目前開(kāi)發(fā)中的抗腫瘤疫苗采取許多形式，包括游離肽、重組蛋白、裝載有肽或腫瘤裂解物的樹(shù)突狀細(xì)胞和DNA。盡管基于肽的疫苗在可行性方面相對(duì)于其它形式非常有吸引力，但是發(fā)現(xiàn)靶向優(yōu)勢(shì)腫瘤肽的疫苗的許多研究?jī)H引發(fā)弱的免疫學(xué)和臨床應(yīng)答，具有強(qiáng)的患者間變異性。在若干臨床研究中所測(cè)試的來(lái)源于gp100的幾種肽疫苗、在II期隨機(jī)試驗(yàn)中測(cè)試的MUC1衍生的BLP25肽和在非常大量的I期和II期臨床研究中測(cè)試的HER-2/neu衍生的E75肽，也是如此((Butts et al,2005；Peoples et al,2008；Rosenberg et al,2004)。
優(yōu)化的隱性肽比轉(zhuǎn)基因小鼠模型中的優(yōu)勢(shì)肽更有效地誘導(dǎo)抗腫瘤免疫(Gross et al,2004)，并且基于該技術(shù)的兩種疫苗目前處于臨床開(kāi)發(fā)中：
-Vx-001，標(biāo)明為NSCLC癌癥HLA-A2患者的TERT衍生的單表位肽，處于IIb期，以及
-Vx-006，也被標(biāo)明為HLA-A2患者的靶向TERT、MAGE-A和HER-2/neu通用腫瘤抗原的三表位多肽，處于I期。
使用基于多肽的疫苗引發(fā)針對(duì)多種抗原的CTL應(yīng)答的方法具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。特別地，至少一種靶抗原的表達(dá)應(yīng)當(dāng)足以觸發(fā)疫苗誘導(dǎo)的CTL從而殺死腫瘤細(xì)胞，并且腫瘤細(xì)胞不可能同時(shí)丟失所有靶抗原，特別是當(dāng)這些抗原對(duì)于細(xì)胞存活和腫瘤生長(zhǎng)是必需的時(shí)候。這種方法可以引起強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答(Oukka et al,1996)，并增加可能從疫苗中獲益的患者比例。此外，廣譜癌癥疫苗應(yīng)靶向被多種腫瘤過(guò)表達(dá)的通用腫瘤抗原，諸如TERT、HER-2/neu、MUC-1、CEA、EphA2和MAGE-A(Minev et al,2000；Ofuji et al,1998；Ogata et al,1992；Reese&Slamon,1997；Slamon et al,1987；Van den Eynde&van der Bruggen,1997；Vonderheide et al,1999)。這些抗原中的大多數(shù)參與腫瘤細(xì)胞存活和致瘤性，因此它們下調(diào)以逃避免疫應(yīng)答可能對(duì)腫瘤生長(zhǎng)具有有害作用。
為了增加可以從這樣的產(chǎn)品中受益的患者的數(shù)量，本發(fā)明人已經(jīng)開(kāi)發(fā)了命名為Vbx-016的指定給表達(dá)HLA-B7的患者的基于多肽的疫苗，其靶向四種廣泛表達(dá)的腫瘤抗原：TERT、HER-2/neu、MAGE和CEA。已經(jīng)描述了構(gòu)成Vbx-016的四種優(yōu)化的隱蔽肽(表1)(WO2008/010098、WO2010/143010)。四種肽中的每一種均顯示在體內(nèi)和體外(WO2008/010098、WO2010/143010)引發(fā)針對(duì)優(yōu)化的肽和針對(duì)腫瘤細(xì)胞天然表達(dá)的天然同源肽兩者的抗腫瘤應(yīng)答(表1)。有趣的是，由MAGE-A273V6L9引發(fā)的CTL靶向六種MAGE-A抗原(-A1、-A2、-A3、-A4、-A6和-A12)。事實(shí)上，使用MAGE-A273V6L9誘導(dǎo)的特異性CTL能夠識(shí)別負(fù)載有MAGE-A273A6(包括在MAGE-A1和MAGE-A4中)、MAGE-A273I6(包括在MAGE-A2和MAGE-A6中)和MAGE-A273V6(包括在MAGE-A3和MAGE-A12中)的細(xì)胞。
表1：天然的和優(yōu)化的表位序列
通常，在皮下注射之前，將基于多肽的疫苗用佐劑諸如Montanide ISA51VG(Seppic，Castres，F(xiàn)rance)乳化。注射后，多肽被內(nèi)化到專(zhuān)業(yè)抗原呈遞細(xì)胞(APC)中，特別是局部存在于皮膚中的朗格漢斯細(xì)胞。然后，多肽由高爾基體中的蛋白酶體加工，并且表位與HLA分子相關(guān)聯(lián)被呈遞在細(xì)胞表面。為了確保多肽的每個(gè)表位的有效呈遞，必須測(cè)試每個(gè)連接(junction)是否被蛋白酶體正確加工。此外，本發(fā)明人先前已經(jīng)描述了對(duì)于Vx006三表位多肽，多表位疫苗序列中各表位的順序?qū)τ诒砦患庸ず妥罱K獲得針對(duì)所有相應(yīng)表位的免疫應(yīng)答是至關(guān)重要的(WO2007/073768)。
然后，為了避免測(cè)試24個(gè)推斷的排列，在兩個(gè)步驟中確定多肽中四個(gè)優(yōu)化的肽的最佳構(gòu)造：(i)測(cè)試每個(gè)連接序列；和(ii)測(cè)試相應(yīng)的完整多肽。
因此測(cè)試每個(gè)潛在的連接。然后就表2中所呈現(xiàn)的十二種可能的二肽在HLA-B*0702轉(zhuǎn)基因小鼠中體內(nèi)測(cè)試并在健康供體PBMC培養(yǎng)物中體外測(cè)試以下能力：
-二肽被有效加工并誘導(dǎo)能夠識(shí)別負(fù)載有每種優(yōu)化的表位的細(xì)胞的特異性CTL的能力，
-誘導(dǎo)CTL以識(shí)別對(duì)應(yīng)于天然存在于腫瘤細(xì)胞表面的序列的同源天然肽的能力。
表2.在轉(zhuǎn)基因小鼠中測(cè)試的二肽序列
首先，將每個(gè)二肽序列提交到兩個(gè)主要的計(jì)算機(jī)模擬(in silico)的蛋白酶體切割預(yù)測(cè)軟件MAPPP(由和Hans-Joachim Mollenkopf在Max-Planck-Institute for Infection Biology開(kāi)發(fā)，可在萬(wàn)維網(wǎng)上獲得)和PAProC(Prediction Algorithm for Proteasomal Cleavages用于蛋白酶體切割的預(yù)測(cè)算法，也可在萬(wàn)維網(wǎng)上獲得)，其預(yù)測(cè)每個(gè)表位的加工概率。
根據(jù)PAProC，除了可以產(chǎn)生兩個(gè)表位(切割位點(diǎn)具有雙短劃線)的7T5HN3M之外，蛋白酶體不能正確地加工任何二肽(預(yù)測(cè)的切割位點(diǎn)用短劃線表示，表3)。
表3：二肽的蛋白酶體切割預(yù)測(cè)(PaProc)
根據(jù)MAPPP預(yù)測(cè)模型，許多組合應(yīng)允許加工四個(gè)表位(數(shù)據(jù)未顯示)。應(yīng)當(dāng)確保蛋白酶體對(duì)每個(gè)表位有效加工的預(yù)測(cè)的最佳序列是CEA188L9/MAGE273L9/TERT444A1/HER-2/neu246A1。
然后在HLA-B*0702轉(zhuǎn)基因小鼠中體內(nèi)測(cè)試二肽。如實(shí)施例1所述，就應(yīng)答小鼠的數(shù)目而言，組合7C1HN3M、7C1T5M、7T5HN3M、7M1HN3M和7T5M1M產(chǎn)生比相應(yīng)的反向序列更好的結(jié)果。7C1M1M和7M1C1M得到相同的結(jié)果。
基于這些體內(nèi)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，然后設(shè)計(jì)以下理論最佳多肽：CEA188L9/TERT444A1/MAGE273L9/HER-2/neu246A1。
為了評(píng)估表位是否在四肽中被有效加工，在HLA-B*0702轉(zhuǎn)基因小鼠中測(cè)試相應(yīng)的多肽SPRLQLSNLAPRRLVQLLGPRALVETLAPKHSDCLA(SEQ ID No：23)誘導(dǎo)特異性CTL和天然存在于腫瘤細(xì)胞表面的四個(gè)同源天然肽的能力，所述特異性CTL識(shí)別四個(gè)優(yōu)化的表位。如實(shí)施例2所述，在用多肽接種兩次后，所有小鼠響應(yīng)至少一種天然肽，并且大多數(shù)接種的小鼠響應(yīng)兩種或更多種同源天然肽，這證實(shí)了多肽被蛋白酶體有效加工。重要的是，在一只接種的小鼠中所有天然肽均被識(shí)別至少一次。
有趣的是，該序列不同于通過(guò)蛋白酶體MAPPP切割預(yù)測(cè)模型選擇的序列，原因是與在體內(nèi)發(fā)生的情況相反，7M1T5M被預(yù)測(cè)為不被正確處理。
為了在人中體外證實(shí)由HLA-B*0702轉(zhuǎn)基因小鼠獲得的結(jié)果，在來(lái)自健康的人類(lèi)供體的PBMC培養(yǎng)物中獨(dú)立地體外測(cè)試所定義的多肽的每種連接(CEA188L9/TERT444A1、TERT444A1/MAGE273L9和MAGE273L9/HER-2/neu246A1)。實(shí)施例3中所述結(jié)果顯示，在人中每個(gè)二肽被有效地體外加工，并且所誘導(dǎo)的特異性CTL能夠識(shí)別負(fù)載有優(yōu)化的或同源天然肽的細(xì)胞。
最后，在來(lái)自一個(gè)HLA-B*0702健康供體的PBMC培養(yǎng)物中測(cè)試多肽SPRLQLSNLAPRRLVQLLGPRALVETLAPKHSDCLA(SEQ ID No：23)(實(shí)施例4)，這證實(shí)所述多肽產(chǎn)生多特異性CTL免疫應(yīng)答的能力。重要的是，識(shí)別了幾種天然肽。這些結(jié)果證實(shí)多肽被蛋白酶體有效加工，并且所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答是多特異性的。
因此，本發(fā)明的第一方面是包含序列SPRLQLSNLXXXAPRRLVQLLXXXGPRALVETLXXXAPKHSDCLA(Seq IDNo：24)的多肽。在該序列中，CEA188L9、TERT444A1、MAGE273L9和HER-2/neu246A1表位由間隔區(qū)XXX分開(kāi)，其中每個(gè)X(彼此獨(dú)立地)是任何氨基酸或不存在。因此，所述多肽至少長(zhǎng)36個(gè)氨基酸；可以通過(guò)在表位之間添加間隔區(qū)和/或通過(guò)在其N(xiāo)-末端和/或C-末端添加有利于其加工的信號(hào)來(lái)增加其長(zhǎng)度。特別地，根據(jù)本發(fā)明的多肽還可以在其N(xiāo)末端包含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)序列。幾種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)序列已經(jīng)在科學(xué)文獻(xiàn)中有描述并且可以用于本發(fā)明的情況中。例如，可以根據(jù)發(fā)明在肽的N-末端添加Igκ-鏈信號(hào)序列(Ishioka et al,1999)和E3/19-kD蛋白信號(hào)序列(Anderson et al,1991)。或者或另外，本發(fā)明的多肽可以在其C末端進(jìn)一步包含泛素，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的泛素化導(dǎo)致蛋白水解增加。
在本發(fā)明的多肽的優(yōu)選實(shí)施方案中，四個(gè)表位彼此直接結(jié)合而不使用任何間隔區(qū)(對(duì)于每個(gè)位置X＝不存在)。因此，所述多肽包含序列SPRLQLSNLAPRRLVQLLGPRALVETLAPKHSDCLA(Seq ID No：23)。因此，在缺乏泛素和ER-轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)的情況下，所述多肽由下面實(shí)施例中所示的多肽(SPRLQLSNLAPRRLVQLLGPRALVETLAPKHSDCLA，Seq ID No：23)組成。
在本發(fā)明的多肽中，氨基酸可以是L-或D-氨基酸。
本發(fā)明的多肽在大多數(shù)用所述多肽接種的HLA-B*0702轉(zhuǎn)基因小鼠中誘導(dǎo)針對(duì)選自CEA188、TERT444、MAGE273和HER-2/neu246同源天然肽中的至少一種并且優(yōu)選至少兩種肽的特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。
在利用來(lái)自健康HLA-B*0702供體的人PBMC的體外測(cè)定中，根據(jù)本發(fā)明的多肽還誘導(dǎo)針對(duì)選自CEA188、TERT444、MAGE273和HER-2/neu246天然肽中的至少一種并且優(yōu)選至少兩種肽的特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。
為了控制SEQ ID No：23的多肽被正確加工并具有良好的免疫原性，本發(fā)明人還已經(jīng)證實(shí)：
-每個(gè)天然肽在HLA-B*0702轉(zhuǎn)基因小鼠中至少被識(shí)別一次；
-在利用來(lái)自健康HLA-B*0702供體的人PBMC的體外測(cè)定中，SEQ ID No：23的多肽誘導(dǎo)針對(duì)選自CEA188、TERT444、MAGE273和HER-2/neu246同源天然肽中的至少一種并且通常兩種或多種肽的特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答；和
-用來(lái)自兩個(gè)或更多個(gè)健康HLA-B*0702供體的PBMC獲得了這些特異性應(yīng)答，并且每個(gè)優(yōu)化的肽在利用來(lái)自HLA-B*0702健康供體的人PBMC的體外測(cè)定中被識(shí)別至少一次。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽顯示所有上述性質(zhì)，其可以容易地由技術(shù)人員使用下文實(shí)驗(yàn)部分中描述的操作方案和測(cè)定進(jìn)行測(cè)試。
本發(fā)明的另一方面是裝載有如上所述的多肽的分離的樹(shù)突狀細(xì)胞。在本文中，“分離的”是指所述樹(shù)突狀細(xì)胞在患者體外。所述細(xì)胞優(yōu)選離體裝載。例如，可以通過(guò)Vonderheide等人描述的技術(shù)(Vonderheide et al,2004)用多肽裝載所述樹(shù)突狀細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及包含肽遞送載體和如上所述的多肽的復(fù)合物?？筛鶕?jù)本發(fā)明使用的肽遞送載體的實(shí)例是細(xì)胞穿透肽，諸如在公開(kāi)為WO2013/150338、EP1795539和WO2014/053629的專(zhuān)利申請(qǐng)中描述的那些，細(xì)菌毒素諸如百日咳桿菌(B.pertussis)的腺苷酸環(huán)化酶(Fayolle et al,1999)、白喉毒素(Fayolle et al,1999)、炭疽毒素(Doling et al,1999)、志賀毒素的B亞基(Haicheur et al,2000)和其他載體諸如蜂毒PLA2(Babon et al,2005)、脂質(zhì)體、病毒體(Bungener et al,2002)等。
本發(fā)明還涉及包含如上所述的多肽和/或工程化樹(shù)突狀細(xì)胞和/或復(fù)合物以及藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。特別地，本發(fā)明的多肽、樹(shù)突狀細(xì)胞和復(fù)合物可以用于制備用于抗癌免疫治療的免疫原性組合物。這些組合物特別可用于表達(dá)選自MAGE-A家族、HER家族、CEA和TERT中的至少一種抗原的腫瘤的免疫治療，特別是用于治療HLA-B*0702個(gè)體。
本發(fā)明可用于治療(或預(yù)防其復(fù)發(fā))幾乎任何類(lèi)型的癌癥，諸如腎上腺皮質(zhì)癌，結(jié)腸直腸癌，膽管癌，膀胱癌，骨癌，腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥，乳腺癌，子宮頸癌，子宮內(nèi)膜癌，食管癌，胃癌，胃腸道類(lèi)癌瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，卡波西肉瘤，腎癌，頭頸癌，肝癌，肺癌間皮瘤，卵巢癌，胰腺癌，陰莖癌，垂體癌，前列腺癌，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，橫紋肌肉瘤，皮膚癌(例如黑素瘤，非黑素瘤皮膚癌)，睪丸癌，胸腺癌，甲狀腺癌，陰道癌，外陰癌和子宮癌。
癌癥疫苗接種或治療方法，所述癌癥疫苗接種或治療方法包括用佐劑乳化多肽的步驟和將本發(fā)明的多肽在體內(nèi)施用于有需要的患者，以及包括將如上所述的工程化樹(shù)突狀細(xì)胞或復(fù)合物施用于個(gè)體的步驟的疫苗接種或治療方法，也是本發(fā)明的一部分。
本發(fā)明的另一方面是包含至少一個(gè)劑量的如上所述的多肽(或復(fù)合物)和至少一個(gè)劑量的佐劑的多個(gè)部件的試劑盒(a kit of parts)。免疫佐劑是加入到疫苗制劑中以增加其功效的物質(zhì)。佐劑可以增加由疫苗接種誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的量級(jí)和持續(xù)時(shí)間?？捎糜诒景l(fā)明的試劑盒中的佐劑的優(yōu)選實(shí)例是衍生自不完全弗氏佐劑(IFA)的那些佐劑。具有這些佐劑的疫苗制劑是油包水(W/O)乳劑?？捎糜诟鶕?jù)本發(fā)明的肽的乳劑的IFA型脫毒佐劑的非限制性實(shí)例包括基于礦物油的 ISA 51和基于角鯊烯的ISA720(SEPPIC，F(xiàn)rance)。
根據(jù)本發(fā)明的另一試劑盒包含至少兩個(gè)劑量的如上所述的多肽或復(fù)合物。所述肽可以已經(jīng)與佐劑一起配制或沒(méi)有與佐劑一起配制。
由于癌癥接種需要幾種刺激完全有效，本發(fā)明的試劑盒可以包含3至50、優(yōu)選6至20個(gè)劑量的如上所述的多肽。
根據(jù)上述試劑盒的優(yōu)選實(shí)施方案，每個(gè)劑量的多肽包含0.5至10mg的多肽。
本發(fā)明通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)施例
實(shí)施例使用以下材料和方法進(jìn)行：
轉(zhuǎn)基因小鼠。先前描述了HLA-B7H-2I型敲除小鼠(Rohrlich et al,2003)，并由F.Lemonnier(Institut Pasteur，Paris，F(xiàn)rance)友情提供。
細(xì)胞。轉(zhuǎn)染HLA-B*0702的人T2-B7細(xì)胞先前已有描述(Rohrlich et al,2003)。細(xì)胞在補(bǔ)充有青霉素鏈霉素FCS 20％的RPMI1640培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
肽和質(zhì)粒。肽由Millegen(Labège,France)或Eurogentec(Seraing，Belgique)合成。
HLA-B*0702轉(zhuǎn)基因小鼠中體內(nèi)CTL誘導(dǎo)。HLA-B*0702轉(zhuǎn)基因小鼠在尾基部?jī)纱纹は陆臃N與HV核心T13L輔助子(150μg)輔助肽締合并乳化于不完全弗氏佐劑(IFA)或Montanide ISA51VG(Seppic，Castres，F(xiàn)rance)的200μg優(yōu)化的二肽或400μg的Vbx-016，間隔兩周。
最后一次疫苗接種后7天，取出脾臟，通過(guò)Ficoll離心分離T細(xì)胞，并離體檢測(cè)10μM天然或優(yōu)化的肽的識(shí)別。陽(yáng)性對(duì)照是伴刀豆球蛋白A，陰性對(duì)照是僅培養(yǎng)基。所有條件一式四份進(jìn)行測(cè)試。通過(guò)ELISpot使用Diaclone Kit Murine IFNγELISpot定量產(chǎn)生的T細(xì)胞。
當(dāng)1)在陰性對(duì)照和測(cè)試肽之間存在超過(guò)10個(gè)點(diǎn)差異/106個(gè)細(xì)胞并且2)這兩個(gè)組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異的T檢驗(yàn)(p<0.05)時(shí)，免疫應(yīng)答被認(rèn)為是陽(yáng)性的。
從人PBMC產(chǎn)生CTL。通過(guò)白細(xì)胞單采術(shù)(leukapheresis)從健康HLA-B*0702志愿者收集PBMC。從在完全合成培養(yǎng)基(AIMV)中用500IU/ml GM-CSF和500IU/ml IL-4培養(yǎng)7天的貼壁細(xì)胞產(chǎn)生樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)。在第6天，DC用10μM多肽脈沖刺激過(guò)夜。在第7天，通過(guò)用CD8Dynabeads Untouched Human CD8的陰性選擇來(lái)純化CD8+細(xì)胞。在在圓底96孔板的補(bǔ)充有1000IU/ml IL-6和5IU/ml IL-12、1μg/ml抗CD40和500IU/ml IFNγ的AIMV培養(yǎng)基中，用3×104個(gè)經(jīng)肽脈沖刺激的DC刺激CD8+細(xì)胞(2×105)+CD8-細(xì)胞(6×104)。
從第7天開(kāi)始，在20IU/ml IL-2和10ng/ml IL-7、1μg/ml抗-CD40和500IU/ml IFNγ存在下，用負(fù)載肽的DC每周再刺激培養(yǎng)物。
在第三次再刺激后，CD8細(xì)胞在補(bǔ)充有20IU/ml IL-2的AIMV中保持7天。培養(yǎng)物在一夜間用AIMV饑餓，然后在IFNγELISpot測(cè)定中測(cè)試。
IFNγELISpot測(cè)定。對(duì)于一個(gè)96孔的培養(yǎng)物，收集24個(gè)孔的4個(gè)匯集物，將CD8細(xì)胞計(jì)數(shù)，并且在ELISpot板上每個(gè)孔分配50 000個(gè)CD8，每個(gè)孔含有負(fù)載10μM每種天然單肽或10μM由所述多肽組成的修飾的單肽的25000個(gè)T2B7。每個(gè)條件進(jìn)行8個(gè)重復(fù)。陽(yáng)性對(duì)照是植物血凝素A，陰性對(duì)照是裝載有不能結(jié)合HLA-B7分子的不相關(guān)肽的T2B7。
實(shí)施例1：在用所有不同的二肽組合進(jìn)行兩次接種后的HLA-B*0702轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生的T細(xì)胞免疫應(yīng)答的評(píng)估
使用每種二肽以2周的間隔接種HLA-B*0702轉(zhuǎn)基因小鼠兩次，并測(cè)試其誘導(dǎo)針對(duì)優(yōu)化的肽及其同源天然對(duì)應(yīng)物兩者的免疫應(yīng)答的能力。二肽描述于表2中。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，最佳組合以灰色突出顯示。就應(yīng)答小鼠的數(shù)目而言，7C1HN3M、7C1T5M、7T5HN3M、7M1HN3M和7T5M1M給出比反向序列更好的結(jié)果。7C1M1M和7M1C1M得到相同的結(jié)果。
表4：HLA-B*0702轉(zhuǎn)基因小鼠中每種二肽的測(cè)試
實(shí)施例2：用Vbx-016兩次接種后在HLA-B*0702小鼠中產(chǎn)生的T細(xì)胞免疫應(yīng)答的評(píng)價(jià)
為了評(píng)估在二肽實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的Vbx-016(SEQ ID No：23)是否是最佳的，將HLA-B*0702轉(zhuǎn)基因小鼠在尾基部用乳化于不完全弗氏佐劑(IFA)或Montanide ISA51VG(Seppic，Castres，F(xiàn)rance)中的400μg的Vbx-016和150μg的HBV核心T13L輔助肽接種兩次，間隔兩周。
在兩次接種后，所有小鼠響應(yīng)至少一種天然肽，并且13/14接種的小鼠響應(yīng)兩種或更多種同源天然肽。重要的是，在一只接種的小鼠中每個(gè)天然肽被識(shí)別至少一次。
表5：HLA-B*0702轉(zhuǎn)基因小鼠中SEQ ID No：23的四肽的測(cè)試
實(shí)施例3：通過(guò)利用在HLA-B*0702轉(zhuǎn)基因小鼠中選擇的二肽體外誘導(dǎo)來(lái)自人體外周血單核細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞而評(píng)價(jià)T細(xì)胞免疫應(yīng)答。
為了評(píng)估在轉(zhuǎn)基因小鼠中驗(yàn)證的多肽CEA188L9/TERT444A1/MAGE273L9/HER-2/neu246A1中存在的連接是否在人中被有效地加工，用每種二肽(CEA188L9/TERT444A1、TERT444A1/MAGE273L9和MAGE273L9/HER-2/neu246A1)根據(jù)方法中描述的操作方案刺激人PBMC。通過(guò)測(cè)量來(lái)自由二肽刺激的CD8+的特異性IFNγ產(chǎn)生細(xì)胞，分成4個(gè)用于測(cè)試的匯集物，來(lái)評(píng)估同源天然肽的識(shí)別。當(dāng)對(duì)于感興趣的肽獲得的平均點(diǎn)數(shù)優(yōu)于使用不相關(guān)肽獲得的平均點(diǎn)數(shù)時(shí)，進(jìn)行T檢驗(yàn)；當(dāng)t檢驗(yàn)值小于0.05時(shí)，結(jié)果被認(rèn)為是顯著陽(yáng)性的并在下表中以灰色突出顯示。
在每個(gè)供體中，CTL能夠識(shí)別優(yōu)化的和同源的天然肽(以及MAGE-A273L9共有肽的四種天然肽)，證實(shí)每個(gè)連接均被蛋白酶體良好加工。
表6：用包含在多肽SEQ ID No：23中的每個(gè)二肽刺激的HLA-B7健康供體PBMC的培養(yǎng)物，irr：無(wú)關(guān)肽，t檢驗(yàn)陽(yáng)性以灰色突出顯示
實(shí)施例4：用Vbx-016從人外周血單核細(xì)胞體外誘導(dǎo)特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。
最終將Vbx-016用于刺激來(lái)自健康供體的人PBMC。
當(dāng)對(duì)于感興趣的肽獲得的平均點(diǎn)數(shù)優(yōu)于使用不相關(guān)肽獲得的平均點(diǎn)數(shù)時(shí)，進(jìn)行t檢驗(yàn)；當(dāng)t檢驗(yàn)值小于0.05時(shí)，結(jié)果被認(rèn)為是顯著陽(yáng)性的并在下表中以灰色突出顯示。多特異性應(yīng)答被誘導(dǎo)，并且由所誘導(dǎo)的CTL識(shí)別幾種天然肽，這證實(shí)了多肽被蛋白酶體良好加工并且所誘導(dǎo)的應(yīng)答是多特異性的。
表7：用多肽SEQ ID No：23刺激的HLA-B7健康供體PBMC的培養(yǎng)物，irr：無(wú)關(guān)肽，t檢驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果以灰色突出顯示
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Ser Pro Arg Leu Gln Leu Ser Asn Leu Ala Pro Arg Arg Leu Val Gln
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Leu Leu Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Leu Ala Pro Lys His Ser
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35
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<220>
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<220>
<221> 變體
<222> (10)..(12)
<223> X = 任何氨基酸或不存在
<220>
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<220>
<221> 變體
<222> (31)..(36)
<223> X = 任何氨基酸或不存在
<400> 24
Ser Pro Arg Leu Gln Leu Ser Asn Leu Xaa Xaa Xaa Ala Pro Arg Arg
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35 40 45