人乳腺癌細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，以改良的肽庫消減篩選法篩選對(duì)人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7 細(xì)胞)特異性結(jié)合的多肽(序列），對(duì)人乳腺癌細(xì)胞具有良好的結(jié)合特異性和敏感性。 技術(shù)背景
[0002] 乳腺癌（breast cancer)是女性排名第一的惡性腫瘤，占女性新發(fā)惡性腫瘤的 30%，嚴(yán)重危害著婦女健康。據(jù)國(guó)際癌癥研究中心統(tǒng)計(jì)，全球每年約有46萬女性因乳腺癌死 亡，約占所有女性惡性腫瘤死亡的13.7%。近年來在我國(guó)特別是在一些大城市及沿海經(jīng)濟(jì) 發(fā)展較快的地區(qū)，乳腺癌的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。
[0003] 目前，針對(duì)乳腺癌的主要治療方法是影像檢查、腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)以及穿刺活檢等， 但是這些方法也可能會(huì)引起癌細(xì)胞擴(kuò)散，產(chǎn)生創(chuàng)傷等問題。目前已有的一些腫瘤標(biāo)志物大 部分是乳腺癌血清腫瘤標(biāo)志物，但是這些標(biāo)志物大都特異性和靈敏度較低，治療效果不明 顯。所以，盡快尋找一些新的乳腺腫瘤標(biāo)志物也是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，而其中的關(guān)鍵元件是對(duì) 癌細(xì)胞、癌組織具有特異靶向結(jié)合活性的分子片段的獲得。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于，提供以改良的肽庫消減篩選由噬菌體12肽庫篩選得到對(duì)乳腺 癌細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽序列，并提供鑒定該多肽與乳腺癌細(xì)胞特異性親和力的實(shí)驗(yàn)結(jié) 果，證明該多肽在乳腺癌的早期分子影像學(xué)診斷、靶向化療、與其它材料偶聯(lián)而進(jìn)行的乳腺 癌靶向治療等方面具有的巨大應(yīng)用價(jià)值。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案：
[0006] 乳腺癌MCF-7細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽，其氨基酸序列為:HPLGPTWRiroT。該多肽能 夠特異性結(jié)合MCF-7細(xì)胞，而不識(shí)別人胚腎HEK293細(xì)胞（即正常細(xì)胞），并對(duì)其他腫瘤細(xì)胞表 現(xiàn)出極低的親和力或者無親和力。
[0007] 上述乳腺癌MCF-7細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽的篩選方法為以體外培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞 系為靶細(xì)胞，以人胚腎HEK293細(xì)胞系為非特異性吸附細(xì)胞，對(duì)噬菌體隨機(jī)12肽庫進(jìn)行4輪消 減篩選，隨機(jī)挑取60個(gè)噬菌體克隆，利用ELISA鑒定陽性克隆。對(duì)陽性克隆進(jìn)行DNA測(cè)序，分 析其多肽的氨基酸序列組成及基本特征，最后獲得擁有共有序列(Consensus sequence)的 強(qiáng)陽性克隆組3個(gè)，對(duì)它們以細(xì)胞免疫熒光法進(jìn)一步鑒定其特異性和敏感性，確定最佳序 列。
[0008] 各種噬菌體克隆水平、最佳序列合成肽探針?biāo)降膶?shí)驗(yàn)結(jié)果均提示序列 HPLGPTWRIPDT特異性、敏感性最佳，這為該多肽未來用于乳腺癌的早期分子影像學(xué)診斷、靶 向化療、與其它材料偶聯(lián)而進(jìn)行的乳腺癌靶向治療等提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[0009] 本發(fā)明以乳腺癌MCF-7細(xì)胞為靶細(xì)胞，對(duì)噬菌體12肽庫以我們改良的消減篩選法 進(jìn)行了 4輪消減篩選，最后獲得3條共同多肽序列，分別為HPLGPTWRIPDT、NSQARRHSSIDT、 ANIDSSHHGNQP。通過一系列鑒定分析實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其中的HPLGPTWRIPDT對(duì)于乳腺癌的靶向性最 強(qiáng)，提示了其用于乳腺癌診斷、靶向治療方面的價(jià)值。
[0010]在乳腺癌檢測(cè)方面，利用同位素或者熒光標(biāo)記的多肽可以特異性結(jié)合乳腺癌細(xì) 胞/組織，適用于腫瘤成像和分子影像診斷，對(duì)于乳腺癌早期檢測(cè)、癌病灶定位和療效評(píng)價(jià) 都具有重要意義;在乳腺癌靶向治療方面，有望利用其特異性高、分子量小、穿透力強(qiáng)、親和 力高的特性來與傳統(tǒng)化療藥物(如順鉑、阿霉素等)偶聯(lián)，達(dá)到靶向遞送給藥的目的，可大大 減小化療藥物的非特異性和毒副作用。
【附圖說明】
[0011]圖1為本發(fā)明多肽的制備路線圖；
[0012] 圖2為隨機(jī)十二肽pill融合蛋白的N末端序列；
[0013] 圖3為專用密碼子表；
[0014] 圖4為60個(gè)噬菌體克隆與MCF-7細(xì)胞親和力兩次ELISA鑒定結(jié)果；
[0015]圖5為三條共有序列的代表性陽性噬菌體克隆與細(xì)胞親和力的免疫熒光鑒定，其 中:A、C、E分別為:噬菌體克隆Q35、Q3、Q41與細(xì)胞MCF-7的親和力;B、D、F分別為:噬菌體克隆 Q35、Q3、Q41與細(xì)胞HEK293的親和力;G、H分別為:PBS、URPs與細(xì)胞MCF-7的親和力；
[0016] 圖6為克隆Q35(HPLGPTWRIPDT)與其它腫瘤細(xì)胞親和力鑒定，其中：A:MCF-7;B: SiHa(宮頸癌細(xì)胞）；C:Caco2(結(jié)直腸癌細(xì)胞）；D:SGC-7901(胃癌細(xì)胞）；E:SMMC-7721(肝癌 細(xì)胞）；F:Eca-109(食道癌細(xì)胞）；
[0017]圖7為多肽(HPLGPTWRIPDT)與細(xì)胞特異性結(jié)合的劑量效應(yīng)，其中：A、B、C、D、E為多 肽與乳腺癌細(xì)胞MCF-7結(jié)合;？、6、11、1、1為多肽與人胚腎細(xì)胞冊(cè)1(293結(jié)合，兩組濃度分別為 1 OuM、15虛、2 OuM、2 5虛、3 OuM;
[0018] 圖8為多肽(HPLGPTWRIPDT)與細(xì)胞特異性結(jié)合的時(shí)間效應(yīng)，其中：A、B、C、D、E為多 肽與乳腺癌細(xì)胞MCF-7結(jié)合;？、6、11、1、1為多肽與人胚腎細(xì)胞冊(cè)1(293結(jié)合，兩組孵育時(shí)間分 另lj 為 10min、20min、40min、60min、80min;
[0019]圖9為多肽(HPLGPTWRIPDT)與乳腺癌細(xì)胞的結(jié)合部位，其中：A、C:FITC-陽性多肽 與 MCF-7、HEK293細(xì)胞;B、D: FI TC-陰性多肽與 MCF-7、HEK293細(xì)胞；
[0020]圖10為多肽(HPLGPTWRiroT)與其它腫瘤細(xì)胞的結(jié)合特異性，其中：A:SiHa(宮頸癌 細(xì)胞）；B: SKV3 (卵巢癌細(xì)胞）；C: Cac〇2 (結(jié)直腸癌細(xì)胞）；D: SGC-7901 (胃癌細(xì)胞）；E: SMMC-7721(肝癌細(xì)胞）；F:Eca-109(食道癌細(xì)胞）；
[0021]圖11為流式細(xì)胞儀檢測(cè)多肽(HPLGPTWRIH)T)的結(jié)合特異性，其中:A:乳腺癌MCF-7 細(xì)胞;B:HEK293細(xì)胞。綠色：FITC-Brca Probe;紅色：FITC-Ctrl Probe;黑色：PBS;
[0022] 圖12為多肽(HPLGPTWRiroT)競(jìng)爭(zhēng)抑制：多肽（HPLGPTWRiroT)孵育靶細(xì)胞后，再以 噬菌體克隆Q35孵育靶細(xì)胞，洗滌后根據(jù)噬菌體發(fā)出熒光的強(qiáng)弱分析多肽的特異性結(jié)合力。 該競(jìng)爭(zhēng)抑制力與多肽濃度正相關(guān)，說明多肽特異性良好。
[0023]以下結(jié)合附圖和具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 菌體展示技術(shù)是1985年由美國(guó)Missouri大學(xué)的G.P. Smith等創(chuàng)立的一項(xiàng)能夠特 異性篩選多肽或蛋白的技術(shù)。該技術(shù)將目的基因編碼的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌 體表面，與噬菌體的衣殼蛋白融合表達(dá)，被展示的多肽或蛋白能夠保持相對(duì)獨(dú)立的空間結(jié) 構(gòu)和生物活性。目前，噬菌體展示技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于腫瘤標(biāo)志物的篩選、腫瘤藥物的靶 向運(yùn)輸和多肽藥物開發(fā)等方面的研究。
[0025] 本發(fā)明就是利用上述肽庫以改良的肽庫消減篩選法篩選可以特異敏感的結(jié)合于 人乳腺癌細(xì)胞的一條多肽序列，并以相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明了該序列對(duì)人乳腺癌細(xì)胞結(jié)合的高度特 異性和敏感性。該多肽具有親和力高、分子量小、組織穿透性強(qiáng)、免疫原性低、易合成等特 點(diǎn)，將其連接其它效應(yīng)分子，可以用于乳腺癌的早期分子影像學(xué)診斷，形成腫瘤三維成像， 大大提高乳腺癌的早期診斷率，并可對(duì)治療療效評(píng)價(jià);作為乳腺癌化療藥物的導(dǎo)向元件而 用于乳腺癌的靶向化療，可大大降低藥物毒性而提高療效，使化療成為對(duì)病人確實(shí)有益的 治療方法之一;將多肽與納米脂質(zhì)體或納米藥物偶聯(lián)，可達(dá)到更好的靶向治療效果；用于尋 找腫瘤細(xì)胞表面相關(guān)配體的研究，為腫瘤治療提供新的靶點(diǎn)。
[0026] 本發(fā)明以人乳腺癌MCF-7細(xì)胞為靶細(xì)胞，對(duì)噬菌體肽庫以改良的肽庫消減篩選法 進(jìn)行4輪消減篩選，尋找與乳腺癌細(xì)胞MCF-7具有特異性結(jié)合力的噬菌體肽序，為進(jìn)一步研 發(fā)乳腺癌早期靶向診斷試劑和高效低毒靶向治療藥物奠定基礎(chǔ)，具體技術(shù)路線如圖1所示。 [0027] 一、材料與方法
[0028] 1.1主要實(shí)驗(yàn)材料
[0029] 1.1.1細(xì)胞株人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7,購于美國(guó)ATCC(Rockville，USA)，人胚腎細(xì)胞 株HEK293，為本實(shí)驗(yàn)室保存。
[0030] 1.1.2噬菌體隨機(jī)十二肽庫貯存:與甘油1:1保存在TBS溶液中，1.5 X 1013pfu/ml。 復(fù)雜度:~2.7X109個(gè)轉(zhuǎn)化子。載體M13KE的外殼基因-96gIII測(cè)序引物:5'- HQCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3,。
[0031] 1.1.3宿主菌￡.(：〇11￡1?2738，與甘油1:1保存在-80°(：超低溫冰箱中。
[0032] 1.2實(shí)驗(yàn)方法
[0033] 1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)
[0034] 用DMEM完全培養(yǎng)基、37 °C、飽和濕度、5 % C02孵箱。
[0035] 1.2.2宿主菌￡.(：〇11￡1?2738的準(zhǔn)備
[0036] E.coli ER2738是NEB公司的Ph.D系列噬菌體肽庫的專用菌株。用LB-Tet培養(yǎng)基、 37 °C恒溫?fù)u床、300rpm振蕩過夜。
[0037] 1.2.3噬菌體隨機(jī)十二肽庫體外快速消減篩選
[0038]以人胚腎細(xì)胞HEK293作為陰性吸附細(xì)胞預(yù)吸附以排除非正常細(xì)胞靶向克隆，再以 人乳腺癌細(xì)胞M C F - 7和作為靶細(xì)胞，對(duì)靶向乳腺癌克隆以改良后的消減篩選法 (Subtraction Biopanning)進(jìn)行淘篩，重復(fù)4輪。相對(duì)于菌體肽庫試劑盒生產(chǎn)商--美國(guó) 新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司（New England BioLabs Inc.，NEB)提供的傳統(tǒng)經(jīng)典Biopanning 方法（見試劑盒說明書），在此基礎(chǔ)上，改良的消減篩選法每一輪Biopanning的特色如下： (1)每輪第一步增加了以正常細(xì)胞對(duì)投入噬菌體肽庫的預(yù)吸附，以盡可能除去非癌細(xì)胞靶 向的噬菌體克??；（2)將傳統(tǒng)步驟要求的"擴(kuò)增"步驟的25ml菌液體積改為3ml。這一改變大 大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)難度和提高了篩選效率；（3)由于第（2)項(xiàng)改變，最后一輪（一般做4輪 Biopanning)可以隨機(jī)挑選至少60個(gè)或更多的菌體克隆。
[0039]最后一輪隨機(jī)選擇60個(gè)克隆擴(kuò)增以后以ELISA法鑒定與靶細(xì)胞MCF-7的親和力。
[0040] 1.2.4陽性噬菌體克隆多肽序列的測(cè)定
[0041] 對(duì)噬菌體陽性克隆、無關(guān)克隆進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)遺傳密碼子表格(參見圖2、圖3)，將 多肽序列翻譯成氨基酸序列并獲得Consensus序列。
[0042] 1 ? 2 ? 5Consensus序列的結(jié)合特異性鑒定
[0043] 以Consensus序列的代表性克隆通過常規(guī)細(xì)胞免疫熒光法進(jìn)行結(jié)合特異性和敏感 性的鑒定。
[0044] 1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
[0045] 利用SPSS 16.0數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果用f 土 SD表示，P〈0.01表 示差異極顯著，P〈〇. 05表示差異顯著，P>0.05說明差異不顯著，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，組間多重比 較采用Duncan檢驗(yàn)處理。
[0046] 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0047] 2.1陽性克隆的ELISA鑒定和測(cè)序
[0048]獲得陽性噬菌體克隆36個(gè)，其中克隆Q35與MCF-7細(xì)胞結(jié)合特異性最高，結(jié)果如圖4 所示。陽性噬菌體克隆有3個(gè)共有序列:HPLGPTWRIPDT、NSQARRHSSIDT、ANIDSSHHGNQP。
[0049] 2.2陽性噬菌體克隆的結(jié)合特異性
[0050] 結(jié)果如圖5和圖6所示，陽性噬菌體克隆均結(jié)合MCF-7細(xì)胞而不與HEK293細(xì)胞結(jié)合， 以克隆Q35(HPLGPTWRIH)T)最佳，說明陽性多肽有很好的靶向性。
[0051 ] 2.3多肽HPLGPTWRIPDT的特異性和敏感性鑒定
[0052] 結(jié)果如圖7-圖12所示。多肽HPLGPTWRIPDT特異結(jié)合MCF-7細(xì)胞而不與HEK293及其 他細(xì)胞結(jié)合。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 人乳腺癌細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽，其特征在于，該多肽的氨基酸序列為： HPLGPTWRIPDT。2. 權(quán)利要求1所述多肽特異結(jié)合人乳腺癌細(xì)胞的應(yīng)用。3. 權(quán)利要求1所述多肽用于制備治療人乳腺癌藥物的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及人乳腺癌細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽及其應(yīng)用，所涉及多肽的氨基酸序列為：HPLGPTWRIPDT。所涉及的應(yīng)用為本發(fā)明的人乳腺癌細(xì)胞MCF-7特異性結(jié)合的多肽特異結(jié)合人乳腺癌的應(yīng)用。本發(fā)明篩選和初步鑒定獲得的乳腺癌靶向多肽具有明顯的乳腺癌細(xì)胞結(jié)合特異性，可用于研發(fā)乳腺癌早期靶向診斷試劑、高效低毒靶向治療藥物。
【IPC分類】A61P35/00, A61K47/42, C07K7/08
【公開號(hào)】CN105713070
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610085381
【發(fā)明人】侯穎春, 肖麗, 高曉杰, 何慧敏, 薛琴琴, 韓娟娟, 達(dá)苗苗, 馬樂樂, 馬妮, 程思楠
【申請(qǐng)人】陜西師范大學(xué)