本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及脂肪酶突變體ala36ser/asp49his/ala52val/asn55asp及其基因和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

脂肪酶(ec3.1.1.3)全稱三酰基甘油酰水解酶，屬于α/β折疊酶家族，是一種絲氨酸水解酶。脂肪酶不僅可以在油水界面上催化天然底物油脂水解，釋放更少酯鍵的甘油酯或甘油及脂肪酸，而且在非水相體系中脂肪酶還可催化酸解、轉(zhuǎn)酯和酯合成等反應(yīng)。工業(yè)飼料用脂肪酶主要來源于微生物，微生物分泌的脂肪酶具有較廣的作用ph值和作用溫度。隨著酶催化技術(shù)的不斷推廣，酶制劑的應(yīng)用條件也越來越嚴(yán)格，如高溫、強(qiáng)酸強(qiáng)堿等特殊條件。脂肪酶作為一種重要的酶種被廣泛地應(yīng)用到食品加工、飼料、洗滌、醫(yī)藥等領(lǐng)域。油脂加工和飼料制粒等工藝通常需在較高溫度下進(jìn)行，熱穩(wěn)定性差的脂肪酶在上述工藝中易失活變性，因此開發(fā)高熱穩(wěn)定性脂肪酶一直是學(xué)術(shù)和產(chǎn)業(yè)界努力的目標(biāo)。

為了得到更優(yōu)的酶制劑，一方面可以從自然界篩選合適的酶基因，另一個(gè)途經(jīng)就是將現(xiàn)有產(chǎn)業(yè)化的酶蛋白通過分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行改造，以適應(yīng)不同產(chǎn)業(yè)的需求。現(xiàn)今改造酶蛋白的策略主要有兩個(gè)，其一是非理性設(shè)計(jì)，通過隨機(jī)突變改造酶的基因，再根據(jù)特定的改造目的，篩選出更符合其作用條件的酶蛋白。此策略優(yōu)點(diǎn)是無須深入研究酶的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理，但需要極大的工作量去完成篩選，效率偏低。

有文獻(xiàn)報(bào)道科學(xué)家從突尼斯南部火山地區(qū)分離得到一株嗜熱裸足菌，其分泌脂肪酶具有較好的耐熱性，70℃處理1h后剩余50％酶活。畢赤酵母培養(yǎng)條件簡單、易于工業(yè)化生產(chǎn)且高效分泌表達(dá)外源蛋白，已成功表達(dá)多個(gè)外源源脂肪酶。本發(fā)明利用畢赤酵母高效分泌表達(dá)嗜熱裸足菌來源的脂肪酶，并以嗜熱裸足菌脂肪酶基于為模板，通過定點(diǎn)突變技術(shù)獲得熱穩(wěn)定性顯著提高的脂肪酶突變體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供高熱穩(wěn)定性的脂肪酶ttl。所述高熱穩(wěn)定性脂肪酶ttl，是由親本脂肪酶ttl進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得的脂肪酶突變體。用于表達(dá)所述脂肪酶的突變體的表達(dá)載體為ppiczαa和ppic9k；用于所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞是畢赤酵母x33和gs115。所述脂肪酶突變體為：ttl-ala36ser/asp49his/ala52val/asn55asp。

野生型的脂肪酶基因全長825個(gè)堿基(seqidno.1)及其編碼的274個(gè)氨基酸(seqidno.2)

seqidno.1

tctccagtcagacgtgaggtttctcaggacttgttcgaccagtttaatttgttcgctcagtactctgctgctgcctactgtgccaagaataacgatgccccagctggtgctaacgttacctgtagaggttccatctgcccagaggttgagaaggctgacgccaccttcttgtactctttcgaggactctggagttggtgacgttaccggtttcttggctttggacaacaccaacagattgatcgtcttgtctttccgtggttcccgttcccttgagaattggatcggtaacattaatttggatttgaagggtatcgacgacatctgctctggttgcaagggacacgatggtttcacctcctcttggagatccgttgccaacaccttgacccaacaggttcagaacgccgttagagagcatccagactaccgtgtcgtcttcactggtcactctttgggtggtgctttggctaccgttgctggtgcctctttgagaggtaacggttacgacatcgacgttttctcctacggtgctcctcgtgttggtaacagagccttcgctgtcttcttgaccgctcagaccggtggtaccttgtacagaatcacccataccaacgatatcgtcccacgtttgccaccaagagagcttggatactcccactcttccccagagtactggatcacctccggtactttggttccagttaccaagaacgatattgttaaggttgagggaattgactccaccgacggtaacaaccagccaaataccccagacattgctgcccacttgtggtacttcggtttgattggtacttgtttgtaa

seqidno.2

spvrrevsqdlfdqfnlfaqysaaaycaknndapaganvtcrgsicpevekadatflysfedsgvgdvtgflaldntnrlivlsfrgsrslenwigninldlkgiddicsgckghdgftsswrsvantltqqvqnavrehpdyrvvftghslggalatvagaslrgngydidvfsygaprvgnrafaefltaqtggtlyrithtndivprlpprelgyshsspeywitsgtlvpvtkndivkvegidstdgnnqpntpdiaahlwyfgligtcl

突變后脂肪酶基因全長825個(gè)堿基(如核苷酸序列seqidno.3所示)，其編碼的274個(gè)氨基酸(如氨基酸序列seqidno.4所示)。

seqidno.3

tctccagtcagacgtgaggtttctcaggacttgttcgaccagtttaatttgttcacccagtactctgctgctgcctactgtgccaagaataaccacgccccagtcggtgctgacgttacctgtagaggttctatctgcccagaggttgagaaggctgacgccaccttcttgtactctttcgaggactctggagttggtgacgttaccggtttcttggctttggacaacaccaacagattgatcgtcttgtctttccgtggttcccgttcccttgagaattggatcggtaacattaatttggatttgaagggtatcgacgacatctgctctggttgcaagggacacgatggtttcacctcctcttggagatccgttgccaacaccttgacccaacaggttcagaacgccgttagagagcatccagactaccgtgtcgtcttcactggtcactctttgggtggtgctttggctaccgttgctggtgcctctttgagaggtaacggttacgacatcgacgttttctcctacggtgctcctcgtgttggtaacagagccttcgctgtcttcttgaccgctcagaccggtggtaccttgtacagaatcacccataccaacgatatcgtcccacgtttgccaccaagagagcttggatactcccactcttccccagagtactggatcacctccggtactttggttccagttaccaagaacgatattgttaaggttgagggaattgactccaccgacggtaacaaccagccaaataccccagacattgctgcccacttgtggtacttcggtttgattggtacttgtttgtaa

seqidno.4

spvrrevsqdlfdqfnlfaqysaaaycaknnhapvgadvtcrgsicpevekadatflysfedsgvgdvtgflaldntnrlivlsfrgsrslenwigninldlkgiddicsgckghdgftsswrsvantltqqvqnavrehpdyrvvftghslggalatvagaslrgngydidvfsygaprvgnrafaefltaqtggtlyrithtndivprlpprelgyshsspeywitsgtlvpvtkndivkvegidstdgnnqpntpdiaahlwyfgligtcl

親本脂肪酶ttl在80℃水浴5min后剩余酶活為18.3％。本發(fā)明利用分子生物學(xué)技術(shù)定點(diǎn)突變脂肪酶ttl，獲得了熱穩(wěn)定性提高的脂肪酶突變體ttl-ala36ser/asp49his/ala52val/asn55asp。突變體ttl-ala36ser/asp49his/ala52val/asn55asp在80℃水浴5min后剩余酶活為31.2％，提高至親本脂肪酶的1.70倍。

附圖說明

圖1含ppiczαa-ttl的畢赤酵母x33重組菌50l罐發(fā)酵圖。

圖2發(fā)酵各時(shí)間段酶液的蛋白電泳圖。

圖3脂肪酶ttl的酶學(xué)性質(zhì)圖。

圖4脂肪酶突變體的酶學(xué)性質(zhì)圖

具體實(shí)施方式

為了增加脂肪酶的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，本發(fā)明將脂肪酶基因ttl在畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)，進(jìn)一步研究此脂肪酶三維結(jié)構(gòu)后，針對(duì)其關(guān)鍵特性的氨基酸突變以增進(jìn)其熱穩(wěn)定性。以下將詳述本發(fā)明改造脂肪酶的方法及其所得到的改良的脂肪酶。

以下實(shí)施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)j.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進(jìn)行；所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。

實(shí)驗(yàn)材料和試劑：

1、菌株與載體

大腸桿菌菌株topl0、畢赤酵母x33，gs115、載體ppiczαa，ppic9k，zeocin購自invitrogen公司。

2、酶與試劑盒

pcr酶，限制性內(nèi)切酶，質(zhì)粒提取和凝膠純化試劑盒購自上海生工公司。

實(shí)施例1、脂肪酶ttl在畢赤酵母x33中的高效表達(dá)

1.將脂肪酶基因ttl作為目標(biāo)基因，野生型的脂肪酶基因全長825個(gè)堿基(seqidno.1)及其編碼的274個(gè)氨基酸(seqidno.2)，利用限制性切酶ecori和xbai酶切后，構(gòu)建到ppiczαa載體中得到表達(dá)載體ppiczαa-ttl，再將ppiczαa-ttl轉(zhuǎn)化top10感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)抗生素zeocin篩選后，得到陽性克隆。將上述重組表達(dá)載體用saci進(jìn)行線性化，線性化后的重組載體電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母x33，得到畢赤酵母重組菌株轉(zhuǎn)化子。將上述重組菌單菌落進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)。在發(fā)酵過程中的定時(shí)取樣測定酶活，脂肪酶的表達(dá)情況如圖1所示，發(fā)酵189h時(shí)脂肪酶酶活為31500u/ml。將上述發(fā)酵液中的脂肪酶通過硫酸銨分級(jí)沉淀、充分透析、再通過離子交換柱層析純化，將純化后的蛋白液進(jìn)行12％sds－page檢測，結(jié)果如圖2。

2.脂肪酶活力測定采用橄欖油乳化液水解滴定法，酶活的定義為：脂肪酶在40℃、ph7.0條件下水解橄欖油乳化液產(chǎn)生1μmol/min脂肪酸所消耗的酶量，即為1個(gè)脂肪酶活力單位。脂肪酶熱處理采用水浴法，將酶液適當(dāng)稀釋后置于玻璃試管中，在不同溫度水浴鍋(70℃～90℃)中保溫5min。

實(shí)施例2、脂肪酶ttl的酶學(xué)性質(zhì)測定

1.脂肪酶ttl的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性測定

在30℃～80℃下，以10℃為間隔，分別測定脂肪酶的活力，以50℃下的酶活力為對(duì)照，測定不同溫度下的相對(duì)酶活。結(jié)果如圖3(a)，脂肪酶作用的最適合溫度為50℃。將脂肪酶酶液置于玻璃試管中，在不同溫度下(70℃～90℃)熱處理5min，測定殘留脂肪酶活力，以未處理的酶活力為對(duì)照，熱處理后的酶活與之相比，即得到該溫度下剩余的相對(duì)酶活。結(jié)果如圖3(b)，80℃熱處理5min后脂肪酶剩余酶活為18.3％。

2.脂肪酶ttl的最適反應(yīng)ph和ph穩(wěn)定性測定

在不同ph(3.0～9.0)的緩沖液體系中分別測定脂肪酶的酶活，以ph值7.0的酶活為對(duì)照，計(jì)算不同ph值下的相對(duì)酶活。結(jié)果如圖3(c)，脂肪酶作用的最適ph值為7.0。向上述不同ph的緩沖液體系中分別加入稀釋好的酶液，室溫處理2h，測定殘留脂肪酶活力，以未處理的酶活力為對(duì)照，計(jì)算該ph下剩余的相對(duì)酶活。測定結(jié)果如圖3(d)該酶的ph穩(wěn)定范圍較廣，在ph5.0～9.0范圍內(nèi)酶活穩(wěn)定。

實(shí)施例3、熱穩(wěn)定性提高的脂肪酶突變體ttl-ala36ser/asp49his/ala52val/asn55asp

1、以質(zhì)粒ppiczαa-ttl-a36sd49ha52v為模板，分別以引物f1、pic-r和引物r1、pic-f進(jìn)行pcr擴(kuò)增，再將得到2個(gè)dna片段進(jìn)行融合pcr，得到重組載體ppiczαa-ttl-a36sd49ha52vn55d。將上述重組載體轉(zhuǎn)化top10感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)抗生素zeocin篩選后，得到陽性克隆。將上述重組表達(dá)載體用saci進(jìn)行線性化，線性化后的重組載體電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母x33，得到畢赤酵母重組菌株轉(zhuǎn)化子。突變后脂肪酶基因全長825個(gè)堿基，由此推導(dǎo)出274個(gè)氨基酸。

所用引物如下：

f1:5’-ccagctggtgctgatgttacctgtagaggt-3’

r1:5’-caggtaacatcagcaccagctggggcatc-3’

pic-f：5’-cttgcttgagaaggttttgggacgc-3’

pic-r：5’-cttggagcgaacgacctacaccgaa-3’

2、重組脂肪酶的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性測定

在30℃～80℃下，以10℃為間隔，分別測定脂肪酶的活力，以50℃下的酶活力為對(duì)照，測定不同溫度下的相對(duì)酶活。結(jié)果如圖4(a)，脂肪酶作用的最適合溫度為50℃。將脂肪酶酶液在不同溫度(70℃～90℃)熱處理5min，測定殘留脂肪酶活力，以未處理的酶活力為對(duì)照，計(jì)算得到該溫度下剩余的相對(duì)酶活。結(jié)果如圖4(b)，80℃熱處理5min后脂肪酶剩余酶活為31.2％。

3、重組脂肪酶的最適反應(yīng)ph和ph穩(wěn)定性測定

在不同ph(3.0～9.0)的緩沖液體系中分別測定脂肪酶的酶活，以ph值7.0的酶活為對(duì)照，測定不同ph值下的相對(duì)酶活。結(jié)果如圖4(c)所示：該脂肪酶作用的最適ph值為7.0。向上述不同ph的緩沖液體系中分別加入稀釋好的酶液，室溫處理2h，測定殘留脂肪酶活力，以未處理的酶活力為對(duì)照，處理后酶液的酶活與之相比，即得到該ph下剩余的相對(duì)酶活。測定結(jié)果如圖4(d)，該酶的ph穩(wěn)定范圍較廣，在ph5.0～9.0范圍內(nèi)酶活穩(wěn)定。

<110>廣東溢多利生物科技股份有限公司

<120>脂肪酶變體ala36ser/asp49his/ala52val/asn55asp

<160>4

<210>1

<211>825

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

tctccagtcagacgtgaggtttctcaggacttgttcgaccagtttaatttgttcgctcag60

tactctgctgctgcctactgtgccaagaataacgatgccccagctggtgctaacgttacc120

tgtagaggttccatctgcccagaggttgagaaggctgacgccaccttcttgtactctttc180

gaggactctggagttggtgacgttaccggtttcttggctttggacaacaccaacagattg240

atcgtcttgtctttccgtggttcccgttcccttgagaattggatcggtaacattaatttg300

gatttgaagggtatcgacgacatctgctctggttgcaagggacacgatggtttcacctcc360

tcttggagatccgttgccaacaccttgacccaacaggttcagaacgccgttagagagcat420

ccagactaccgtgtcgtcttcactggtcactctttgggtggtgctttggctaccgttgct480

ggtgcctctttgagaggtaacggttacgacatcgacgttttctcctacggtgctcctcgt540

gttggtaacagagccttcgctgtcttcttgaccgctcagaccggtggtaccttgtacaga600

atcacccataccaacgatatcgtcccacgtttgccaccaagagagcttggatactcccac660

tcttccccagagtactggatcacctccggtactttggttccagttaccaagaacgatatt720

gttaaggttgagggaattgactccaccgacggtaacaaccagccaaataccccagacatt780

gctgcccacttgtggtacttcggtttgattggtacttgtttgtaa825

<210>2

<211>274

<212>prt

<213>人工序列

<400>2

spvrrevsqdlfdqfnlfaqysaaaycaknndapaganvtcrgsicpevekadatflysf60

edsgvgdvtgflaldntnrlivlsfrgsrslenwigninldlkgiddicsgckghdgfts120

swrsvantltqqvqnavrehpdyrvvftghslggalatvagaslrgngydidvfsygapr180

vgnrafaefltaqtggtlyrithtndivprlpprelgyshsspeywitsgtlvpvtkndi240

vkvegidstdgnnqpntpdiaahlwyfgligtcl274

<210>3

<211>825

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

tctccagtcagacgtgaggtttctcaggacttgttcgaccagtttaatttgttcacccag60

tactctgctgctgcctactgtgccaagaataaccacgccccagtcggtgctgacgttacc120

tgtagaggttctatctgcccagaggttgagaaggctgacgccaccttcttgtactctttc180

gaggactctggagttggtgacgttaccggtttcttggctttggacaacaccaacagattg240

atcgtcttgtctttccgtggttcccgttcccttgagaattggatcggtaacattaatttg300

gatttgaagggtatcgacgacatctgctctggttgcaagggacacgatggtttcacctcc360

tcttggagatccgttgccaacaccttgacccaacaggttcagaacgccgttagagagcat420

ccagactaccgtgtcgtcttcactggtcactctttgggtggtgctttggctaccgttgct480

ggtgcctctttgagaggtaacggttacgacatcgacgttttctcctacggtgctcctcgt540

gttggtaacagagccttcgctgtcttcttgaccgctcagaccggtggtaccttgtacaga600

atcacccataccaacgatatcgtcccacgtttgccaccaagagagcttggatactcccac660

tcttccccagagtactggatcacctccggtactttggttccagttaccaagaacgatatt720

gttaaggttgagggaattgactccaccgacggtaacaaccagccaaataccccagacatt780

gctgcccacttgtggtacttcggtttgattggtacttgtttgtaa825

<210>4

<211>274

<212>prt

<213>人工序列

<400>4

spvrrevsqdlfdqfnlfaqysaaaycaknnhapvgadvtcrgsicpevekadatflysf60

edsgvgdvtgflaldntnrlivlsfrgsrslenwigninldlkgiddicsgckghdgfts120

swrsvantltqqvqnavrehpdyrvvftghslggalatvagaslrgngydidvfsygapr180

vgnrafaefltaqtggtlyrithtndivprlpprelgyshsspeywitsgtlvpvtkndi240

vkvegidstdgnnqpntpdiaahlwyfgligtcl274