一種腫瘤抗原gpc3的ctl識別表位肽及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種GPC3來源的抗腫瘤CTL表位肽，為九肽，其氨基酸序列為Lys?Val?Phe?Gly?Asn?Phe?Pro?Lys?Leu。本發(fā)明還包括上述肽在制備腫瘤治療性DC?CIK中的應(yīng)用。本發(fā)明所制備的特異性的DC?CIK細(xì)胞對肝癌細(xì)胞Huh?7顯示出一定的殺傷率，可用于制備肝癌特異性自體免疫細(xì)胞的制備。本發(fā)明公開了GPC3來源的抗腫瘤CTL表位肽及用其肽制備腫瘤治療性DC?CIK，對多種GPC3相關(guān)腫瘤的治療具有潛在價值。
【專利說明】
一種腫瘤抗原GPC3的CTL識別表位肽及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及表位肽技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種特異性腫瘤抗原GPC3的CTL識別表位 肽及其應(yīng)用，還涉及一種腫瘤抗原GPC3特異性DC細(xì)胞的制備方法及其應(yīng)用，以及一種腫瘤 抗原GPC3特異性DC-CIK細(xì)胞的制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，GPC3)是一種66kD的細(xì)胞膜蛋白，是硫酸乙酰 肝素蛋白聚糖的成員。GPC3能夠與細(xì)胞外基質(zhì)、多種生長因子、肝素樣結(jié)合蛋白、粘附分子、 蛋白酶等相互作用，參與細(xì)胞粘附、分化、增殖與迀徙等過程。其在成熟組織中低表達(dá)，在中 胚層、多種惡性腫瘤中過表達(dá)，如其在肝癌組織中高表達(dá)，而在正常肝組織不表達(dá)，有可能 是目前發(fā)現(xiàn)在AFP陰性肝癌中表達(dá)率最高的基因。
[0003] 近年來，細(xì)胞免疫治療飛速發(fā)展，成為繼手術(shù)、化療、放療后的第四種腫瘤治療方 法。細(xì)胞免疫治療領(lǐng)域中過繼性細(xì)胞免疫治療是研究的熱點(diǎn)。腫瘤過繼性細(xì)胞免疫治療能 夠調(diào)動機(jī)體免疫功能以達(dá)到消除和控制腫瘤的目的，具有靶向療效明顯、不良反應(yīng)輕微等 優(yōu)點(diǎn)。過繼性細(xì)胞免疫治療包括CIK及DC-CIK等，其中DC-CIK是將CIK細(xì)胞和同源DC細(xì)胞共 培養(yǎng)后即可獲得DC-CIK細(xì)胞，它既可促進(jìn)DC細(xì)胞的成熟，更能促進(jìn)C1K的增殖，并加強(qiáng)其抗 腫瘤活性。DC-CIK表現(xiàn)出更好的靶向性和特異性，具有有效的殺瘤作用。
[0004] 腫瘤治療常用的方法有手術(shù)、放療、化療。半數(shù)以上的腫瘤患者的主要治療手段是 手術(shù)，通過手術(shù)可以治愈大部分早期未擴(kuò)散的腫瘤，但是對多數(shù)中晚期腫瘤患者卻是療效 有限。放射療法也是許多腫瘤治療不可或缺的手段之一，但是其不良反應(yīng)大，只能作為一種 局部療法。對于轉(zhuǎn)移擴(kuò)散或全身性的腫瘤，只能依靠化療和免疫治療。其中，化療對多種腫 瘤療效確切，是臨床腫瘤治療的重要手段，但是其作用缺乏特異性，會在殺瘤同時損傷正常 細(xì)胞，長期使用會產(chǎn)生多種毒副作用。因此，需要更好的腫瘤全身治療手段。
[0005] 免疫細(xì)胞療法是腫瘤治療的新策略，通過從患者外周血腫采集單個核細(xì)胞，經(jīng)體 外培養(yǎng)、增值、特異性抗原處理后，賦予其抗瘤特異性并回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)發(fā)揮抗瘤作用。免 疫細(xì)胞療法主要包括CK、DC-CIK等。DC是功能強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞，CIK是多種細(xì)胞因子誘 導(dǎo)的異質(zhì)性殺傷細(xì)胞群，因此DC-CIK技術(shù)將兩者優(yōu)點(diǎn)有效結(jié)合，具有更好的特異性和靶向 性，可確保高效的免疫反應(yīng)。研究表明，
[0006] DC-CIK細(xì)胞對化療后腫瘤細(xì)胞的生長具有有效的抑制作用，且DC-CIK細(xì)胞不會危 害集體免疫系統(tǒng)功能。在當(dāng)前對腫瘤特異性抗原了解相對較少的情況下，將DC-CIK細(xì)胞作 為一種輔助療法與傳統(tǒng)腫瘤治療方法進(jìn)行聯(lián)合應(yīng)用是個有效可行的策略。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 基于【背景技術(shù)】存在的技術(shù)問題，本發(fā)明目的在于提供一種特異性腫瘤抗原GPC3的 CTL識別表位肽。
[0008] 本發(fā)明目的還在于提供上述特異性腫瘤抗原GPC3的CTL識別表位肽的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明目的還在于提供一種腫瘤抗原GPC3特異性DC細(xì)胞的制備方法。
[0010] 本發(fā)明目的還在于提供一種腫瘤抗原GPC3特異性DC-CIK細(xì)胞的制備方法。
[0011]本發(fā)明目的還在于提供上述腫瘤抗原GPC3特異性DC細(xì)胞和DC-CIK細(xì)胞的應(yīng)用。 [0012]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案：
[0013]本發(fā)明提出的一種特異性腫瘤抗原GPC3的CTL識別表位肽，所述CTL識別表位肽為 九肽，其氨基酸序列如下:Lys-Val-Phe-Gly-Asn-Phe-Pr〇-Lys_Leu。
[0014] 上述特異性腫瘤抗原GPC3的CTL識別表位肽采用固相合成法進(jìn)行合成?；玖鞒?如下：首先將一個氨基被Fmoc基團(tuán)保護(hù)的氨基酸連接在不溶性固相載體Wang樹脂上，然后 脫掉氨基的保護(hù)基，第一個氨基酸即連接至固相載體上;其次將第二個氨基被Fmoc基團(tuán)保 護(hù)的氨基酸的羧基縮合劑活化，活化后的第二個氨基酸羧基再與已接在固相載體的第一個 氨基酸的氨基反應(yīng)形成肽鍵，此時在固相載體上就生成了一個帶有保護(hù)基的二肽。重復(fù)上 述的肽鍵形成反應(yīng)，使肽鏈從C端向N端生長，直至達(dá)到所需要的肽鏈長度，最后切割得到目 的肽，再經(jīng)HPLC純化，其純度大于90%。
[0015] 本發(fā)明還提出的上述特異性腫瘤抗原GPC3的CTL識別表位肽在制備具有GPC3表達(dá) 的腫瘤治療性多肽疫苗的應(yīng)用。
[0016] 優(yōu)選地，上述特異性腫瘤抗原GPC3的CTL識別表位肽在制備肝癌治療性多肽疫苗 中的應(yīng)用，尤其對肝癌細(xì)胞Huh-7具有殺傷力。
[0017] 本發(fā)明還提出的一種腫瘤抗原GPC3特異性DC細(xì)胞的制備方法，采用上述特異性腫 瘤抗原GPC3的CTL識別表位肽加入DC細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)得到。
[0018] 本發(fā)明還提出的上述腫瘤抗原GPC3特異性DC細(xì)胞的制備方法得到的特異性DC細(xì) 胞在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明還提出的一種腫瘤抗原GPC3特異性DC-CIK細(xì)胞的制備方法，采用上述特異 性腫瘤抗原GPC3的CTL識別表位肽進(jìn)行誘導(dǎo)得到。
[0020] 本發(fā)明還提出的上述腫瘤抗原GPC3特異性DC-CIK細(xì)胞的制備方法得到的特異性 DC-CIK細(xì)胞在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。
[0021] 本發(fā)明公開了 GPC3來源的抗腫瘤CTL表位肽及用其肽制備腫瘤治療性DC-CIK，對 多種GPC3相關(guān)腫瘤的治療具有潛在價值。
[0022]本發(fā)明巧妙利用GPC3在肝癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，與肝癌的病理分級明顯正相關(guān)，隨組 織病理分級的升高而增加，因此在肝癌的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。它具有極高的組織器 官特異性，而在正常肝臟組織中表達(dá)很低，從而采用理論和實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法篩選得到腫 瘤相關(guān)抗原的表位肽，所得表位肽未見文獻(xiàn)報道，為研制基于抗原GPC3的腫瘤疫苗或腫瘤 特異性CTL細(xì)胞的制備提供理論基礎(chǔ)，并為后續(xù)多價的抗原肽疫苗構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0023]圖1為本發(fā)明提出的一種特異性腫瘤抗原GPC3的CTL識別表位肽的質(zhì)譜分析圖。 [0024]圖2為本發(fā)明實(shí)施例1所得P1、P2、P3……P20各自誘導(dǎo)得到的特異性CTL細(xì)胞分泌 INF-γ的能力對比圖。
[0025]圖3為本發(fā)明實(shí)施例1所得Ρ4、P6、P15、Ρ16各自誘導(dǎo)得到的特異性CTL細(xì)胞對肝癌 細(xì)胞Huh-7殺傷能力對比圖。
[0026] 圖4為由本發(fā)明提出的一種特異性腫瘤抗原GPC3的CTL識別表位肽所制備得到的 特異性CTL細(xì)胞免疫細(xì)胞群的流式細(xì)胞儀檢測數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面，通過具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0028]實(shí)施例1:合成表位肽
[0029] 采用理論與實(shí)踐相結(jié)合的方法，根據(jù)抗原的一級結(jié)構(gòu)，綜合運(yùn)用免疫信息學(xué)手段， 運(yùn)用SYFPEITHI、B頂AS、NetCTL、WAPP和Epijen綜合對GPC3的抗原CTL表位進(jìn)行預(yù)測分析，選 取評分前20的多肽序列進(jìn)行試驗(yàn)篩選，一次命名為P1、P2、P3......P20。
[0030] 基本流程如下:首先將一個氨基被Fmoc基團(tuán)保護(hù)的氨基酸連接在不溶性固相載體 Wang樹脂上，然后脫掉氨基的保護(hù)基，第一個氨基酸即連接至固相載體上;其次將第二個氨 基被Fmoc基團(tuán)保護(hù)的氨基酸的羧基縮合劑活化，活化后的第二個氨基酸羧基再與已接在固 相載體的第一個氨基酸的氨基反應(yīng)形成肽鍵，此時在固相載體上就生成了一個帶有保護(hù)基 的二肽。重復(fù)上述的肽鍵形成反應(yīng)，使肽鏈從C端向N端生長，直至達(dá)到所需要的肽鏈長度， 最后切割得到目的表位肽粗品。將目的表位肽粗品經(jīng)HPLC純化得到目的表位肽精肽，其純 度大于90%，質(zhì)譜分析證實(shí)其分子量符合理論值。
[0031] 本發(fā)明提出的一種特異性腫瘤抗原GPC3的CTL識別表位肽采用Fmoc固相合成法進(jìn) 行合成，所述CTL識別表位肽為九肽，編號為P15,其氨基酸序列如下：Lys-Val-Phe-Gly-Asn-Phe-Pro-Lys-Leu。對P15進(jìn)行質(zhì)譜分析，其質(zhì)譜分析結(jié)果如圖1所示，可以證實(shí)其分子 量為1049.26g/mol，符合理論值。
[0032]實(shí)施例2:多肽功能檢測
[0033]上述所得P15和其余19個表位肽可用于制備具有GPC3表達(dá)的腫瘤治療性多肽疫 苗，其應(yīng)用實(shí)驗(yàn)如下：
[0034] 1、上述CTL識別表位肽誘導(dǎo)特異性CTL細(xì)胞、IFN- γ分泌及對腫瘤靶細(xì)胞的殺傷實(shí) 驗(yàn)檢測：抽取患者的外周血經(jīng)密度梯度離心分離，獲得PBMCs，添加細(xì)胞因子培養(yǎng)DC細(xì)胞和 CTL細(xì)胞，進(jìn)一步采用DC細(xì)胞負(fù)載本發(fā)明的GPC3表位肽，與CTL共培養(yǎng)刺激特異的CTL擴(kuò)增， 進(jìn)一步在體外采用ELISA和LDH實(shí)驗(yàn)檢測特異的CTL在特異抗原刺激下INF- γ的分泌及對肝 癌細(xì)胞Huh-7的殺傷作用。
[0035]具體方法如下：
[0036] (I)、PBMC的分離與誘導(dǎo)：
[0037] 1)將50mL抗凝處理的外周血，2000rpm離心10min;
[0038] 2)收集上層血漿凍存，用PBS(pH=7.4)稀釋剩下的血細(xì)胞；
[0039] 3)將稀釋的血細(xì)胞加入到等體積的淋巴分離液液面上；
[0040] 4) 20 °C離心20min，關(guān)閉離心機(jī)剎車；
[0041] 5)離心后，分為四層，用吸嘴玻璃滴管吸取白膜層(即第二層）；
[0042] 6)取出的白膜層用PBS洗滌兩遍；
[0043] 7)將細(xì)胞以2~5X106/mL接種到6孔板內(nèi)，2h后，回收未貼壁的細(xì)胞，用預(yù)包被 &拉卜0)3186和&拉丨-0)28186的培養(yǎng)板進(jìn)行激活培養(yǎng)；
[0044] 8)貼壁的細(xì)胞加入GM-CSF和IL-4刺激培養(yǎng)5天誘導(dǎo)成DC細(xì)胞，第三天半換液；
[0045] 9)第5天，收集DC細(xì)胞，將10yg實(shí)施例1所得目的表位肽精肽加入DC細(xì)胞中，lh后， 將DC細(xì)胞與激活的T細(xì)胞共培養(yǎng)，同時加入IL2及IL-15;
[0046] 10)繼續(xù)培養(yǎng)5天后，得到抗原特異的CTL細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞因子分泌及對腫瘤細(xì)胞的 殺傷實(shí)驗(yàn)。
[0047] (11 )、IFN-γ 細(xì)胞因子分泌檢測：Human IFN-gamma Platinum ELISA( IFN-γ ELISA檢測試劑盒，eBioscience公司)檢測CTL細(xì)胞分泌的IFN-γ，步驟如下：
[0048] 1)將CTL細(xì)胞去除細(xì)胞因子培養(yǎng)24h后，接種到96孔板內(nèi)；
[0049] 2)細(xì)胞中加入刺激對應(yīng)的多肽再次刺激24h后，離心去除細(xì)胞，收集細(xì)胞上清；
[0050] 3)采用ELISA檢測上清中IFN- γ的表達(dá)，選擇IFN- γ分泌較多的CTL表位肽進(jìn)行殺 傷實(shí)驗(yàn)。
[0051] 結(jié)果如圖2所示，Ρ15和Ρ4、Ρ6、Ρ16負(fù)載的DC細(xì)胞均能夠較好誘導(dǎo)出特異性CTL細(xì) 胞，分泌較高量的IFN-γ。
[0052] (III)、腫瘤細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)：采用乳酸脫氫酶（LDH)釋放檢測法，使用CytoTox 96Non_Radioactive Cytotoxicity Assay(細(xì)胞毒性檢測試劑盒，Promega公司）進(jìn)行LDH試 驗(yàn)檢測細(xì)胞殺傷能力。步驟如下：
[0053] 1)設(shè)立檢測培養(yǎng)板(100μL孔）
[0054] a.設(shè)立實(shí)驗(yàn)組：以GPC3陽性表達(dá)的肝癌細(xì)胞Huh-7為靶細(xì)胞，按效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞 比為5:1、10:1、20:1加入上述特性CTL細(xì)胞
[0055] b.設(shè)立效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放組 [0056] c.設(shè)立靶細(xì)胞自發(fā)釋放組 [0057] d.設(shè)立靶細(xì)胞最大釋放組 [0058] e.設(shè)立背景對照組
[0059] 2)細(xì)胞裂解及收獲上清
[0060] &.371：5%0)2共培養(yǎng)511
[00611 b.靶細(xì)胞最大釋放組中加入裂解液，45min后，所有的孔，250g/min離心收集上清 [0062] 3)LDH 檢測
[0063] a.轉(zhuǎn)移50yL上清至另一個96孔板
[0064] b.每孔加入50yL稀釋的底物混合物，室溫避光孵育30min
[0065] c.每孔添加50yL終止液
[0066] d.在490nm下檢測吸光值0D [0067]細(xì)胞殺傷率計算公式如下：
[0068] 殺傷率（％ ) = [ (0D孅且-0D效獅6酸:輸齟-0Df_a自發(fā)稀齟)/(0D_mt稀齟-0D__發(fā)輸齟)] X100%
[0069 ]結(jié)果如圖3所示，圖3為本發(fā)明實(shí)施例1所得P4、P6、P15、P16各自誘導(dǎo)得到的特異性 CTL細(xì)胞對肝癌細(xì)胞Huh-7殺傷能力對比圖；由圖3可知，P15誘導(dǎo)的CTL細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞Huh-7殺傷效果最好。
[0070] 2、采用流式分析獲得的特異CTL中各種免疫細(xì)胞所占的百分比，結(jié)果如圖4所示。 由圖4可知，本發(fā)明由P15制備獲得的免疫細(xì)胞群中含有大量的CTL細(xì)胞，同時也含有一定比 例的NKT細(xì)胞，即該免疫細(xì)胞群具有較好的免疫活性，具有強(qiáng)大的殺傷特定腫瘤細(xì)胞的能 力。
[0071]以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實(shí)施方式】，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此， 任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其 發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種特異性腫瘤抗原GPC3的CTL識別表位肽，其特征在于，所述CTL識別表位肽為九 肽，其氨基酸序列為 Lys-Val-Phe-Gly-Asn-Phe-Pro-Lys-Leu。2. 權(quán)利要求1所述特異性腫瘤抗原GPC3的CTL識別表位肽在制備具有GPC3表達(dá)的腫瘤 治療性多肽疫苗的應(yīng)用。3. 權(quán)利要求1所述特異性腫瘤抗原GPC3的CTL識別表位肽在制備肝癌治療性多肽疫苗 中的應(yīng)用。4. 一種腫瘤抗原GPC3特異性DC細(xì)胞的制備方法，其特征在于，采用如權(quán)利要求1所述特 異性腫瘤抗原GPC3的CTL識別表位肽加入DC細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)得到。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述腫瘤抗原GPC3特異性DC細(xì)胞的制備方法得到的特異性DC細(xì)胞在 制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。6. -種腫瘤抗原GPC3特異性DC-CIK細(xì)胞的制備方法，其特征在于，采用如權(quán)利要求1所 述特異性腫瘤抗原GPC3的CTL識別表位肽進(jìn)行誘導(dǎo)得到。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述腫瘤抗原GPC3特異性DC-CIK細(xì)胞的制備方法得到的特異性DC-CIK細(xì)胞在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K35/15GK106008692SQ201610483210
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月24日
【發(fā)明人】唐奇, 馮振卿, 許國貞, 劉振云, 朱進(jìn), 趙薇
【申請人】安徽未名細(xì)胞治療有限公司