本發(fā)明屬于功能性生物材料，及其制備技術(shù)及其在細(xì)胞識別、捕獲、釋放和富集中的應(yīng)用，具體的說是一種新型的可以特異性識別細(xì)胞的印跡材料，及其制備和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

細(xì)胞的高通量和高靈敏度檢測在腫瘤診斷與治療、環(huán)境檢測和生物傳感器研究中具有十分重要的作用(Aherne A.et al.,J.Am.Chem.Soc.,1996,118,8771-8772)。目前，在細(xì)胞濃度較低的環(huán)境中，細(xì)胞的檢測十分困難，其主要原因是細(xì)胞含量較少，無法得到。因此，實(shí)現(xiàn)低細(xì)胞濃度環(huán)境中細(xì)胞檢測的前提是能夠?qū)⒛繕?biāo)從環(huán)境中識別和富集出來。

細(xì)胞識別與富集細(xì)胞識別與富集技術(shù)是一種可以特異性識別和捕獲目標(biāo)細(xì)胞的技術(shù)。目前，識別與富集目標(biāo)細(xì)胞的技術(shù)主要有兩種類型，一種是基于免疫原理的技術(shù)。該技術(shù)一方面利用與目標(biāo)細(xì)胞結(jié)合的抗體識別和富集細(xì)胞，另一方面利用與干擾細(xì)胞結(jié)合的抗體去除非目標(biāo)細(xì)胞，達(dá)到間接識別和富集目標(biāo)細(xì)胞的目的。另一種技術(shù)是基于目標(biāo)細(xì)胞物理性質(zhì)的技術(shù)，包括細(xì)胞的大小、密度、可變形性和帶電性等。該技術(shù)利用目標(biāo)細(xì)胞與干擾細(xì)胞在上述物理性質(zhì)方面的差異達(dá)到識別和富集目標(biāo)細(xì)胞的目的。然而，由于細(xì)胞表面抗原表達(dá)的不確定性，無法獲得針對重要細(xì)胞的抗體，從而導(dǎo)致基于免疫原理的技術(shù)無法有效發(fā)揮其作用。另外，即使同一種細(xì)胞在不同條件下其物理性質(zhì)也不盡相同，故而基于物理性質(zhì)技術(shù)獲得的細(xì)胞往往純度和靈敏度較差(Catherine Alix-Panabières et al,Nat.Rev.Cancer,2014,14,623-631).因此，開發(fā)一種既能夠替代抗體，又能夠特異性識別和富集細(xì)胞的材料就顯得十分重要。

分子印跡技術(shù)是一項(xiàng)以分子識別理論為基礎(chǔ)，模擬抗體-抗原相互作用的方式，通過人工設(shè)計(jì)和合成具有特定結(jié)構(gòu)和功能的分子識別材料的新技術(shù)。利用該技術(shù)制備的分子印跡材料實(shí)現(xiàn)對復(fù)雜環(huán)境中的目標(biāo)分子的特異性識別和富集。其中，細(xì)胞印跡技術(shù)是一種以細(xì)胞為模板的新興分子印跡技術(shù)，由其制備的細(xì)胞印跡材料作為一種天然抗體的替代品，不僅可以精確模擬天然抗體的特異性識別能力，而且具有環(huán)境耐受性更強(qiáng)，重復(fù)利用率更高以及適合規(guī)?；铣傻葍?yōu)勢(Schirhagl,R.et al,Anal.Chem.,2014,86,250-261)。

因此，在細(xì)胞印跡技術(shù)的基礎(chǔ)上，我們以細(xì)胞為模板，首先采用細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞固定技術(shù)將模板細(xì)胞固定于基質(zhì)材料上，其次引發(fā)預(yù)聚合體系在基質(zhì)材料表面的固化作用得到印跡層，然后分離基質(zhì)材料與印跡層，最 后去除印跡層表面的模板細(xì)胞。當(dāng)模板細(xì)胞除去后，材料表面就會形成與模板細(xì)胞發(fā)生多重作用的印跡位點(diǎn)。從而獲得了具有特異性識別和富集目標(biāo)細(xì)胞能力的印跡材料，并實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞的識別、捕獲、釋放和富集。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

以待特異性識別的細(xì)胞為模板，采用細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞固定技術(shù)將其固定于基質(zhì)材料上，通過在基質(zhì)材料表面固化聚合預(yù)聚合體系形成印跡層，分離印跡層與基質(zhì)材料，然后去除印跡層表面的模板細(xì)胞，得到一種能夠特異性識別模板細(xì)胞的印跡材料，并將該材料應(yīng)用于細(xì)胞的識別、捕獲、釋放和富集過程中。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

(1)采用物理處理或化學(xué)修飾方法改造基質(zhì)材料表面，使其利于細(xì)胞在其表面固定。其中，基質(zhì)材料包括細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞培養(yǎng)皿、載玻片、蓋玻片中的一種或二種以上，基質(zhì)材料的基質(zhì)為硅氧烷類基質(zhì)、聚苯乙烯類基質(zhì)和金屬基質(zhì)?；|(zhì)材料表面的改性方法包括物理涂層、表面熱處理、機(jī)械打磨和等離子體表面處理的一種或二種以上；以及將能與模板細(xì)胞發(fā)生相互作用的抗體、核酸適配體、多肽和蛋白質(zhì)中的一種或二種以上固載在基質(zhì)材料表面。

(2)在不需處理或已處理的基質(zhì)材料表面采用生長貼附、物理吸附、免疫作用等方式固定模板細(xì)胞。模板細(xì)胞是指動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、真菌、細(xì)菌、和孢子。

(3)隨后將預(yù)聚合體系加入到固定有細(xì)胞的基質(zhì)材料表面，以光引發(fā)、熱引發(fā)或自由基引發(fā)等方式引發(fā)預(yù)聚合體系固化。其中，預(yù)聚合體系中的單體是丙烯酰胺、N,N-二甲基丙烯酰胺、N,N-亞甲基雙丙烯酰胺、N-異丙基丙烯酰胺、N-羥甲基丙烯酰胺、N-叔丁基丙烯酰胺、石墨烯摻雜丙烯酰胺、石墨烯摻雜N,N-二甲基丙烯酰胺、石墨烯摻雜N,N-亞甲基雙丙烯酰胺、石墨烯摻雜N-異丙基丙烯酰胺、石墨烯摻雜N-羥甲基丙烯酰胺、石墨烯摻雜N-叔丁基丙烯酰胺、甲基氯硅烷、苯基氯硅烷、甲基乙烯基氯硅烷、乙基三氯硅烷、丙基三氯硅烷、乙烯基三氯硅烷、γ-氯丙基三氯硅烷和氟硅單體、聚二甲基硅氧烷，多巴胺、烯丙基胺、乙烯、丙烯、丁二烯、苯乙烯、4-乙烯基吡啶、衣康酸、丙烯酸、丙烯酸鈉、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、對苯乙烯、乙二醇二甲基丙烯酸甲酯、氯苯乙烯、2-(三氟甲基)丙烯酸、丙烯腈、乙烯醇、乙酸乙烯、丙烯醛、聚氨基甲酸酯和2-羥基丙酸中的一種或二種以上；能通過自組裝方式形成高分子材料的聚合物，包括聚砜、聚醚砜和聚芳砜中的一種或二種以上；用于溶解或分散單體或聚合物的溶劑包括水、磷酸鹽緩沖液、氯化鈉溶液、葡萄糖溶液、甲醇、乙醇、甲苯、乙醚、石油醚、氯仿、二氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯、丙酮、正己烷、環(huán)己烷、苯、乙酸、苯甲醚、二甲基亞砜、溴苯、二氯化碳、四氯化碳、N,N-二甲基甲酰胺和三氟乙酸中的一種或二種以上；由功能單體或聚合物溶解或分散于溶劑中形成的溶液的質(zhì)量濃度范圍為5％-90％。

(4)預(yù)聚合體系固化后，將基質(zhì)材料與印跡層分離。接著用胰酶消化法或溶劑萃取法等將印跡層表面的模板細(xì)胞徹底去除，直至檢測不到模板細(xì)胞的存在，進(jìn)而得到識別和富集細(xì)胞的印跡材料(MIP)。

(5)在基質(zhì)材料上不固載模板細(xì)胞，按照上述從(1)到(4)的步驟制備得到非印跡材料(NIP)。

(6)將該細(xì)胞印跡材料用于生物分析、生物化工、生物醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)細(xì)胞的選擇性識別、捕獲、釋放和富集。

本發(fā)明是一種基于模板細(xì)胞與印跡位點(diǎn)之間的多重作用的細(xì)胞印跡材料，該材料能對目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行特異性識別、捕獲、釋放和富集。

當(dāng)模板細(xì)胞與預(yù)聚合體系接觸時會形成多重作用位置，通過在預(yù)聚合體系的固化過程中記憶二者之間的多重作用，當(dāng)模板細(xì)胞除去后，材料表面就會形成與模板細(xì)胞發(fā)生多重作用的印跡位點(diǎn)。

模板細(xì)胞與印跡位點(diǎn)之間在空間結(jié)構(gòu)、大小、形狀和官能團(tuán)上，通過空間構(gòu)型和氫鍵作用、靜電作用以及范德華作用表現(xiàn)出的互補(bǔ)親和能力。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

(1)本發(fā)明利用細(xì)胞印跡技術(shù)制備得到了能用于特異性識別細(xì)胞的印跡材料。利用印跡材料表面形成的與細(xì)胞發(fā)生多重作用的印跡位點(diǎn)，提高了細(xì)胞識別和富集的純度與靈敏度，降低了富集細(xì)胞時非特異性作用的干擾。

(2)本發(fā)明中的印跡材料對目標(biāo)細(xì)胞的識別是多重作用，包括空間構(gòu)型和氫鍵作用、靜電作用以及范德華作用，對目標(biāo)細(xì)胞表現(xiàn)更強(qiáng)出的互補(bǔ)親和能力。

(3)本發(fā)明中所用的基質(zhì)材料和預(yù)聚合體系具有良好的生物兼容性和穩(wěn)定性，利于保持細(xì)胞的活性與結(jié)構(gòu)以及重復(fù)使用，進(jìn)而有利于再識別目標(biāo)細(xì)胞。

(4)本發(fā)明中細(xì)胞印跡材料的制備流程簡單，易于操作。相較于其他細(xì)胞識別與富集方法，采用該材料能簡化識別過程，提高識別效率，應(yīng)用范圍更廣。

附圖說明

圖1：SMMC-7721細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)板表面的貼附效果圖；

圖2：印跡層表面的SMMC-7721細(xì)胞；

圖3：以SMMC-7721細(xì)胞為模板制備得到的細(xì)胞印跡材料(MIP1)；

圖4：MIP1和NIP識別與捕獲SMMC-7721細(xì)胞的效果圖；

圖5：以MCF-7細(xì)胞為模板制備得到的細(xì)胞印跡材料(MIP2)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

基于SMMC-7721細(xì)胞模板的細(xì)胞印跡材料(MIP1)的制備

將SMMC-7721細(xì)胞培養(yǎng)于十二孔板基質(zhì)材料表面中，當(dāng)約80％的培 養(yǎng)板底部被鋪滿時(圖1)，用PH＝7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液清洗細(xì)胞，然后加入質(zhì)量濃度為4％的多聚甲醛溶液固定細(xì)胞，5分鐘后，用PH＝7的PBS溶液清洗去除多聚甲醛溶液。然后向十二孔板中的每孔加入1毫升由質(zhì)量濃度為30％丙烯酰胺和質(zhì)量濃度為1％的亞甲基雙丙烯酰胺組成的預(yù)聚合水溶液，然后再加入1微升四甲基乙二胺和10微升質(zhì)量濃度為10％的過硫酸銨水溶液引發(fā)預(yù)聚合溶液的固化反應(yīng)。20分鐘后，將固化形成的印跡層與基質(zhì)材料分離并將印跡層翻轉(zhuǎn)，在印跡層表面有SMMC-7721細(xì)胞存在(圖2)。將印跡層反復(fù)浸泡于質(zhì)量濃度0.25％的胰酶溶液中，直至采用DAPI染色法在印跡層表面檢測不到細(xì)胞存在，用PBS溶液將胰酶溶液清洗后即得到用于特異性識別SMMC-7721細(xì)胞的細(xì)胞印跡材料(圖3)。如圖3所示，在印跡材料表面有大量印跡位點(diǎn)存在，這些印跡位點(diǎn)通過利用與目標(biāo)細(xì)胞在空間結(jié)構(gòu)、大小、形狀和官能團(tuán)上表現(xiàn)出的互補(bǔ)親和作用，達(dá)到快速識別和捕獲目標(biāo)細(xì)胞的目的。

采用相同的方法，在不存在SMMC-7721細(xì)胞的十二孔板中，制備得到非印跡材料(NIP)。

實(shí)施例2

細(xì)胞印跡材料(MIP1)用于識別與捕獲SMMC-7721細(xì)胞

將兩份細(xì)胞濃度為1×10⁶cells/ml的SMMC-7721細(xì)胞分別接種至MIP1印跡面和NIP表面，2小時后，細(xì)胞貼附于MIP1表面上的印跡位點(diǎn)處，而非印跡位點(diǎn)處和NIP表面無SMMC-7721細(xì)胞的貼附(圖4)，說明MIP1的印跡位點(diǎn)通過與SMMC-7721細(xì)胞發(fā)生多重作用，能夠快速、高校和高靈敏的識別與捕獲目標(biāo)細(xì)胞。進(jìn)一步將SMMC-7721細(xì)胞加入到人體血液樣本中，按照上述方法，MIP1也實(shí)現(xiàn)了從血液中特異性的識別和富集SMMC-7721細(xì)胞。

實(shí)施例3

基于MCF-7細(xì)胞模板的細(xì)胞印跡材料(MIP2)的制備

同實(shí)施例1，以MCF-7細(xì)胞為模板制備得到了可以特異性識別和捕獲MCF-7細(xì)胞的印跡材料(MIP2)，如圖5所示。

實(shí)施例4

基于光引發(fā)石墨烯摻雜預(yù)聚合體系的大腸桿菌細(xì)胞印跡材料(MIP3)的制備

將大腸桿菌培養(yǎng)在培養(yǎng)皿表面，當(dāng)80％的培養(yǎng)皿底部被大腸桿菌鋪滿后，加入摻雜有石墨烯的丙烯酰胺和亞甲基雙丙烯酰胺組成的預(yù)聚合水溶液，利用紫外光引發(fā)預(yù)聚合體系的固化反應(yīng)，用含乙酸和十二烷基硫酸鈉(SDS)的水溶液充分沖洗印跡層以去除表面的大腸桿菌，制備得到的印跡材料(MIP3)不僅可以特異性識別和捕獲大腸桿菌，還可以在近紅外光的照射下殺死大腸桿菌，起到滅菌的效果。

實(shí)施例5

基于氨酯單體的孢子細(xì)胞印跡材料(MIP4)的制備

將蘇云金芽胞桿菌的孢子細(xì)胞固定于聚二甲基硅氧烷(PDMS)基質(zhì)材料表面，同時將混有4,4’-亞甲基雙(異氰酸苯酯)、雙酚A和間苯三酚的四氫呋喃溶液在65℃溫度下攪拌溶液至凝膠點(diǎn)，然后將上述固定有孢子的基質(zhì)材料輕壓于凝膠溶液表面，待其固化后，去除基質(zhì)材料和模板孢子，制備得到對蘇云金芽胞桿菌的孢子具有特異性識別和捕獲能力的印跡材料(MIP4)。

實(shí)施例6

基于聚醚砜自組裝的酵母細(xì)胞印跡材料(MIP5)的制備

將釀酒酵母細(xì)胞固定在載玻片上，加入濃度為15％的聚醚砜的二甲基亞砜溶液，然后迅速加入去離子水使聚醚砜自組裝成印跡層，然后用SDS溶液沖洗去除釀酒酵母細(xì)胞得到細(xì)胞印跡材料(MIP5)。

實(shí)施例7

基于適配體修飾的有機(jī)硅基質(zhì)材料的MCF-7細(xì)胞印跡材料(MIP6)的制備

將特異性識別MCF-7細(xì)胞的適配體固定在PDMS基質(zhì)材料表面，然后在其表面加入MCF-7細(xì)胞的PBS溶液使細(xì)胞與適配體充分作用后，去除未被特異性結(jié)合的細(xì)胞。然后按照實(shí)施例1的方法制備能夠特異性識別MCF-7細(xì)胞的印跡材料(MIP6)。

實(shí)施例8

基于等離子處理的金屬基質(zhì)材料的SMMC-7721細(xì)胞印跡材料(MIP7)的制備

將鈦合金基質(zhì)材料表面做等離子體處理，然后將SMMC-7721細(xì)胞固定于處理后的基質(zhì)材料，按照實(shí)施例1的方法，制備能夠特異性識別MCF-7細(xì)胞的印跡材料(MIP7)。