一種雷公藤有效成分的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種以雷公藤根為原料提取得到雷公藤紅素和雷公藤甲素的新方法。該工藝特征在于萃取分離富集有效分。雷公藤根的醇提取浸膏分配在由聚合物-無機鹽水溶液和乙醇形成的雙水相體系中，然后用水不溶性有機溶劑對分配在雙水相體系中雷公藤浸膏進行萃取，得到有效部位。將得到的有效部位用醇溶解，加水結晶除去大部分非有效物質得到富集的有效部位。該富集的有效部位經過高速逆流色譜分離得到雷公藤紅素。該富集的有效部位經過硅膠柱層析分離，重結晶后得到雷公藤甲素。本發(fā)明具有以下的優(yōu)點：1.本發(fā)明用聚合物-無機鹽水溶液-乙醇-水不溶性有機溶劑三相萃取富集雷公藤有效成分，萃取充分并且不乳化，萃取效率高。2.本發(fā)明用沉淀法除雜，顯著降低了后續(xù)分離的難度。
【專利說明】一種雷公藤有效成分的制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及化工產品的分離方法，具體是分離雷公藤中有效成分的方法。
技術背景
[0002]衛(wèi)矛科雷公藤屬植物在我國就有10個種，而用于藥用的主要有3種:即雷公藤、昆明山海棠(又稱粉背雷公藤)和東北雷公藤(又稱黑蔓)。雷公藤又稱水莽草、黃藥、黃藤、菜蟲藥、斷腸草[全國高等植物圖鑒，第二冊，科學出版社，1982,2686]。雷公藤具有多種藥理作用，如:清熱解毒、祛風除濕、舒筋活血通絡、消腫止痛、殺蟲止癢；已用于多種疾病的治療，如:類風濕性關節(jié)炎、某些皮膚病、腎炎、肝炎，有一定的抗腫瘤和抗生育作用，還具有潛在的抗HIV活性[Hongquan Huan et al.Sesquiterpene alkaloids from Tripterygiumhypoglaucum and Tripterygium wilfordii:a new class of potent ant1-HIV agent.Journal of Natural products.2000,63 (3):357-361]。因此,雷公藤中有效成分分離提純技術的研究對未來新藥的研發(fā)具有深遠的影響。
[0003]目前國內文獻報道的對雷公藤的有效成分分離純化方法主要有:醇提水沉法、水提醇沉法、醇提有機溶劑萃取法[陳俊元等，中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1989，5，195-200]。通過比較研究得出的初步結論是，水提醇沉法與醇提水沉法相比提取率相近但是降低了成本，醇提有機溶劑萃取法和前兩種工藝相比萃取率最好，但是直接用有機溶劑萃取乳化嚴重，處理麻煩，難以進行工業(yè)生產[李漢堡等，中成藥，1991，10，1-4]。上述三種方法都存在如下問題:工藝復雜、物耗過大、收得率低，而且大量使用有毒有害的試劑，如氯仿、乙醚、丙酮等。曾有利用磷酸二氫鈉水溶液與乙醇形成雙水相，然后用水不溶性溶劑進行三相萃取富集雷公藤有效成分[肖世基等，廣西大學學報，2011，3，496-499]。但所用無機鹽的回收比較麻煩。而采用聚合物-無機鹽水溶液-乙醇-有機溶劑三相萃取法則可以降低無機鹽用量，同時聚合物可以通過超濾膜過濾回收，且聚合物與浸膏中的成分存在一定的相互作用，使得萃取可以以一定的選擇性進 行。其工藝是將雷公藤根干粉用醇提取，得到提取液，濃縮后得浸膏。將浸膏分散于聚合物-無機鹽水溶液-乙醇-水不溶性有機溶劑三相系統(tǒng)中，進行選擇性萃取，分離出上層有機相，濃縮有機相得到有效部位，然后將得到的有效部位用醇溶解加水分步結晶除去大部分非有效物質得有效成分部位。有效成分部位用高速逆流色譜分離得到雷公藤紅素，用硅膠柱層析分離得到雷公藤甲素。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明是將雷公藤醇提物用三相萃取分離方法得到雷公藤的有效部位，萃取充分且不產生乳化現(xiàn)象，縮短分離時間。然后用適當?shù)挠袡C溶劑溶解除去不溶物，再分步結晶除去非有效成分。最后將富集得到的雷公藤有效部位用高速逆流色譜進行分離，得到純度95%的雷公藤紅素(tripterine)，用硅膠柱層析分離得到98%的雷公藤甲素(triptolide)。
[0005]本發(fā)明分離純化包括以下方法步驟:[0006]1.雷公藤粗提取物的制備:將雷公藤根粉碎，以2~10倍(w/w)雷公藤干重的醇回流提取I~5次，每次2~5小時，提取液減壓濃縮成浸膏；
[0007]2.將上述制得的浸膏溶解分配在0.5-5% PEG-20000、5%~30%硫酸銨水溶液-乙醇雙水相體系(PEG-20000-硫酸銨水溶液與乙醇形成等體積的兩相體系)中，用石油醚(沸程60-90°C，下同)萃取I~5次，分出石油醚層，濃縮回收。石油醚萃取后余下的雙水相再用乙酸乙酯-石油醚混合溶劑(乙酸乙酯體積含量10%~50% )萃取2~10次，萃取液濃縮得浸膏，回收萃取劑可反復使用；
[0008]3.將步驟2所得的乙酸乙酯-石油醚萃取浸膏溶于2~10倍質量的乙醇中，過濾除去不溶物，濾液加水沉淀，低溫靜置24小時，然后過濾，濾液濃縮得到浸膏；
[0009]4.將步驟3所得浸膏經高速逆流色譜分離得到高純度的雷公藤紅素。色譜條件:正己烷，乙酸乙酯，甲醇，水按體積比為I~4: 2~5: 2~5: I~4充分混合，靜置分為兩相，分出兩相。輕相為固定性，重相為流動相。將步驟3所得浸膏溶解在輕相中，形成
0.5-10%的溶液。溫度20~40°C，主機轉速600~1000r/min，流動相流速1.0~5.0ml/min。紫外檢測器檢測波長λ = 425nm。組分峰對應流出液經過濃縮，得到雷公藤紅素。
[0010]4.將步驟3所得浸膏經硅膠柱層析分離得到高純度的雷公藤甲素。色譜條件:干法裝柱，干法上樣，先用由乙酸乙酯和石油醚按體積比為1: 9~3: 7組成的洗脫液洗去雷公藤甲素前的部分，再用由乙酸乙酯和石油醚體按積比為2: 8~5: 5組成的洗脫液洗脫，定量收集流出液。流出液用雷公藤甲素標樣進行跟蹤分析，合并相同組分，重結晶后得到雷公藤甲素。
【具體實施方式】
[0011]下面結合實例對本發(fā)`明進行詳細描述。
[0012]雷公藤干燥根200kg刨片并粉碎為0.5-1.5mm碎粒，用5倍量的95%乙醇加熱回流提取3次，每次3小時。提取液減壓濃縮得17kg干浸膏A。取I % PEG-2000-10%硫酸銨4000ml,乙醇4000ml充分混合。然后攪拌下加入Ikg的浸膏A，使之充分溶解和分配。先以2000ml石油醚萃取3次,分出石油醚層濃縮得石油醚部位浸骨135.5g。分去石油醚溶液后余下的雙水相，用2000ml萃取劑(乙酸乙酯:石油醚=2: 8，體積比)萃取6次，萃取液濃縮得到16.1g浸膏B。將浸膏B溶解在150ml乙醇中，過濾，除去不溶物得濾液，往濾液中加8ml水，靜置后再過濾，然后往濾液再加8ml水，靜置過濾，濾液濃縮得結晶物，結晶物再用乙醇溶解，過濾除去固形物，濾液濃縮得9.Sg浸膏C。
[0013]將上面所得浸膏Cl.0g經高速逆流色譜分離。雷公藤紅素分離條件如下。色譜條件:正己烷，乙酸乙酯，甲醇，水按體積比為2: 3: 3: 2充分混合，靜置分為兩相，分出兩相。輕相為固定性，重相為流動相。將步驟3所得浸膏溶解在輕相中，形成8%的溶液，進行逆流色譜分離。溫度25°C，主機轉速800r/min，流動相流速2.0ml/min。紫外檢測器檢測波長λ = 425nm。組分峰對應流出液經過濃縮，得到雷公藤紅素12mg。經高效液相色譜分析，雷公藤紅素純度為96.1%。
[0014]將上述制得的浸膏C 8.Sg經柱色譜分離得雷公藤甲素，分離過程如下:將8.Sg制的浸膏溶解在50ml乙醇中，加入20克300-400目的硅膠拌樣。600克300-400目硅膠在105°C下活化40分鐘后干法裝柱(柱內徑7.8cm)，將拌好樣的硅膠干法上樣，先用20%體積的乙酸乙酯和80%體積的石油醚洗去雷公藤甲素前的部分，再用30%體積的乙酸乙酯和70%體積的石 油醚洗脫，定量收集(300ml/份)流出液。流出液經檢測后合并、濃縮，濃縮物經過重結晶后得到雷公藤甲素55mg。經高效液相色譜分析，所得雷公藤甲素純度為98.5%。
【權利要求】
1.一種以雷公藤根為原料提取得到雷公藤有效成分的新方法，其特征在于，以干燥的雷公藤根為原料，經過刨片并粉碎、溶劑提取，提取液濃縮得到雷公藤浸膏。該浸膏經過部位分離富集，得到富含雷公藤活性物質的有效部位。該有效部位經過高速逆流色譜分離得到高純度的雷公藤紅素，經過硅膠柱層析分離得到雷公藤甲素(又名雷公藤內酯醇)，操作步驟如下: (1)將雷公藤材料刨片并粉碎為0.5-1.5mm碎粒。然后用溶劑熱回流提取，選用溶劑為95%乙醇。重復提取3次，每次3小時，濾液減壓濃縮，得到浸膏A ； (2)將上述制得的浸膏溶于聚合物-無機鹽水溶液-乙醇雙水相體系進行分配，然后用石油醚(沸程60-90°C，下同)萃取，分出石油醚溶液。余下雙水相體系再用萃取劑萃取，萃取液合并、濃縮得浸膏B。 (3)將(2)所得的浸膏溶于乙醇中，加水后靜置結晶，過濾得到濾液，濃縮得到浸膏C。 (4)將(3)所得浸膏C用溶劑溶解成5%溶液，經高速逆流色譜分離得到高純度的雷公藤紅素。將(3)所得浸膏C經硅膠柱層析分離得到高純度雷公藤甲素。
2.根據(jù)權利要求1所敘的雷公藤中有效成分分離工藝，其特征在于所述步驟(2)中，所用聚合物為聚乙二醇-20000 (PEG-20000)，無機鹽為硫酸銨。(2)所述的雙水相體系，其特征在于由含1% PEG-20000，10%硫酸銨的水溶液與乙醇形成等體積的兩相體系。
3.根據(jù)權利要求1所敘的雷公藤中有效成分分離工藝，其特征在于所述步驟(2)中，萃取劑由20%體積的乙酸乙酯和80%體積的石油醚組成。
4.根據(jù)權利要求1所敘的雷公藤中有效成分分離工藝，其特征在于所敘步驟(3)中，所得的浸膏溶于8倍質量的95%乙醇中，先加入1/2倍浸膏質量的水，靜置沉淀，過濾得濾液。在所得濾液中加入1/2倍浸 膏的水，靜置沉淀，過濾得濾液，濾液濃縮得固體物。上述固體物再用95%乙醇溶解，過濾除去不容物，濾液濃縮得浸膏。
5.根據(jù)權利要求1所敘的雷公藤中有效成分分離工藝，雷公藤紅素的分離方法，其特征在于所敘步驟(4)中的高速逆流色譜，所用的固定相和流動相由以下溶劑組成一正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水以此按體積比為I~4: 2~5: 2~5:1~4的比例充分混合，靜置分為兩相。輕相為固定相，重相為流動相。色譜條件為:25°C下主機轉速800轉/分。紫外檢測器檢測波長λ = 425nm。組分峰對應流出液經過濃縮，得到雷公藤紅素。
6.根據(jù)權利要求1所敘的雷公藤中有效成分分離工藝，雷公藤甲素的分離方法，其特征在于所敘步驟⑷中的硅膠柱層析，經活化(110°C40分鐘)的硅膠減壓下裝填至體積不變，得到干裝柱(硅膠高度30~60cm)。浸膏溶解在無水乙醇中成濃度為約5%溶液，加硅膠充分吸附后，去掉溶劑，得到吸樣硅膠。以上所用硅膠為300~400目規(guī)格。減壓下把吸樣硅膠加到干裝硅膠柱上。減壓下加入由乙酸乙酯和石油醚按體積比為1: 9~3: 7組成的洗脫液，直至溶液達到層析住出口，然后停止減壓，常壓下繼續(xù)用由乙酸乙酯和石油醚按體積比為1: 9~3: 7組成的洗脫液洗去雷公藤甲素前的部位，再用由乙酸乙酯和石油醚體按積比為2: 8~5: 5組成的洗脫液洗脫，定量收集流出液。流出液用雷公藤甲素標樣進行跟蹤分析，合并相同組分，重結晶后得到雷公藤甲素。
【文檔編號】C07J73/00GK103524591SQ201210230388
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2012年7月5日 優(yōu)先權日:2012年7月5日
【發(fā)明者】韋萬興, 肖世基, 劉力恒 申請人:廣西大學