本發(fā)明涉及可再生生物能源技術領域，尤其涉及一種產油微藻一體式培養(yǎng)反應器，還涉及一種培養(yǎng)方法。

背景技術：

生物柴油指的是動、植物或微生物油脂經酯化反應后得到的長鏈脂肪酸烷基單酯。由于具有清潔、可再生、對環(huán)境友好的特性，生物柴油已日益受到歐美及亞洲一些能耗大國的重視并獲得了長足的發(fā)展。

隨著人們生活水平的提高，對能源的消耗日益增加，在2050年，全球的能源消耗量將達到現(xiàn)今的兩倍。在化石能源消耗殆盡的情況下，人們紛紛把目光投向了生物能源，生物能源是解決能源問題的關鍵。它是清潔能源的代表，不但有極好的可循環(huán)性，并且環(huán)境友好，綠色清潔，生物能源的開發(fā)、利用將有效的為社會發(fā)展提供動力，并且?guī)悠渌嚓P產業(yè)，如運輸、發(fā)電、以及相關的制造業(yè)，生物能源中的微藻柴油也正因此再次得到了人們的重視。

從目前國內外的技術水平來看，要實現(xiàn)微藻煉油的產業(yè)化，還需解決如下的技術難題：

①選育產油率高、生長速度快的微藻；

②開發(fā)工業(yè)化培養(yǎng)微藻的低成本生產裝置。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了解決上述技術問題，進而提供一種產油微藻一體式培養(yǎng)反應器，體積小，適用于規(guī)模地培養(yǎng)和收集優(yōu)質的產油微藻，可以為今后的大規(guī)模量產提供最可靠的資料，擁有靈活性強，易于改造等各種的特性。

本發(fā)明的技術方案：

一種產油微藻一體式培養(yǎng)反應器，包括：第一培養(yǎng)器、第二培養(yǎng)器、第一攪拌電機、第二攪拌電機、循環(huán)水泵、微藻采收器、第一攪拌槳葉、第二攪拌槳葉；所述第一攪拌槳葉設置于所述第一培養(yǎng)器內，并由所述第一攪拌電機驅動旋轉，所述第二攪拌槳葉設置于所述第二培養(yǎng)器內，并由所述第二攪拌電機驅動旋轉；所述第二培養(yǎng)器的上方設置有種子進料口，所述第一培養(yǎng)器的上方設置有培養(yǎng)基進料口；所述第一培養(yǎng)器與第二培養(yǎng)器連通，所述微藻采收器設置在所述第一培養(yǎng)器下方，用于接收所述第一培養(yǎng)器內產生的微藻。

進一步地，所述第一培養(yǎng)器的外側設置有第一水浴加熱套，所述第二培養(yǎng)器的外側設置有第二水浴加熱套，所述第一水浴加熱套、第二水浴加熱套通過第一循環(huán)水管道和第二循環(huán)水管道連通，所述第一循環(huán)水管道、第二循環(huán)水管道之間設置有所述循環(huán)水泵。

進一步地，所述第一培養(yǎng)器、第二培養(yǎng)器內分別設置有溶氧計和PH檢測計。

進一步地，在所述第一培養(yǎng)器和第二培養(yǎng)器連通的管路上設置有電動閥門。

進一步地，所述第一培養(yǎng)器的下方設置有第一采樣口、微藻出口，所述第二培養(yǎng)器的下方設置有第二采樣口。

本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明公開的產油微藻一體式培養(yǎng)反應器，首先關閉反應器各電動閥門，將培養(yǎng)基和種子打入第二培養(yǎng)反應器中，通過調整第二培養(yǎng)反應器的溫度，通過溫度計測定第二培養(yǎng)反應器溫度，使第二培養(yǎng)反應器達到高密度培養(yǎng)最佳培養(yǎng)溫度。通過給第二培養(yǎng)反應器中通入空氣，并且監(jiān)控培養(yǎng)基中溶氧量，通過第二攪拌槳葉使微藻均勻和充分溶氧。當培養(yǎng)一定時間后，打開電動閥門進行采樣，采完樣品關閉電動閥門，測定樣品吸光度，確定達到足夠的微藻密度。打開電動閥門，使經高密度培養(yǎng)后的微藻進入第一培養(yǎng)反應器進行繼續(xù)培養(yǎng)。當培養(yǎng)一定時間后，打開電動閥門從采樣口進行采樣，采完樣品關閉電動閥門，測定樣品吸光度，確定微藻油脂富集達到一定程度，打開電動閥門，將油脂富集后的微藻排入微藻采收器中。

本發(fā)明還提供一種培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

第一步，準備實驗設備與材料；

第二步，微藻的富集培養(yǎng)，培養(yǎng)后續(xù)油脂累積實驗所需要的藻源；

第三步，油脂積累；

第四步，微藻生物量及油脂測定。

進一步地，所述實驗設備包括光照培養(yǎng)箱、超低溫保存箱、冷凍干燥機、離心機、分光光度計、超凈工作臺、蒸汽滅菌鍋、電熱鼓風干燥箱、自動控溫搖床。

進一步地，包括光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)和異養(yǎng)無光照培養(yǎng)，在光照培養(yǎng)箱中的光暗周期為15h:9h。

進一步地，所述油脂積累采用的培養(yǎng)基為BG培養(yǎng)基。

采用本發(fā)明的培養(yǎng)方法，工藝靈活，適應范圍廣，可以靈活的變換兩段中的營養(yǎng)供給以及環(huán)境設置，這些靈活的方式可以適應不同種類的微藻以及其它微生物，生物能源的生產和廢源資源化相結合，在生成生物柴油的同時對水處理中的很多不易降解的小分子有機物產物進行降解，為水處理提供便利。

本發(fā)明的有益效果將通過下面具體實施方式的描述變得更加明顯。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例的結構示意圖；

圖2是本發(fā)明實施例的生長曲線圖；

圖中1-第一培養(yǎng)器；2-第二培養(yǎng)器；3-第一攪拌電機；4-第二攪拌電機；5-循環(huán)水泵；6-微藻采收器；7-第一攪拌槳葉；8-第二攪拌槳葉；9-第一水浴加熱套；10-第二水浴加熱套；11-第一循環(huán)水管道；12-第二循環(huán)水管道；13-溶氧計；14-PH檢測計；15-電動閥門；16-第一采樣口；17-微藻出口；18-第二采樣口。

具體實施方式

本實施例公開的產油微藻一體式培養(yǎng)反應器，包括

第一培養(yǎng)器1、第二培養(yǎng)器2、第一攪拌電機3、第二攪拌電機4、循環(huán)水泵5、微藻采收器6、第一攪拌槳葉7、第二攪拌槳葉8；第一攪拌槳葉7設置于第一培養(yǎng)器1內，并由第一攪拌電機3驅動旋轉，第二攪拌槳葉8設置于第二培養(yǎng)器2內，并由第二攪拌電機4驅動旋轉；第二培養(yǎng)器2的上方設置有種子進料口，第一培養(yǎng)器1的上方設置有培養(yǎng)基進料口；第一培養(yǎng)器1與第二培養(yǎng)器2連通，微藻采收器6設置在第一培養(yǎng)器1下方，用于接收第一培養(yǎng)器1內產生的微藻。

優(yōu)選地，在第一培養(yǎng)器1的外側設置有第一水浴加熱套9，第二培養(yǎng)器2的外側設置有第二水浴加熱套10，第一水浴加熱套9、第二水浴加熱套10通過第一循環(huán)水管道11和第二循環(huán)水管道12連通，第一循環(huán)水管道11、第二循環(huán)水管道12之間設置有循環(huán)水泵5。

進一步地，第一培養(yǎng)器1、第二培養(yǎng)器2內分別設置有溶氧計13和PH檢測計14。

具體地，在第一培養(yǎng)器1和第二培養(yǎng)器2連通的管路上設置有電動閥門15。

更加具體地，第一培養(yǎng)器1的下方設置有第一采樣口16、微藻出口17，第二培養(yǎng)器2的下方設置有第二采樣口18。

本發(fā)明實施例的工作原理如下：

首先關閉所有電動閥門15，用培養(yǎng)基進料泵通過第二培養(yǎng)器2培養(yǎng)基進料口將培養(yǎng)基打入第二培養(yǎng)器2中，然后用種子進料泵通過種子進料口將產油微藻種子打入第二培養(yǎng)器2中。循環(huán)熱水通過第二水浴加熱套10進口進入，通過第二水浴加熱套10出口出水，從而升高高密度第二培養(yǎng)器2的溫度，通過溫度計測定第二培養(yǎng)器2溫度，使第二培養(yǎng)器2達到高密度培養(yǎng)最佳培養(yǎng)溫度。通過曝氣蠕動泵和曝氣頭給第二培養(yǎng)器2中通入空氣，并且通過溶氧計13監(jiān)控培養(yǎng)基中溶氧量，通過第二攪拌槳葉8使微藻均勻和充分溶氧，通過pH檢測計14監(jiān)測培養(yǎng)基酸堿度。當培養(yǎng)一定時間后，打開電動閥門15從采樣口進行采樣，采完樣品關閉電動閥門15，測定樣品吸光度，確定達到足夠的微藻密度。打開電動閥門15，使經高密度培養(yǎng)后的微藻進入第一培養(yǎng)器1進行繼續(xù)培養(yǎng)。當培養(yǎng)一定時間后，打開電動閥門15從采樣口進行采樣，采完樣品關閉電動閥門15，測定樣品吸光度，確定微藻油脂富集達到一定程度，打開電動閥門15，將油脂富集后的微藻排入微藻采收器6中。

本發(fā)明的培養(yǎng)方法包括如下步驟：

第一步，準備實驗設備與材料；

第二步，微藻的富集培養(yǎng)，培養(yǎng)后續(xù)油脂累積實驗所需要的藻源；

第三步，油脂積累；

第四步，微藻生物量及油脂測定。

具體地，本實施例的實驗設備包括150C型數顯光照培養(yǎng)箱；DW-50W255型-50℃超低溫保存箱；LGJ-10D型冷凍干燥機；TDL-40B型離心機；T6型紫外/可見光分光光度計；SW-CJ-1G型超凈工作臺；BXM-30R型立式壓力蒸汽滅菌鍋；101-2AB型電熱鼓風干燥箱；ATL-032LR型自動控溫搖床；PHS-2C型PH計。

實驗材料包括硝酸鈉；磷酸氫二鉀；硫酸鎂；氯化鈣；檸檬酸；檸檬酸鐵銨；硼酸；氯化錳；硫酸鋅；鉬酸鈉；硫酸銅；硝酸鈷；葡萄糖；蛋白胨；可溶性淀粉；麥芽糖。

第二步，微藻的富集培養(yǎng)

微藻的富集工作是為了培養(yǎng)后續(xù)油脂累積實驗所需要的藻源。按照實驗需求分為光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)和異養(yǎng)無光照培養(yǎng)兩種形式。在光照培養(yǎng)箱中的光暗周期為15h:9h,每天早晚需將燒瓶搖勻。暗培養(yǎng)箱則不需要任何的光照。為了防止各類細菌污染，培養(yǎng)用工具器皿都要進過高溫滅菌。定期用顯微鏡觀察藻種情況，確定生長狀況以及是否存在污染。藻種的重新接種是為了保持藻種的新鮮程度，為油脂累積試驗提供固定的年輕藻源。接種時通過測量吸光度和血球計數板確定接種密度，一般使用吸光度在1-2范圍內、對數后期的藻源接種。接種體積為目標培養(yǎng)液體積的15％。

第三步，油脂積累

在油脂累積實驗中，不同的培養(yǎng)條件有不同的操作參數。實驗中所用的培養(yǎng)基仍為BG培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的配置標準嚴格遵循中科院武漢水生所淡水藻庫所提供的配方如表1所示。

表1BG培養(yǎng)基配方

同時，通過加入1M HCl或1M NaOH溶液的方式來調節(jié)pH值,使得試驗中的培養(yǎng)液pH濃度在5到10之間。溫度范圍則設定在10℃到45℃之間。光照強度的設定范圍從0lux到5000lux。實驗中的微藻均在72小時后采樣檢測。

油脂累積實驗中所用到的碳源有葡萄糖和模擬廢碳源。

第四步，微藻生物量及油脂測定方法

微藻的生物量測定與含油量的測定是試驗的關鍵。試驗中對各個細節(jié)的掌握和熟練的操作可以確保數據的精確。

(1)微藻生物量的采收

試驗中采用了離心法采收微藻，將生長到研究需要階段的藻液轉移到離心管中，放入離心機，在4000rpm的轉速下離心5min，放棄上清液，將下層濃縮藻泥放入冰箱冷凍30min后轉入冷凍干燥機中干燥24h。取出后保存在4℃的冰箱中備用。

(2)微藻生物量的測定方法

生物量的測定主要通過使用分光光度計的濁度法確定生物量，并且配合稱重和吸光度值尋找最佳的生長量擬合曲線。

a.細胞干重法

取4mL藻液置于已稱重的5mL離心管中，在5000-7000rpm轉速下離心5min，去上清液。并放于烘干箱中在65℃下烘干至恒重。同時測量三個平行樣，取平均值。

b.濁度法

使用紫外可見分光光度儀測量微藻溶液在波長為540nm下的吸光度(OD540)。用去離子水作為參比樣測量在540nm時的吸光度。通過每天測得的吸光度繪制微藻的生長曲線。并對微藻的生長情況做出分析。

c.生長曲線的確定

生長曲線是將微藻溶液吸光度和干重相結合所得到的描述單一批次微藻生長狀況的線。通過生長曲線我們可從吸光度的大小直接聯(lián)系到藻液中含有藻量的干重，便于試驗的進展。

細胞干重的測量方法是生物量計算的最直接方法，過程中需要涉及到離心，洗滌和干燥幾個步驟。因為細胞濃度與干重之間存在著較好的正相關關系，所以我們可以建立一套標準曲線，通過對吸光度的測量間接得到樣品中生物量的大小。這種計算方法也正是大多數的單細胞微藻研究中所慣用的手段。

在BG培養(yǎng)基、pH值自然、光照強度2000lux、接種量1:5、培養(yǎng)溫度25℃的條件下培養(yǎng)，得到如圖2所示的生長曲線。單細胞藻類在光合作用的過程中，需要一定的溫度范圍。溫度的變化例如升溫或者降溫的時候會對光合作用有一定的促進或者抑制作用。有研究指出光合作用和呼吸作用的強度都會被溫度所影響，而這兩大支柱卻都是和微藻的生長代謝有著緊密的關系。并且微藻屬于生態(tài)熱型微生物，它們必須從環(huán)境中得到熱源，溫度的大幅度變化會導致生長速率、新陳代謝效率和細胞內的生化反應速度巨變。因此培養(yǎng)時的溫度是影響單細胞微藻生長的重要因素之一。微藻可以適應的溫度往往在15℃-40℃之間。而且不同種類的微藻所適應的范圍也有所不同。單細胞的綠藻微藻最適合的溫度上限在36℃左右而最合適的溫度應在25℃～32℃之間。

這組實驗的目的是在確定的無光培養(yǎng)狀態(tài)下，在其他因素穩(wěn)定的條件里，尋找到最節(jié)能而且效率最高的的培養(yǎng)溫度。實驗中的溫度變化分為20℃、25℃、30℃、27℃、32℃幾個標準。光照為0lux；初始pH為6.8；搖速為160rpm；通氣量為50mL/d；培養(yǎng)基為BG培養(yǎng)基；葡萄糖碳源濃度為1g/L，初始吸光度相同的條件下培養(yǎng)72h。

實驗結果如下表2所示

表2不同溫度下微藻的生長情況

通過上表所示，可以看出當培養(yǎng)溫度在30℃時，吸光度(540nm)最大，也就是藻體濃度最大，所以微藻最適生長溫度為30℃。

培養(yǎng)基中的初始pH值會影響微藻生長及新陳代謝等很多生化反應的一個重要因素，pH會干涉光合作用里二氧化碳的使用性，同時在呼吸作用中將會影響微藻利用有機碳源效率。并且因為pH可以影響細胞壁的滲透性能，從而會使得細胞對培養(yǎng)液中的營養(yǎng)離子的吸收和利用受到一定的影響。同時對新陳代謝的中間產物的重復利用和藻內毒性也會有一定影響。與溫度和光照相同，最適合藻類生長的pH在不同藻種間各有不同。有研究指出，最適合微藻生長的pH在5到8之間，pH7是最合適的。還有研究指出，因為生長過程中微藻會因為二氧化碳的吸收使pH升高，所以最佳的初始pH應該為6左右。所以我們的研究將在pH5到10這個范圍中考察C.protothecoides 3的生長情況。

所以本實驗的目的是尋找到一個最適合C.protothecoides 3生長和油脂累積的pH值。實驗中的pH變化分為5.5、6.5、7.5、8.5、9.5。光照為0lux；溫度為25℃；搖速為160rpm；通氣量為50mL/d；培養(yǎng)基為BG培養(yǎng)基；葡萄糖碳源濃度為1g/L，接種量1:5，初始吸光度相同的條件下培養(yǎng)72h。實驗結果如下表3所示

表3微藻不同pH值條件下的生長情況

通過上表4所示，可以看出當初始pH值在5.5時，吸光度(540nm)最大，也就是藻體濃度最大，所以微藻最適生長的初始pH值為5.5。

初始接種影響藻種的繁殖速度，在BG培養(yǎng)基、初始pH自然、光照強度0lux、培養(yǎng)溫度25℃、初始吸光度相同的條件下培養(yǎng)時間72h。

實驗結果如下表4所示

表4微藻在不同接種量的情況下的生長情況

通過上表所示，可以看出當接種量在1:5時，吸光度(540nm)最大，也就是藻體濃度最大，所以微藻最適生長的接種量為1:5。

有機碳源的濃度對藻種生長速率有重要的影響，在BG培養(yǎng)基、pH值自然、光照強度0lux、接種量1:5、培養(yǎng)溫度25℃、初始吸光度相同的條件下培養(yǎng)時間72h。

實驗結果如下表5所示

表5微藻在不同培養(yǎng)基條件下的生長情況

通過上表所示，可以看出當培養(yǎng)基為BG+2g/LC6H12O6時，吸光度(540nm)最大，也就是藻體濃度最大，所以微藻最適生長的培養(yǎng)基為BG+2g/LC6H12O6。通過生長曲線可知吸光度為1.637，其藻體干重已經達到0.5以上。

綜上所述，微藻最適生長條件為接種量1:5、初始pH值5.5、培養(yǎng)溫度30℃和BG+2g/LC6H12O6培養(yǎng)基。

采用本發(fā)明的培養(yǎng)方法，工藝靈活，適應范圍廣，可以靈活的變換兩段中的營養(yǎng)供給以及環(huán)境設置，這些靈活的方式可以適應不同種類的微藻以及其它微生物，生物能源的生產和廢源資源化相結合，在生成生物柴油的同時對水處理中的很多不易降解的小分子有機物產物進行降解，為水處理提供便利。

以上實施例只是對本專利的示例性說明，并不限定它的保護范圍，本領域技術人員還可以對其局部進行改變，只要沒有超出本專利的精神實質，都在本專利的保護范圍內。