本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種外泌體dicer蛋白及其應(yīng)用，具體地為一種可用于肺癌早期檢測及術(shù)后監(jiān)測的以外泌體dicer蛋白為腫瘤標(biāo)志物的elisa(酶聯(lián)免疫吸附測定法)試劑盒的制備及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：近年來，肺癌成為威脅人類健康的主要惡性腫瘤之一，其死亡率居惡性腫瘤首位，且發(fā)病率逐年增高。肺癌的5年存活率僅為13%，80%的患者在診斷后1年內(nèi)死亡。肺癌的早期診斷率僅15%，但這些患者的5年存活率可達(dá)60%～90%。以上可見，診斷肺癌、控制肺癌是擺在醫(yī)務(wù)工作者面前緊迫而艱巨的任務(wù)。臨床上傳統(tǒng)的肺癌診斷方法有胸部x線片、支氣管鏡檢查、痰液細(xì)胞涂片等，因其癥狀、體征均無特異性，與其它肺部疾病，如肺炎，肺結(jié)核等病難以鑒別。因其特異度和靈敏度有限，大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已是晚期。腫瘤標(biāo)志物相比于其他傳統(tǒng)診斷方法具有更高的特異度和靈敏度，也越來越得到廣泛應(yīng)用。隨著腫瘤病理學(xué)、分子生物學(xué)研究的進(jìn)展，血漿腫瘤標(biāo)志物的研究與篩選成為肺癌早期診斷的研究熱點。理想的腫瘤標(biāo)志物應(yīng)該是敏感性高，特異性強，表達(dá)量或血漿中水平與腫瘤組織擴散或腫塊大小成正相關(guān)。目前臨床常用的肺癌腫瘤標(biāo)志物包括：cea（癌胚抗原）、cyfra21-1（細(xì)胞角蛋白19的可溶性片段）、scc（鱗狀細(xì)胞癌抗原）、nse（神經(jīng)元特異性烯醇化酶）和progrp（胃泌素釋放肽前體）。癌胚抗原cea是一種具有人類胚胎抗原決定簇的酸性糖蛋白，它是一種腫瘤相關(guān)抗原，存在于多種腫瘤組織中，其在肺腺癌中有較高的診斷價值，特異性在90%以上時，敏感性可達(dá)50%-70%，也是臨床上應(yīng)用最為廣泛的一種。由于肺癌發(fā)病機理較復(fù)雜，致病的分子生物學(xué)基礎(chǔ)因個體差異也表現(xiàn)出多樣性，這也使得單一的分子標(biāo)記物并不能有效指示肺癌發(fā)病的早期差異或者預(yù)后的個體特征。因此發(fā)現(xiàn)并開發(fā)能兼顧敏感性和特異性的血漿腫瘤標(biāo)志物，應(yīng)用于肺癌的臨床檢測，以期達(dá)到肺癌早期診斷、術(shù)后監(jiān)測及預(yù)后評估的目在肺癌的臨床應(yīng)用中顯得十分必要。外泌體(exosome)在30年前被人們所發(fā)現(xiàn)。外泌體是直徑約為30-150nm，密度在1.13-1.21g/ml的小囊泡。外泌體天然存在于體液中，包括血液、唾液、尿液和母乳，是活細(xì)胞分泌的來源于晚期核內(nèi)體(也稱為多囊泡體)的膜性囊泡。外泌體中攜帶有母細(xì)胞的多種蛋白質(zhì)、脂類、dna和rna等重要信息。而不同組織細(xì)胞來源外泌體由于攜帶的蛋白質(zhì)不同，則能夠發(fā)揮不同的生物學(xué)功能。外泌體通過與受體細(xì)胞相融在細(xì)胞間通信過程中起關(guān)鍵作用。因此這些外泌體內(nèi)的蛋白及rna等被證實對于多種生理學(xué)事件均發(fā)揮了巨大的調(diào)控作用，被認(rèn)為是潛在的生物標(biāo)志物或治療試劑。酶聯(lián)接免疫吸附劑測定(enzyme-linkedimmunosorbentassay，簡稱elisa)是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術(shù)。它是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行的技術(shù)。該技術(shù)可用于檢測大分子抗原和特異性抗體等，具有快速、靈敏、簡便、載體易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點。同時，由于elisa的技術(shù)條件要求低、攜帶方便、常以試劑盒的形式出現(xiàn)且易商品化、操作簡便和經(jīng)濟實惠，已成為一種應(yīng)用最為廣泛和發(fā)展最為成熟的生物檢測與分析技術(shù)?；趀lisa的雙抗體夾心法是檢測抗原的最常用的方法。dicer酶是一種核糖核酸內(nèi)切酶，屬于rnaseiii家族中特異識別雙鏈rna的一員。dicer蛋白有著較多的結(jié)構(gòu)域，包含一個rna解旋酶基序如位于氨基端的dexh盒子，和一個位于羧基端的rnase基序。它最先在果蠅中發(fā)現(xiàn)，并且在不同的生物體上表現(xiàn)出很高的保守性。編碼人類dicer蛋白的基因定位于染色體14q32.13。dicer蛋白在大腦、心臟、肝臟、肺、胰腺、腎臟及胎盤等器官中均廣泛表達(dá)，并且在rna干擾通路中發(fā)揮作用。它能以一種atp依賴的方式逐步切割包括mirna前體等各種方式引入的雙鏈rna，切割將rna降解為19-21bp的雙鏈rnas(dsrnas)，每個片段的3’端都有2個堿基突出。單鏈mirna前體經(jīng)過dicer加工后可成熟為長度為20-24個核苷酸的mirna。dicer蛋白位于哺乳動物的細(xì)胞質(zhì)中，通常它與鈣網(wǎng)蛋白共定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。dicer蛋白的分子大小為218kda。隨著研究對于外泌體及其所分泌蛋白和rna等的深入，外泌體在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、惡性轉(zhuǎn)化等過程中的機制也越來越清楚。研究表明腫瘤細(xì)胞的外泌體與正常細(xì)胞的外泌體之間存在差異，腫瘤的外泌體會促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，同時腫瘤分泌的外泌體可以改變周圍的細(xì)胞，使其成為腫瘤細(xì)胞并促進(jìn)腫瘤的生長。發(fā)明人前期的研究顯示腫瘤患者外泌體中的成熟mirna水平較正常人明顯上升，同時同一患者外泌體中的mirna前體則隨著時間而不斷下降，這提示了外泌體中存在的mirna成熟所需要的關(guān)鍵蛋白。隨后的一些列實驗證實癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化依賴于dicer蛋白，腫瘤外泌體含有dicer等相應(yīng)蛋白質(zhì)，能夠加工mirna前體使其成熟為相應(yīng)的mirna，從而改變腫瘤細(xì)胞周圍的細(xì)胞將其轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞。這樣一來，dicer蛋白就可作為一個標(biāo)記物指示腫瘤細(xì)胞的存在，或作為治療癌癥的靶標(biāo)。因此，建立外泌體dicer的elisa檢測方法，建議以外泌體dicer為標(biāo)志物的腫瘤檢測體系對于基礎(chǔ)研究和腫瘤的臨床醫(yī)學(xué)檢測等都有重要的應(yīng)用價值。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種外泌體dicer蛋白，不僅首次證實了外泌體中dicer蛋白的存在，并發(fā)現(xiàn)該分泌型dicer蛋白在正常人和腫瘤患者血漿中的表達(dá)有顯著差異，尤其在肺癌晚期患者血漿中明顯升高，并與肺癌患者腫瘤負(fù)荷呈顯著正相關(guān)，因此能作為一種理想的血漿學(xué)標(biāo)記物用于肺癌患者的術(shù)前診斷、術(shù)后治療效果評估及隨訪監(jiān)測，更進(jìn)一步提供了一種以外泌體dicer蛋白為新型腫瘤標(biāo)志物的試劑盒，為便捷快速無創(chuàng)式的肺癌體外診斷提供了有效的工具。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：一種外泌體dicer蛋白，所述外泌體dicer蛋白與胞內(nèi)的dier蛋白序列特征一致(genebank索取號為aai50288.1)，包含于外泌體中，且能在血漿外泌體中被穩(wěn)定檢測到。本發(fā)明通過elisa技術(shù)、western-blot檢測及qrt-pcr等多方面證明人血漿中外泌體dicer蛋白的存在，并確定其大小為218kd，與胞內(nèi)的dicer蛋白大小一致；此外，在肺癌患者血漿中發(fā)明人發(fā)現(xiàn)該外泌體dicer蛋白濃度升高，而且具有非常高的敏感性和特異性，外泌體dicer蛋白在很多方面表現(xiàn)出與腫瘤發(fā)生相關(guān)的活性，包括促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移，抗腫瘤細(xì)胞凋亡和藥物作用等。至此，發(fā)明人首次證實了該外泌體dicer蛋白在癌癥患者血漿中特異性差異性表達(dá)。在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，更進(jìn)一步地，上述的外泌體dicer蛋白作為腫瘤標(biāo)志物的應(yīng)用。上述的外泌體dicer蛋白作為腫瘤標(biāo)志物在肺癌術(shù)前檢測及術(shù)后監(jiān)測中的應(yīng)用?；谏鲜黾夹g(shù)方案，本發(fā)明提供一種以外泌體dicer蛋白為腫瘤標(biāo)志物的檢測試劑盒，包括：包被到酶標(biāo)板上的山羊抗人dicer多克隆抗體、檢測抗體為小鼠抗人dicer單克隆抗體、鏈霉親和素-辣根過氧化物酶標(biāo)記的驢抗小鼠igg多克隆抗體和標(biāo)準(zhǔn)品，所述標(biāo)準(zhǔn)品為dicer人重組蛋白，所述dicer人重組蛋白包含ncbigenebank索取號為aai50288.1所示的氨基酸序列，優(yōu)選地，所述dicer人重組蛋白就是由ncbigenebank索取號為aai50288.1所示的氨基酸組成。利用上述試劑盒能通過檢測人血漿中外泌體dicer蛋白的濃度從而協(xié)助診斷及隨訪肺癌患者，為體外診斷肺癌提供了另一種高效無創(chuàng)的工具。本發(fā)明所述的外泌體dicer蛋白等同于分泌型dicer蛋白，是指包含于血漿外泌體之中，能夠被包括下述試劑盒等方法穩(wěn)定檢測或定量的dicer蛋白。具體而言，本發(fā)明所述的上述試劑盒是用于檢測血漿中外泌體dicer蛋白的elisa試劑盒，其包被一種山羊抗人dicer多克隆抗體，通過包被的dicer抗體捕獲血漿中的外泌體dicer蛋白，用小鼠抗人dicer單克隆抗體檢測外泌體dicer蛋白的含量。本發(fā)明所述的試劑盒的檢測原理采用雙抗體夾心法elisa。本發(fā)明所述的試劑盒的檢測對象為外泌體中表達(dá)dicer蛋白的腫瘤，所述外泌體中表達(dá)dicer的腫瘤包括肺癌、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌和膀胱癌等，所述腫瘤優(yōu)選為肺癌。本發(fā)明所述的試劑盒用于肺癌的早期診斷、監(jiān)測治療效果和預(yù)后隨訪。在本發(fā)明所述的試劑盒中，所述包被抗體的工作濃度為4ug/ml所述檢測抗體的工作濃度為0.4ug/ml，所述酶聯(lián)抗體的工作濃度為1ug/ml。本發(fā)明所述的試劑盒具有良好的特異性、敏感性和穩(wěn)定性。本發(fā)明所述試劑盒的具體的優(yōu)點在于：(1)引入一種新的肺癌分子標(biāo)志物外泌體dicer蛋白，通過檢測該標(biāo)志物，可以協(xié)助肺癌患者的臨床診斷，進(jìn)一步判斷患者預(yù)后情況，指導(dǎo)治療；同時，作為肺癌的一個獨立預(yù)后因子，該標(biāo)志物也可能成為治療新靶點。(2)該標(biāo)志物的檢測只需抽血便可進(jìn)行，為無侵入式液體活檢，且可以隨時檢測，有利于監(jiān)測病情。(3)elisa檢測技術(shù)在臨床應(yīng)用已經(jīng)比較成熟，且簡單方便，成本低廉，適合臨床檢測。進(jìn)一步，所述包被到酶標(biāo)板上的山羊抗人dicer多克隆抗體，母液濃度為0.2mg/ml，稀釋50倍后的工作液的濃度為4ug/ml；1)檢測抗體為小鼠抗人dicer單克隆抗體，母液的濃度為0.2mg/ml，利用生物素標(biāo)記后(生物素標(biāo)記試劑盒購自日本同仁，型號為lk03，具體標(biāo)記方法及實施步驟參照該產(chǎn)品說明書)，使用時，稀釋500倍得到的工作液濃度為0.4ug/ml；2)鏈霉親和素-辣根過氧化物酶標(biāo)記的驢抗小鼠igg多克隆抗體(即streptavidin-hrpigg)，母液的濃度為0.5mg/ml；3)標(biāo)準(zhǔn)品為dicer人重組蛋白，所述dicer人重組蛋白包含ncbigenebank索取號為aai50288.1所示的氨基酸序列，優(yōu)選地，所述dicer人重組蛋白就是由ncbigenebank索取號為aai50288.1所示的氨基酸組成。其由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，其合成方法為在昆蟲細(xì)胞sf9中真核表達(dá)并經(jīng)過親和純化，母液的濃度為100ng/ul。采用上述進(jìn)一步方案的有益效果是：在本發(fā)明所述的試劑盒中，所述包被抗體的工作濃度為4ug/ml，所述檢測抗體的工作濃度為0.4ug/ml，所述酶聯(lián)抗體的工作濃度為1ug/ml，進(jìn)一步保證了本發(fā)明所述的試劑盒具有良好的特異性、敏感性、穩(wěn)定性以及使用時的便利性。進(jìn)一步，還包括包被緩沖液、洗滌液、封閉液、加樣緩沖液、顯色液、反應(yīng)終止液。進(jìn)一步，所述包被緩沖液為磷酸鹽緩沖液(pbs)，其成分為140mmnacl、2.7mmkcl、10mmna2hpo4、1.8mmkh2po4，ph值為7.4；所述洗滌液為添加了體積分?jǐn)?shù)為0.05％的tween-20的包被緩沖液；所述封閉液為含有體積分?jǐn)?shù)為1％的牛血漿白蛋白的包被緩沖液；所述加樣緩沖液的成分為50mmtris-hcl、0.5mkcl、體積分?jǐn)?shù)為1％的牛血漿白蛋白、體積分?jǐn)?shù)0.05％的tween-20，ph值為8.4；所述反應(yīng)終止液的成分為2mh2so4。本發(fā)明所用術(shù)語″工作濃度″是指在進(jìn)行檢測時所使用的試劑例如抗體的濃度。本發(fā)明所述的以分泌型dicer蛋白為腫瘤標(biāo)志物的試劑盒在使用時，包括以下步驟：1.按照血液血漿操作規(guī)范，收集分離血漿樣本，包括正常人和患者的血漿樣本(包括肺部良性病變和肺癌患者的血漿樣本)；2.分離血漿中的外泌體，提取外泌體中的總蛋白；3.雙抗夾心法elisa實驗，由96孔酶標(biāo)板多克隆抗體包被；單克隆抗體檢測外泌體dicer蛋白；計算血漿中外泌體dicer蛋白的含量等先后步驟完成。優(yōu)選地，步驟1的具體操作為：1）在真空采血管中收集2ml正常人或者肺癌患者的外周全血，4°c存放或者-80°c凍存；2）凍存的全血在冰上完全凍融，在4°c條件下，2000rpm離心20分鐘；3）小心將上層透亮澄清的液體轉(zhuǎn)移到另一個干凈的離心管中，繼續(xù)到下步操作或者-80°c凍存；4）以上操作過程中需注意潔凈環(huán)境，同時需要佩戴手套及口罩等，注意操作人員的安全操作。優(yōu)選地，步驟2的具體操作為：1）血漿外泌體的分離與純化2）完全凍融狀態(tài)的血漿在4°c下2000*g離心20分鐘，除去細(xì)胞和細(xì)胞碎片；3）取上清移至新的離心管，4°c條件下16500*g離心30分鐘，進(jìn)一步除去細(xì)胞碎片；4）取上層液體轉(zhuǎn)移到離心管，加入0.5倍體積的磷酸鹽緩沖液（pbs），渦旋混勻；5）在溶液中加入0.05倍血漿起始體積的蛋白酶k，優(yōu)選地，500ul起始體積的血漿需要加入25ul蛋白酶k；6）混勻樣本，在37°c條件下孵育10分鐘；7）將樣本經(jīng)過0.22um一次性過濾器，去除大的囊泡，收集清液；8）將收集的清液在110000*g下離心70分鐘，棄上清，再加入5mlpbs溶液清洗沉淀，110000*g再次離心70分鐘，棄除上清；9）用100ul外泌體重懸溶液（pbs）重懸全部沉淀，-20℃保存。10）外泌體總蛋白的提取11）在冰上將外泌體溶液及外泌體蛋白裂解液融化；12）在25ul重懸后的外泌體溶液中加入等體積的外泌體蛋白裂解液，通過移液器上下吹吸混勻樣本；13）在冰上孵育30分鐘，每隔10分鐘顛倒離心管不斷混勻樣本；14）在4°c條件下，14,000*g離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上清液到干凈的離心管中，并置于冰上；15）測量蛋白濃度，優(yōu)選地，將蛋白樣本稀釋200倍后通過bca法測定波長562nm的吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線而換算其濃度；16）蛋白樣本存放于-80°c，或直接用于下游分析。優(yōu)選地，步驟3的具體操作為：1)在酶標(biāo)板中加入包被緩沖液(pbs)稀釋50倍的山羊抗人dicer多克隆抗體，每孔100ul，4℃包被24小時；棄去孔中液體，在干凈的吸水紙上拍干，并用洗滌液洗滌三次，每次5分鐘；2)每孔加入200ul封閉液，37℃封閉2小時；棄去孔中液體，在干凈的吸水紙上拍干，并用洗滌液洗滌三次，每次5分鐘；3)將標(biāo)準(zhǔn)品(濃度分別為0ng/ml、0.78125ng/ml、1.5625ng/ml、3.125ng/ml、6.25ng/ml、12.5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml)分別加入步驟4)處理的孔中，每孔加入100ul，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；4)將待測蛋白樣品分別加入步驟3)處理的孔中，每孔加入100ul；加蓋封口膜，置于37℃孵育2小時，用于檢測待測樣品；5)將步驟3)和步驟4)孔中的液體棄去，在干凈的吸水紙上拍干，并用洗滌液洗滌三次，每次5分鐘；6)向步驟5)的孔中，每孔分別加入利用加樣緩沖液稀釋500倍的生物素標(biāo)記的小鼠抗人dicer單克隆抗體(濃度為0.4ug/ml)，每孔加入100ul，37℃反應(yīng)2h，加蓋封口膜；棄去孔中液體，在干凈的吸水紙上拍干，并用洗滌液洗滌三次，每次5分鐘；7)每孔分別加入100ul的streptavidin-hrpigg(濃度為0.5mg/ml)，加蓋封口膜，37℃避光反應(yīng)20min；8)每孔加入100ul顯色液tmb，室溫反應(yīng)10-30min；9)每孔加入50ul2mh2so4終止反應(yīng)；10)在酶標(biāo)儀中測定od450和od570值；11)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品測定的od450-570值(即利用od450測的數(shù)值減去od570測得的數(shù)值)，利用統(tǒng)計學(xué)繪圖軟件根據(jù)測定的值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為待測樣品中外泌體dicer蛋白的濃度，縱坐標(biāo)為od450-570值；12)通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和未知濃度樣品的od450-570值計算待檢樣品中外泌體dicer蛋白的濃度。附圖說明圖1為肺癌患者血漿外泌體內(nèi)mirna前體及其成熟mirna在室溫孵育不同時間時的相對表達(dá)情況。圖1a顯示外泌體內(nèi)mirna前體在孵育24小時和72小時后的相對表達(dá)變化情況；圖1b顯示外泌體內(nèi)成熟mirna在孵育24小時和72小時后的相對表達(dá)變化情況。圖2westemblotting方法檢測肺癌患者和健康個體血漿外泌體中dicer蛋白表達(dá)情況。圖3為血漿外泌體dicer蛋白的檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖4elisa試劑盒檢測外泌體dicer蛋白的靈敏度和特異度。圖5為根據(jù)公式計算出腫瘤患者、肺部良性疾病患者和健康個體的血漿外泌體dicer蛋白濃度比較。具體實施方式以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。實施例1血漿樣本的收集，血漿中外泌體的分離及其內(nèi)含總蛋白的提取發(fā)明人于2015年5月至11月期間先后在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院收集了三批肺癌患者（258例，病理特征見表1），肺部良性疾病（41例）和健康個體（110例）的外周血樣本(不同批次樣本的收集、預(yù)處理、分裝、保存條件等均保持一致)，通過離心的方法分別分離了相應(yīng)個體的血漿樣本。從血漿中分離外泌體的具體操作為1）完全凍融狀態(tài)的血漿在4°c下2000*g離心20分鐘，除去細(xì)胞和細(xì)胞碎片；2）取上清移至新的離心管，4°c條件下16500*g離心30分鐘，進(jìn)一步除去細(xì)胞碎片；3）取上層液體轉(zhuǎn)移到離心管，加入0.5倍體積的磷酸鹽緩沖液（pbs），渦旋混勻；4）在溶液中加入0.05倍血漿起始體積的蛋白酶k溶液，如500ul起始體積的血漿加入25ul蛋白酶k；5）混勻樣本，在37°c條件下孵育10分鐘；6）將樣本經(jīng)過0.22um一次性過濾器，去除大的囊泡，收集清液；7）將收集的清液在110000*g下離心70分鐘，棄上清，再加入5mlpbs溶液清洗沉淀，110000*g再次離心70分鐘，棄除上清；8）用100ul外泌體重懸溶液（pbs）重懸全部沉淀，-20℃保存。從血漿外泌體中提取總蛋白的操作：1）在冰上將外泌體溶液及外泌體蛋白裂解液融化；2）在100ul重懸后的外泌體溶液中加入等體積的外泌體裂解液，通過移液器上下吹吸混勻樣本；3）在冰上孵育30分鐘，每隔10分鐘顛倒離心管不斷混勻樣本；4）在4°c條件下，14,000*g離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上清液到干凈的離心管中，并置于冰上；5）測量蛋白濃度，優(yōu)選地，將蛋白樣本稀釋200倍后通過bca法測定波長562nm的吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線而換算其濃度；6）蛋白樣本存放于-80°c，或直接用于下游分析。表1肺癌患者的病理分類實施例2：肺癌血漿外泌體室溫孵育實驗，檢測mirna及其前體的表達(dá)量參照實施例1的具體實施方法分離血漿中的外泌體，通過將3-5管肺癌或健康人的外泌體樣本混合再分裝的方法來獲取等量等質(zhì)的外泌體樣本。隨后，分別取健康個體和肺癌患者相應(yīng)的外泌體樣本在室溫條件下不添加其他任何化合物的情況下分別放置24h和72h，隨后通過trizol法提取其中的總rna。在25ul外泌體重懸液中加入1mltrizol溶液（invitrogen），用力渦旋振蕩后室溫靜置5分鐘，隨后加入200ul氯仿溶液，上下振蕩離心管至均一狀態(tài)，室溫靜置3分鐘后在4℃條件下12000rpm高速離心15min。吸取上層水相到新的離心管中，加入等體積的預(yù)冷異丙醇，充分顛倒混勻后，再在-20℃條件下靜置2個小時以上。4℃條件下，12000rpm高速離心15min后小心棄掉上清液，加入1ml預(yù)冷的75％乙醇洗滌沉淀，再在4℃下7500rpm離心5min，棄去液體，室溫下放置5min以充分晾干沉淀，最后5ul加入不含rnase的無菌水溶解沉淀。使用nanodrop2000紫外分光光度計測量rna純度及濃度，樣品可凍存于-80℃。所提取的總rna通過multiscribe反轉(zhuǎn)錄酶（appliedbiosystems）和oligo-d(t)而逆轉(zhuǎn)錄為cdna。具體的，150ng的總rna通過使用如表2所示的引物及superscriptiiiplatinum一步法rt-qpcr試劑盒（invitrogen）來反轉(zhuǎn)錄mirna前體的cdna；而10ng的rna與含有特定的mirna引物taqmanmicrorna反轉(zhuǎn)錄試劑盒(appliedbiosystems)試劑混合，然后按照廠商的操作指示來完成反轉(zhuǎn)錄。以上反映按照16°c孵育30分鐘，42°c孵育30分鐘，85°c孵育5分鐘的先后順序進(jìn)行。實時熒光定量pcr在abisteponeplus定量pcr儀(appliedbiosystems)上進(jìn)行，使用sybrgreenmastermix(appliedbiosystems)和β-actin作為參照來進(jìn)行mirna前體的定量；使用商業(yè)化的assay-on-demand(appliedbiosystems)用于每個mirna的研究。mirna的表達(dá)通過rnu6b的表達(dá)來進(jìn)行歸一化。每一組都進(jìn)行三次重復(fù)。通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，δδct法進(jìn)行相對定量。不同來源的外泌體內(nèi)mirna及其前體在相應(yīng)條件下的相對表達(dá)量如圖1所示。圖1a顯示的是外泌體在室溫放置24小時和放置72小時的情況下，其中mirna前體的相對表達(dá)量變化情況?？梢娤噍^于健康個體的相對穩(wěn)定的表達(dá)，肺癌患者血漿外泌體中的mirna前體在室溫孵育了72小時之后有了較明顯的下降。圖1b顯示的則是外泌體中mirna在不同時間點的相對表達(dá)情況，與其前體的變化趨勢相反，相應(yīng)的成熟mirna的表達(dá)在放置了72小時之后了有了大幅的提升。這中相反的變化趨勢也提示了潛在的由前體向成熟mirna轉(zhuǎn)化的過程。表2靶標(biāo)引物序列hsa-actinf:5’catgtacgttgctatccaggc3’hsa-actinr:5’ctccttaatgtcacgcacgat3’pre-mir-10a,bf:5’taccctgtagatccgaatttgtg3’pre-mir-10a,br:5’attcccctagatacgaatttgtga3’pre-mir-21f:5’gcttatcagactgatgttgactg3’pre-mir-21r:5’cagcccatcgactggtg3’實施例3：驗證血漿外泌體dicer蛋白的存在步驟1按照實例1中的方法分離肺癌患者及正常健康個體血漿中的外泌體及其中的總蛋白，并用bca法測定562nm波長下的吸光光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度，蛋白定量為30ug后置于-80℃?zhèn)溆?，得到血漿來源的外泌體總蛋白。步驟2用容積為75cm的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)atcc來源293t細(xì)胞，待細(xì)胞達(dá)到70％融合度時換成10ml無血漿1640培養(yǎng)基(購自gibico公司)培養(yǎng)24小時。收取5瓶上清約50ml，利用低溫凍干機凍干成粉末狀后，加入5ml細(xì)胞裂解液(購自康為世紀(jì)，貨號為cw0889)。溶解后，用bca法測定562nm波長下的吸光光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度，蛋白定量為30ug后置于-80℃?zhèn)溆茫玫脚囵B(yǎng)細(xì)胞來源的外泌體總蛋白。步驟3按照步驟2的提示培養(yǎng)細(xì)胞，取一瓶離心收集的細(xì)胞，加入1ml細(xì)胞裂解液，充分裂解后，4°c條件下高速離心10分鐘，收集上清，用bca法測定并計算蛋白濃度，蛋白定量為30ug后置于-80℃?zhèn)溆?，得到?xì)胞來源的胞內(nèi)總蛋白作為陽性對照。步驟4分別將步驟1得到的30ug肺癌患者及健康個體血漿外泌體總蛋白樣品，步驟2得到的30ug上清中的外泌體總蛋白以及步驟3得到的30ug胞內(nèi)總蛋白分別置于2×sds樣品上樣緩沖液中，100℃同時變性5分鐘，順序加樣到10％的sds-page凝膠中，通過10％的sds-page分離，采用濕氏電轉(zhuǎn)儀(bio-rad)恒流350ma冰浴轉(zhuǎn)膜1h20min轉(zhuǎn)到0.2mm的pvdf膜，質(zhì)量體積比5％脫脂牛奶37℃封閉1小時，加一抗多克隆抗體anti-dicer(將原液按照體積比稀釋400倍，原液為購自santacruzbiotechnology,inc.的多克隆抗體，貨號為sc-34601)孵育過夜；加二抗(原液為donkeyantigoatigg-hrp，工作液的濃度是將原液按照體積比稀釋1000倍，購自proteintech，usa)，室溫下孵育1小時，化學(xué)發(fā)光(supersignalwestpicochemiluscentsubstrate，34080，pierce)，根據(jù)試劑盒的說明書進(jìn)行顯影、定影，利用上述westernblotting方法分別檢測人血漿中外泌體總蛋白(即步驟1得到的蛋白)和培養(yǎng)人293t細(xì)胞的外泌體中dicer蛋白(即步驟2得到的蛋白)及胞內(nèi)dicer蛋白(即步驟3得到的蛋白)的結(jié)果見圖2。實施例4構(gòu)建以外泌體dicer蛋白為腫瘤標(biāo)志物的檢測試劑盒以外泌體dicer蛋白為腫瘤標(biāo)志物的試劑盒為elisa檢測試劑盒，包括：血漿總外泌體重懸液、蛋白酶溶液、外泌體裂解液、包被到酶標(biāo)板上的山羊抗人dicer多克隆抗體、檢測抗體為小鼠抗人dicer單克隆抗體、鏈霉親和素-辣根過氧化物酶標(biāo)記的驢抗小鼠igg多克隆抗體、標(biāo)準(zhǔn)品、包被緩沖液、洗滌液、封閉液、加樣緩沖液、顯色液、反應(yīng)終止液。1）血漿總外泌體重懸液為磷酸鹽緩沖液，其成分為140mmnacl、2.7mmkcl、10mmna2hpo4、1.8mmkh2po4，ph值為7.4；2）蛋白酶溶液為蛋白酶k，其濃度為20mg/ml；3）外泌體裂解液，其成分為50mmtris-hcl(ph7.5)、150mmnacl、質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的np-40、5mmedta、1mm礬酸鈉、1mmpmsf、10μg/ml抑肽酶、10μg/ml亮肽素，礬酸鈉、pmsf、抑肽酶、亮肽素等在臨用前加入。4)標(biāo)準(zhǔn)品為dicer人重組蛋白，其氨基酸序列為ncbigenebank索取號為aai50288.1所示的序列，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，其合成方法為在昆蟲細(xì)胞sf9中真核表達(dá)并經(jīng)過親和純化，母液的濃度為100ng/ul。5)包被到酶標(biāo)板上的山羊抗人dicer多克隆抗體，購自santacruzbiotechnology,inc.，目錄號為sc-34601，母液濃度為0.2mg/ml，利用pbs稀釋50倍后的工作液的濃度為4ug/ml。6)檢測抗體為小鼠抗人dicer單克隆抗體，購自santacruzbiotechnology,inc.，目錄號為sc-136981，母液的濃度為0.2mg/ml，利用生物素標(biāo)記后，使用時，將生物素標(biāo)記的小鼠抗人dicer單克隆抗體稀釋500倍得到的工作液濃度為0.4ug/ml。7)鏈霉親和素-辣根過氧化物酶標(biāo)記的驢抗小鼠igg多克隆抗體(即streptavidin-hrpigg)，購自r&dsystems，catalog#dy998，母液的濃度為0.5mg/ml。8)包被緩沖液為磷酸鹽緩沖液(即pbs)，其成分為140mmnacl、2.7mmkcl、10mmna2hpo4、1.8mmkh2po4，ph值為7.4。9)洗滌液為添加了體積分?jǐn)?shù)為0.05％的tween-20的包被緩沖液。10)封閉液為含有體積分?jǐn)?shù)為1％的牛血漿白蛋白的包被緩沖液。11)加樣緩沖液的成分為50mmtris-hcl、0.5mkcl、體積分?jǐn)?shù)為1％的牛血漿白蛋白、體積分?jǐn)?shù)為0.05％的tween-20，ph值為8.4。12)顯色液tmb，購自r&dsystems，catalog#dy999。13)所述反應(yīng)終止液的成分為2mh2so4。實施例5：外泌體dicer蛋白檢測試劑盒的使用方法1)收集血漿樣本并按照常規(guī)血漿分離方法處理，得到血液上清；2)參照實施例1中的外泌體分離及總蛋白提取步驟，得到血漿外泌體的總蛋白；3)在96孔酶標(biāo)板中，每孔加入100ul濃度為4ug/ml山羊抗人dicer多克隆抗體，4℃孵育24h；棄去孔中液體，在干凈的吸水紙上拍干，用洗滌液洗三次，每次洗滌5分鐘，濾紙吸干；4)每孔加入200ul封閉液封閉2h(37℃條件下封閉)，棄去孔中液體，在干凈的吸水紙上拍干，用洗滌液洗三次，每次洗滌5分鐘，濾紙吸干；5)每孔加入標(biāo)準(zhǔn)品或待檢測的蛋白溶液100ul，留出陰性對照孔加pbs做空白對照，37℃孵育2h后，棄去孔中液體，在干凈的吸水紙上拍干，用洗滌液洗三次，每次洗滌5分鐘，濾紙吸干；6)每孔加入100ul小鼠抗人dicer單克隆抗體(已生物素化，濃度為0.4ug/ml)，37℃孵育2h，孵育時加蓋封口膜，孵育完成后棄去孔中液體，在干凈的吸水紙上拍干，用洗滌液洗三次，每次洗滌5分鐘，濾紙吸干；7)每孔加入100ulstreptavidin-hrpigg(濃度為0.5mg/ml)，加蓋封口膜，37℃條件下避光反應(yīng)20分鐘；8)每孔加入100ultmb顯色，室溫反應(yīng)20分鐘；9)每孔加入50ul2mh2so4終止反應(yīng)；10)在酶標(biāo)儀中測定od450和od570值(450nm，570nm，bio-radmodel)。實施例6標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備將實施例5的步驟4)分別添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度分別為0ng/ml、0.78125ng/ml、1.5625ng/ml、3.125ng/ml、6.25ng/ml、12.5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml。其余步驟均同實施例5。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品測定的od450-570值(即利用od450測的數(shù)值減去od570測得的數(shù)值)，利用統(tǒng)計學(xué)繪圖軟件根據(jù)測定的值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為待測樣品中外泌體dicer蛋白的濃度，縱坐標(biāo)為od450-570值；測得標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為：y＝0.0254x+0.0328，其中，y為樣品孔的吸光度(od450-570值)，x為血漿中分泌型dicer蛋白絕對含量(ng/ml)。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示，r-square(即標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸系數(shù))為0.999，表示該試劑盒在技術(shù)上合格。根據(jù)特異性識別血漿中外泌體dicer蛋白含量，判斷患者是否患有惡性肺癌腫瘤。實施例7：對比實施例為了驗證本技術(shù)方案所具備的有益效果，同時設(shè)置了其他的條件進(jìn)行對比試驗。采用dicer人重組蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，其氨基酸序列為ncbigenebank索取號為aai50288.1所示的氨基酸序列，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，利用實施例6所示的方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。選取敏感特異配對包被抗體和檢測抗體利用方陣滴定法來驗證本發(fā)明所述的技術(shù)的檢測條件的有益效果。其中包被抗體為山羊抗人dicer多克隆抗體，檢測抗體為生物素標(biāo)記后小鼠抗人dicer單克隆抗體。如表3所示，設(shè)置不同的包被抗體濃度和檢測抗體濃度。表3添加的標(biāo)準(zhǔn)品的濃度示意圖編號123456789101112a3.1253.1253.1253.1253.1253.1253.1253.1253.1253.1253.1253.125b6.256.256.256.256.256.256.256.256.256.256.256.25c12.512.512.512.512.512.512.512.512.512.512.512.5d252525252525252525252525e3.1253.1253.1253.1253.1253.1253.1253.1253.1253.1253.1253.125f6.256.256.256.256.256.256.256.256.256.256.256.25g12.512.512.512.512.512.512.512.512.512.512.512.5h252525252525252525252525包被抗體濃度的設(shè)置：將包被抗體用包被緩沖液稀釋為8ug/ml、4ug/ml、2ug/ml等濃度按列包被96孔板(96孔酶標(biāo)板，康寧公司，美國)，每個濃度包被兩列，共設(shè)兩組，第一組的所在的列的編號為1-6，第二組所在的列的編號為7-12。標(biāo)準(zhǔn)品濃度的設(shè)置：向編號a1至a12的孔中、編號e1至e12的孔中均加入弱陽性抗原(dicer人重組蛋白濃度為3.125ng/ml)；向編號b1至b12的孔中、編號f1至f12的孔中均加入弱陽性抗原(dicer人重組蛋白濃度為6.25ng/ml)；向編號c1至c12的孔中、編號g1至g12的孔中均加入強陽性抗原(dicer人重組蛋白濃度為12.5ng/ml)；向編號d1至d12的孔中、編號h1至h12的孔中均加入強陽性抗原(dicer人重組蛋白濃度為25ng/ml)。檢測抗體濃度的設(shè)置：將檢測抗體用加樣緩沖液稀釋為400ng/ml、200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml四個濃度，分別加入上述孔中。其中，編號a1至a6、b1至b6、c1至c6、d1至d6的孔中加入濃度為400ng/ml檢測抗體；編號a7至a12、b7至b12、c7至c12、d7至d12的孔中加入濃度為200ng/ml檢測抗體；編號e1至e6、f1至f6、g1至g6、h1至h6的孔中加入濃度為100ng/ml檢測抗體；編號e7至e12、f7至f12、g7至g12、h7至h12的孔中加入濃度為400ng/ml檢測抗體。加底物(tmb)顯色，加酸(硫酸，濃度為2m，體積為50ul)終止反應(yīng)。分別讀取吸光度od450-570值(450nm，570nm，bio-radmodel)。其余詳細(xì)的具體步驟(如添加各種試劑的體積、洗滌等等過程)均參照實施例5。根據(jù)實驗的檢測結(jié)果，本技術(shù)方案設(shè)置的包被抗體的工作濃度以及檢測抗體的工作濃度，強陽性抗原液od值在1.0-3.0左右，陰性參考o(jì)d值＜0.2，遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于其他檢測條件，符合構(gòu)建試劑盒所需達(dá)到的標(biāo)準(zhǔn)。本技術(shù)方案選取的包被抗體的工作濃度為4ug/ml為最佳工作濃度，本技術(shù)方案選取的檢測抗體的工作濃度為0.4ug/ml為最佳工作濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于設(shè)置的其他濃度的檢測效果。實施例8利用血漿外泌體dicer蛋白檢測試劑盒檢測樣品收集血漿，按常規(guī)血漿分離方法，抽取2ml靜脈外周血，4°c條件下2000rpm離心20分鐘，吸出上層血漿到干凈的離心管中，-80℃凍存，使用前冰上融化。然后按照實施例5所述的檢測方法，對肺癌患者血漿樣本(n=258)進(jìn)行檢測，并以標(biāo)準(zhǔn)品、正常個體血漿樣品(n=110)及肺部良性病變(n=41)作為對照。對該檢測結(jié)果進(jìn)行利用軟件spss16.0進(jìn)行如下的統(tǒng)計學(xué)分析。cutoff值的確定：根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果中各可能切點的靈敏度和特異度，計算youden指數(shù)，并選擇其最大的切點為臨界點，確定血漿中含量≥3.304ng/ml為roc曲線上的最佳臨界點，即cutoff值(如圖4所示)。血漿外泌體dicer蛋白含量診斷惡性肺癌的靈敏度為84.4％，特異度為86.5％。根據(jù)實施例6獲得的公式y(tǒng)＝0.0254x+0.0328計算出的濃度比較如圖5所示。濃度均值(正常個體)=1.89ng/ml，濃度均值(良性病變)=2.65ng/ml，濃度均值(肺癌患者)=6.12ng/ml，利用單因素方差分析(one-wayanova)檢驗，外泌體dicer蛋白在肺癌中表達(dá)高于肺部良性病變和正常個體，具有統(tǒng)計學(xué)差異(圖5)。外泌體dicer蛋白在肺癌患者及正常人群血漿中的表達(dá)差異，另外，也可以據(jù)此表明外泌體dicer蛋白肺癌患者未轉(zhuǎn)移組及轉(zhuǎn)移組之間的表達(dá)差異及治療后肺癌患者中的表達(dá)情況。肺癌患者分為未轉(zhuǎn)移組、轉(zhuǎn)移組和復(fù)發(fā)組，未轉(zhuǎn)移組均值=5.01ng/ml，轉(zhuǎn)移組均值=6.23ng/ml，復(fù)發(fā)組均值=6.74ng/ml，統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)肺癌中dicer濃度轉(zhuǎn)移組高于未轉(zhuǎn)移組，且復(fù)發(fā)患者外泌體dicer表達(dá)明顯高于轉(zhuǎn)移組和未轉(zhuǎn)移組(未附圖說明)。另外，隨著治療的進(jìn)行，患者血漿外泌體中dicer濃度逐漸降低，具有統(tǒng)計學(xué)差異，提示外泌體dicer濃度可能成為肺癌治療效果評估的指標(biāo)，未治療組、化療后術(shù)前、術(shù)后、術(shù)后化療后濃度均值分別為8.39ng/ml、5.94ng/ml、4.38ng/ml、2.98ng/ml。工業(yè)實用性本發(fā)明提供的試劑盒是一種可用于臨床檢測的實用性試劑盒，通過檢測患者血漿外泌體中dicer的水平來協(xié)助肺癌的早期診斷、預(yù)測預(yù)后、評估療效及隨訪監(jiān)測以期早期發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。外泌體dicer蛋白的發(fā)現(xiàn)，為肺癌診斷提供了血漿學(xué)標(biāo)記物以外的另一種分子標(biāo)記物。本發(fā)明所述的外泌體dicer的靈敏度和特異性均較高。因此，利用本發(fā)明的試劑盒，可以結(jié)合影像學(xué)檢查來開展無創(chuàng)性肺癌術(shù)前早期診斷及術(shù)后監(jiān)測。且由于該生物標(biāo)志物是一個獨立預(yù)后因子，因此可以預(yù)測預(yù)后、監(jiān)測病情、指導(dǎo)治療。鑒于以上結(jié)果及外泌體dicer蛋白的證實，本發(fā)明人進(jìn)一步嘗試開發(fā)了人血漿外泌體蛋白的檢測試劑盒-雙抗夾心elisa試劑盒。實驗結(jié)果證實試劑盒構(gòu)建成功。該試劑盒對肺癌患者的可信檢出率為80.04％，通過該試劑盒，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)正常個體與肺癌患者血漿dicer含量有顯著差異。本發(fā)明中的一些術(shù)語與縮寫：mab：單克隆抗體，monoclonalantibody；pab：多克隆抗體，polyclonalantibody；bsa：牛血漿白蛋白；tween-20；igg：免疫球蛋白g；tmb：四甲基聯(lián)苯胺；od：吸光度；np-40：乙基苯基聚乙二醇；pmsf：苯甲基磺酰氟。需要特別指出的是，具體實例和附圖僅是為了說明，顯然本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文說明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁12