常使用DIP⑶I與HOBt，因?yàn)樵谠摲磻?yīng)中形成的脲更易溶解， 并且可以更方便地被除去。特別優(yōu)選的還有BOP或者由HBTU和HOBt形成的混合物。重要的是，BOP或HBTU 的平衡離子的親核性很弱，如PF_。BOP-試劑是穩(wěn)定的、非吸濕性的并且在有機(jī)溶劑中的溶解性很好。一般而言，BOP-試劑比DCC/HOBt組合更有效。但是BOP-試劑的一個(gè)缺點(diǎn)為， 反應(yīng)期間會(huì)產(chǎn)生致癌的六甲基磷酰三胺。相反地，這種新的試劑PyBop不具有致癌性。該試劑具有吡咯烷單元而不是甲基。試劑HBTU和HATU具有特別高的反應(yīng)性。酰氯和酰氟是非常容易獲得的，并且是價(jià)廉物美的試劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，前體分子的側(cè)鏈、異氰基羧酸和/或另一種氨基酸的官能團(tuán)通過(guò)保護(hù)基封閉。該官能團(tuán)包括羥基官能團(tuán)、羧基官能團(tuán)和氨基官能團(tuán)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，前體分子的主鏈的羧基官能團(tuán)和/或氨基官能團(tuán)和/ 或另一種氨基酸的主鏈的氨基官能團(tuán)通過(guò)保護(hù)基封閉。術(shù)語(yǔ)“保護(hù)基”，如在本文中所使用的，包括通過(guò)結(jié)合在化學(xué)基團(tuán)上有目的地封閉和關(guān)閉該化學(xué)基團(tuán)的反應(yīng)性的化合物。術(shù)語(yǔ)“側(cè)鏈”，如在本文中所使用的，包括基團(tuán)札、R2 等，其從前體分子、異氰基羧酸或另一種氨基酸的主線(Hauptstrang)支出。術(shù)語(yǔ)“主鏈”， 如在本文中所使用的，表示N-末端和C-末端骨架，其形成前體分子、異氰基羧酸或另一種氨基酸的軸或主干。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述保護(hù)基包括堿穩(wěn)定的保護(hù)基，叔丁基氧基羰基保護(hù)基(Boc)和/或9-芴基甲氧基羰基保護(hù)基(Fmoc)。
如果用Fmoc保護(hù)N-末端，那么對(duì)于側(cè)鏈?zhǔn)褂美鐗A穩(wěn)定的、酸不穩(wěn)定的保護(hù)基。 對(duì)此的實(shí)例有Boc，其在例如賴氨酸中保護(hù)氨基官能團(tuán)；叔丁基，其在例如天冬氨酸和絲氨酸中保護(hù)羧基和羥基；和三苯甲基，其在例如谷氨酸(Glutamin)中保護(hù)酰胺。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括(al)分離保護(hù)基與所提供的前體分子的主鏈氨基官能團(tuán)；(a2)將主鏈氨基受保護(hù)的另一種氨基酸加入前體分子中；(a3)激活另一種氨基酸的主鏈羧基官能團(tuán)；(a4)將所述前體分子與所述另一種氨基酸經(jīng)酰胺鍵連接成肽；和(a5)重復(fù)步驟(al)至(a4)，直到實(shí)現(xiàn)所需大小的肽。在實(shí)施方式的步驟(al)至(始)中，接著本發(fā)明方法的步驟(a)，通過(guò)將其他單體氨基酸加入至前體分子即氨基酸、肽或伯胺中合成寡聚體前體分子和多聚體前體分子，如寡肽和多肽。前體分子的N-末端氨基官能團(tuán)通過(guò)可分離的保護(hù)基封閉。因此，在本發(fā)明的方法中，所述放射性標(biāo)記的異氰基羧酸可以加入任意長(zhǎng)度的具有保護(hù)基的前體分子中(參見上述步驟(b))。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該Fmoc-保護(hù)基通過(guò)氨、伯胺或仲胺分離，優(yōu)選通過(guò) 4-氨基甲基哌啶、哌啶或三(2-氨基乙基)胺分離。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述叔丁基氧基羰基-保護(hù)基通過(guò)質(zhì)子分離。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括水解所述連接至前體分子的異氰基羧酸的步驟。由此，將異氰基轉(zhuǎn)化成官能團(tuán)氨基。在該氨基處可以中斷或繼續(xù)肽合成。因此，放射性核素可以位于肽鏈內(nèi)部或在肽鏈的末端。此外，根據(jù)本發(fā)明合成的放射性標(biāo)記的肽可以具有一個(gè)或多個(gè)放射性核素。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法還包括分離保護(hù)基與放射性標(biāo)記的肽的步驟。在肽合成結(jié)束后，例如具有一定酸穩(wěn)定性的保護(hù)基通過(guò)鹵代氫如HF分離，酸不穩(wěn)定的保護(hù)基通過(guò)三氟乙酸(TFA)分離。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該前體分子偶合至固相。術(shù)語(yǔ)“固相”，如在本文中所使用的，表示聚合物固體載體，肽在其合成期間結(jié)合至該載體上。通過(guò)這種固定，所使用的物質(zhì)可以大量過(guò)量地添加，并且非?？焖俚貨_洗掉，由此偶合產(chǎn)率在本發(fā)明的方法中顯著增加。固相化學(xué)進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化肽合成。由此，在肽合成時(shí)在固相處，順序重復(fù)以下步驟添加前體分子、單體和試劑，激活羧基官能團(tuán)，連接前體分子和單體，以及分離臨時(shí)性保護(hù)基。該固相包括連接基，該連接基為聚合物載體和肽之間的連接成員(Bindeglied)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，固相為聚苯乙烯樹脂、2’，4’_ 二甲氧基苯基-羥基甲基苯氧基-樹脂、ρ-甲基二苯甲基胺-樹脂、對(duì)乙酰胺基芐酯-樹脂 (Phenalacetamidomethyl-Harz)禾口 / 或月虧一豐對(duì)月旨。聚苯乙烯樹脂易于溶脹，因此各試劑可以容易到達(dá)合成位置。此外，其相對(duì)于各試劑呈惰性。該聚苯乙烯優(yōu)選混合二乙烯基苯以發(fā)生交聯(lián)。該官能化例如通過(guò)氯甲基化發(fā)生。有利地是在氯甲基和第一氨基酸之間插入連接基，例如P-烷氧基芐基酯連接基， 其可以在合成結(jié)束時(shí)從樹脂分離所制成的肽。在Fmoc-肽合成范圍中優(yōu)選使用具有烷氧基芐基酯連接基的聚苯乙烯樹脂，實(shí)現(xiàn)了 C-末端羧酸的合成，并且通過(guò)氯甲基聚苯乙烯與4-羥基芐基-醇的反應(yīng)制備。制成的肽的分離用TFA進(jìn)行。2’，4’ - 二甲氧基苯基羥基甲基-苯氧基-樹脂作為酰胺樹脂或酸樹脂使用。該酰胺樹脂提供C-末端酰胺，并且用于Fmoc-合成。該酸樹脂借助N-末端Boc-保護(hù)基實(shí)現(xiàn)肽的合成。這提供了 C-末端羧酸。酸樹脂的連接基同樣與氯三苯甲基連接基一樣是酸不穩(wěn)定的，從而肽可以例如用稀釋的TFA以受保護(hù)的形式與樹脂分離。然后，該片段可以用于片段縮合中。ρ-甲基二苯甲基胺-樹脂和對(duì)乙酰胺基芐酯-樹脂在Boc-肽合成的范圍中使用。 制成的肽的分離在結(jié)束使用HF進(jìn)行。使用ρ-甲基二苯甲基胺-樹脂得到肽酰胺。對(duì)乙酰胺基芐酯-樹脂提供羧酸。借助肟-樹脂可以制備出Boc-保護(hù)充分的肽。該分離使用NH3或H2N-NH2發(fā)生。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法還包括去偶合放射性標(biāo)記的肽與固相的步驟。為了釋放出該放射性標(biāo)記的肽，在肽合成結(jié)束后，該放射性標(biāo)記的肽從固相或從固相的連接基上去偶合。在N-末端Boc保護(hù)基的情況下，用HF分離，在N-末端Fmoc-保護(hù)基的情況下用約80%的TFA實(shí)現(xiàn)。除了這些不同強(qiáng)度的酸，例如還可以用光分離硝基芐基-樹脂和用Pd(O)正交分離烯丙基-樹脂。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，水解與前體分子從固相去偶合同時(shí)發(fā)生。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，水解與放射性標(biāo)記的肽從固相去偶合和保護(hù)基從放射性標(biāo)記的肽分離同時(shí)發(fā)生。同時(shí)發(fā)生的去偶合和水解以及同時(shí)發(fā)生的去偶合、水解和分離減小了工藝時(shí)間， 并且因此縮短了放射化學(xué)的產(chǎn)率損失。因此，減少了在該合成中使用的放射性異氰基羧酸的量。同時(shí)發(fā)生的水解和放射性標(biāo)記的肽從固相去偶合以及Boc-保護(hù)基的分離使用液態(tài)HF、在三氟乙酸中的三氟甲磺酸或在乙酸中的HBr實(shí)現(xiàn)。在Fmoc保護(hù)基的情況中，使用在CH2Cl2中的TFA (約80%濃度)。優(yōu)選加入捕獲試劑(Abfangreagenzien)，如苯甲醚、乙二硫醇或二甲硫醚，以捕獲可能損害肽的中間體。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及放射性標(biāo)記的異氰基羧酸用于制備放射性標(biāo)記的肽的用途。圖1顯示了制備肽的常規(guī)固相合成方法。該前體分子為Fmoc保護(hù)的伯胺，該伯胺經(jīng)過(guò)氨基甲基-3，5-二甲氧基苯氧基戊?；?連接基(PAL)偶合至固相(雙向交叉陰影圈)。Fmoc經(jīng)由堿與胺分離，并且添加的氨基酸被激活為HOBt-酯。接著，氨基同樣得到 Fmoc保護(hù)的氨基酸與固定的胺連接。在另一步驟中，F(xiàn)moc-基團(tuán)與固定的前體分子的氨基再次分離，并且另外添加且激活的氨基酸連接至該前體分子。重復(fù)這些步驟直到實(shí)現(xiàn)所需長(zhǎng)度的肽。接著分離該保護(hù)基，并且將肽從固相上去偶合。圖2示意性顯示了根據(jù)本發(fā)明通過(guò)放射性標(biāo)記的異氰基羧酸合成放射性標(biāo)記的肽。首先按常規(guī)方式從Fmoc-氨基酸和偶合在固相上的胺合成前體分子(參見圖1)。激活的放射性標(biāo)記的α-異氰基羧酸附著至該前體分子上，該激活的放射性標(biāo)記的α-異氰基羧酸的CN-基團(tuán)不必受保護(hù)，由此節(jié)省了反應(yīng)時(shí)間。CN-基團(tuán)接著水解成NH2-氨基，并且同時(shí)該合成的放射性標(biāo)記的肽從固相去偶合。
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1.放射性標(biāo)記的肽的制備方法，包括以下步驟(a)提供在有機(jī)溶劑中的前體分子，所述前體分子選自由氨基酸、肽和伯胺所組成的組；(b)向所述前體分子中加入具有羧基官能團(tuán)的放射性標(biāo)記的化合物；(c)激活所述放射性標(biāo)記的化合物的羧基官能團(tuán)；和(d)連接所述激活的放射性標(biāo)記的化合物與前體分子以形成所述放射性標(biāo)記的肽， 其特征在于，所述放射性標(biāo)記的化合物為異氰基羧酸。
2.權(quán)利要求1的方法， 其特征在于，所述有機(jī)溶劑選自由以下所組成的組二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、四氫呋喃、乙酸乙酯、乙腈，及其組合。
3.權(quán)利要求1或2的方法， 其特征在于，所述放射性標(biāo)記的異氰基羧酸包括放射性標(biāo)記的碳，優(yōu)選"C。
4.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括以下步驟(al)水解所述連接至上述前體分子的異氰基羧酸，其中由所述異氰基形成氨基； (a2)將另一種氨基酸或未標(biāo)記的異氰基羧酸加入所提供的前體分子中，其中所述另一種氨基酸或未標(biāo)記的異氰基羧酸分別具有羧基官能團(tuán)；(a3)激活所述另一種氨基酸或未標(biāo)記的異氰基羧酸的羧基官能團(tuán)； (a4)將所提供的前體分子與所述另一種氨基酸或未標(biāo)記的異氰基羧酸經(jīng)由酰胺鍵連接成肽；和(a5)重復(fù)步驟(a2)至(a4)直到實(shí)現(xiàn)所需大小的肽，其中對(duì)于在步驟(a2)中加入未標(biāo)記的異氰基羧酸的情形還重復(fù)步驟(al)，對(duì)于在步驟(^)中使用另一種氨基酸的情形，使保護(hù)基與所提供的前體分子的主鏈氨基官能團(tuán)分離。
5.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法， 其特征在于，所述異氰基羧酸為α-異氰基羧酸。
6.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法， 其特征在于，所述羧基官能團(tuán)的激活包括將異氰基羧酸和/或另一種氨基酸轉(zhuǎn)化成反應(yīng)性物質(zhì)，所述反應(yīng)性物質(zhì)選自由以下形成的組活性酯、酐、五氟苯基酯、硫代酸酯、咪唑化合物、酰鹵和二甲基氨基吡啶。
7.權(quán)利要求6的方法， 其特征在于，所述異氰基羧酸與偶合試劑反應(yīng)成所述活性酯，所述偶合試劑選自由以下所組成的組胍鐺試劑，脲鐺試劑，優(yōu)選2-(Η-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鐺六氟磷酸鹽(HBTU)、0-(苯并三唑-1-基)-N，N，N' , N'-四甲基脲鐺四氟硼酸鹽(TBTU)或 2- (1Η-7-氮雜苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鐺六氟磷酸鹽(HATU)，苯并三唑試劑，優(yōu)選1-羥基苯并三唑試劑(HOBt)，亞銨試劑，碳二亞胺試劑，優(yōu)選N，N' - 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)或二異丙基碳二亞胺(DIPCDI)，咪唑鐺試劑，有機(jī)含磷試劑，酸性鹵化試劑，膦試劑，優(yōu)選苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲基氨基)_膦-六氟磷酸鹽(BOP)或苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷膦-六氟磷酸鹽(PyBOP)，嗎啉試劑，優(yōu)選N-甲基嗎啉(NMM)，氯甲酸酯(鹽)試劑，及其組合。
8.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法， 其特征在于，所述前體分子的側(cè)鏈、所述異氰基羧酸和/或所述另一種氨基酸的至少一個(gè)官能團(tuán)通過(guò)保護(hù)基所封閉，其中所述官能團(tuán)選自由羥基官能團(tuán)、羧基官能團(tuán)和氨基官能團(tuán)所組成的組。
9.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法， 其特征在于，所述前體分子的主鏈的羧基官能團(tuán)和/或氨基官能團(tuán)和/或另一種氨基酸的主鏈的氨基官能團(tuán)通過(guò)保護(hù)基所封閉。
10.權(quán)利要求8或9的方法， 其特征在于，所述保護(hù)基選自由以下形成的組堿穩(wěn)定的保護(hù)基，叔丁基氧基羰基-保護(hù)基和9-芴基甲氧基羰基-保護(hù)基。
11.權(quán)利要求9或10的方法，進(jìn)一步包括以下步驟(al)分離所述保護(hù)基與所提供的前體分子的主鏈氨基官能團(tuán)；(a2)將主鏈氨基受保護(hù)的所述另一種氨基酸加入所述前體分子；(a3)激活所述另一種氨基酸的主鏈羧基官能團(tuán)；(a4)將所述前體分子與所述另一種氨基酸經(jīng)過(guò)酰胺鍵連接成所述肽；和(a5)重復(fù)步驟(al)至(a4)直到實(shí)現(xiàn)所需大小的肽。
12.權(quán)利要求10的方法， 其特征在于，所述9-芴基甲氧基羰基-保護(hù)基通過(guò)氨、伯胺或仲胺分離，優(yōu)選通過(guò)4-氨基甲基哌啶、哌啶或三(2-氨基乙基)胺分離。
13.權(quán)利要求10的方法， 其特征在于，所述叔丁基氧基羰基-保護(hù)基通過(guò)質(zhì)子分離。
14.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括以下步驟水解所述連接至前體分子的異氰基羧酸，其中由所述異氰基形成氨基。
15.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括以下步驟 分離所述保護(hù)基與所述放射性標(biāo)記的肽。
16.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法， 其特征在于，所述前體分子偶合至固相。
17.權(quán)利要求16的方法，其特征在于，所述固相選自有以下形成的組聚苯乙烯樹脂、2’，4’ - 二甲氧基苯基羥基甲基-苯氧基-樹脂、P"甲基二苯甲胺樹脂、對(duì)乙酰胺基芐酯-樹脂和肟樹脂。
18.權(quán)利要求16或17的方法，進(jìn)一步包括以下步驟 使所述放射性標(biāo)記的肽從所述固相去偶合。
19.權(quán)利要求14和18的方法， 其特征在于，所述水解和所述前體分子從所述固相去偶合同時(shí)發(fā)生。
20.權(quán)利要求14、15和18的方法， 其特征在于，所述水解和所述放射性標(biāo)記的肽從所述固相去偶合以及所述保護(hù)基從所述放射性標(biāo)記的肽分離同時(shí)發(fā)生。
21.放射性標(biāo)記的異氰基羧酸用于制備放射性標(biāo)記的肽的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及放射性標(biāo)記的肽的制備方法，其中，提供在有機(jī)溶劑中的前體分子；加入具有羧基官能團(tuán)的放射性標(biāo)記的化合物；激活該羧基官能團(tuán)；和，連接所述激活的放射性標(biāo)記的化合物與前體分子以形成放射性標(biāo)記的肽，其中所述放射性標(biāo)記的化合物為異氰基羧酸。本發(fā)明還涉及放射性標(biāo)記的異氰基羧酸用于制備放射性標(biāo)記的肽的用途。
文檔編號(hào)C07B59/00GK102471178SQ201080032068
公開日2012年5月23日 申請(qǐng)日期2010年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月29日
發(fā)明者A.斯泰肯波恩, M.金澤爾, O.雷德 申請(qǐng)人:西門子公司