本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領域，具體涉及一株產(chǎn)多種抗菌肽的面包乳桿菌益生菌及其應用。

背景技術(shù)：

“益生菌”這一概念最早源自于希臘語“forlife”，即對生命有益。2001年世界糧農(nóng)組織(fao)和世界衛(wèi)生組織(who)對益生菌做出了如下定義：通過攝取適當?shù)牧俊κ秤谜叩纳眢w健康能發(fā)揮有效作用的活菌。

目前，益生菌大致可分為如下四類：⑴乳酸菌，包括乳桿菌、雙歧桿菌、鏈球菌；⑵不產(chǎn)乳酸型細菌，包括芽孢桿菌、丙酸菌；⑶非病原性酵母，包括酵母菌；⑷無芽孢和無鞭毛的一類桿菌或球桿菌(陳忠秀，2016)。乳桿菌是一類革蘭氏陽性、兼性厭氧或者微好氧、桿狀、不形成芽孢、不運動的乳酸菌。它能產(chǎn)生有利于食物保藏的代謝物，如co2、雙乙酰、過氧化氫、脂肪酸、乳酸、苯甲酸、細菌素、環(huán)二肽等(李婷等，2013)。乳酸菌通常被認為是食品級的微生物(rossetal.2002)，并且獲得了fda“一般認為安全(gras)”等級認定。

近年來，隨著抗生素在醫(yī)藥、獸藥、農(nóng)業(yè)種植、水產(chǎn)養(yǎng)殖等領域廣泛而大量的使用，大量耐藥菌不斷涌現(xiàn)，且耐藥譜逐漸擴大。當多耐藥菌以食物為傳播介質(zhì)時，直接導致耐藥菌感染人體，對人類健康是巨大威脅。我國目前在食品中也發(fā)現(xiàn)了大量耐藥菌的存在，如：奶粉相關(guān)嬰兒食品中的多重耐藥沙門氏菌(yangetal.2014)、原料奶和冰激凌中的多重耐藥金黃色葡萄球菌(gunetal.2006)等。因此急需一種新的、高效的、安全的抗菌物質(zhì)來控制這些耐藥菌。乳酸菌能夠產(chǎn)生一類具有抗菌活性的多肽物質(zhì)，即抗菌肽(antimicrobialpeptide)，包括核糖體編碼多肽和非核糖體合成多肽。前者稱為細菌素，被廣泛用作生物防腐劑研究?？咕木哂袕V譜抗菌特點，且具有高效、無毒、耐高溫、無殘留等優(yōu)點。隨著抗生素的大量使用，抗生素抗性逐步擴散和進化，目前我國已發(fā)現(xiàn)多種多重耐藥菌，包括直接食用食物中的多耐藥致病菌。因此，如何戰(zhàn)勝耐藥菌，維護人體健康越來越受關(guān)注。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷或不足，本發(fā)明目的在于，提供一株產(chǎn)廣譜抗菌肽的微生物菌株，該菌株能產(chǎn)生多種抗菌肽，尤其的優(yōu)點是能殺死多重耐藥致病菌。所提供菌株耐酸耐膽鹽，具有多種有益人體健康的特性，是一株具有極大利用價值的益生菌。

本發(fā)明的菌株是從新疆牧民家庭傳統(tǒng)發(fā)酵的酸馬奶中分離取得。本菌株是一天然菌株，鑒定為面包乳桿菌，lactobacilluscrustorum，其保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通保藏中心，保藏編號為cgmccno.13613，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏時間：2017年1月13日。

本發(fā)明首次公開了益生菌面包乳桿菌的全基因組序列，從遺傳水平揭露其益生特性。通過聯(lián)合第三代pacbiorsii和第二代illuminahiseq4000測序技術(shù)，測得本發(fā)明菌株的全基因組序列(0gaps)，其含有1條染色體(2,261,471bp)和2條質(zhì)粒(46,788bp和8,220bp)。全基因組序列提交至ncbi的genbank數(shù)據(jù)庫，染色體和質(zhì)粒的accessionnumber分別是cp017996、cp017997和cp017998。

經(jīng)申請人的研究表明，本益生菌能產(chǎn)生至少3種抗菌肽，且所產(chǎn)抗菌肽具有廣譜抗菌活性，能同時殺死革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，包括多重耐藥致病菌。其中3種抗菌肽的氨基酸序列為：

mn047b:egpvgladpdgpasaplgap；

mn047c:gpvgllsspgslppvggap；

mn047d:ksieeamnkllkmsa。

經(jīng)申請人的研究表明，抗菌肽通過引起致病菌細胞壁/細胞膜破損、形成孔洞、細胞質(zhì)物質(zhì)流失導致致病菌死亡。

本發(fā)明的一個目的是提供面包乳桿菌的一種新的制藥用途，本發(fā)明益生菌所產(chǎn)抗菌肽可以以活性菌體或多肽提取物形式用于治療細菌性感染?；钚跃w選用可食載體，可以是一種藥物學合適的載體，如膠囊、片劑或粉末。優(yōu)選可攝食載體是一種食品，如酸奶、酸乳酪、濃縮奶、飲料等。多肽提取物亦可以以液體制劑、凍干粉、片劑、膠囊等形式，也可以摻入到軟膏、洗液、霜膏制劑中作為抗微生物劑。

本發(fā)明的益生菌所產(chǎn)抗菌肽可以用于治療動物或者人類的病原菌感染，感染可以是由下面的任何一種或多種細菌引起：金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、糞腸球菌(enterococcusfaecalis)、單核增生李斯特菌(listeriamonocytogenes)、大腸埃希氏菌(escherichiacoli)、沙門氏菌(salmonella)、阪崎腸桿菌(enterobactersakazakii)、銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)。同時本發(fā)明益生菌所產(chǎn)抗菌肽其廣譜抗菌活性不局限于以上病原菌種屬。

本發(fā)明的益生菌所產(chǎn)抗菌肽用于治療動物或者人類的病原菌感染時，當這些病原菌對抗生素具有抗性時，該抗菌肽依然有效，抗生素抗性包括下面一種或者多種：氨芐青霉素、阿莫西林、阿米卡星、氯霉素、環(huán)丙沙星、先鋒霉素、頭孢哌酮鈉、克拉霉素、頭孢曲松、頭孢呋辛、頭孢西丁、加替沙星、慶大霉素、卡那霉素、左氧氟沙星、二甲胺四環(huán)素、萘啶酸、妥布霉素、氧氟沙星、苯甲異噁唑青霉素、盤尼西林、哌拉西林、利福平、鏈霉素、復方新諾明、四環(huán)素、萬古霉素。同時本發(fā)明益生菌所產(chǎn)抗菌肽作用的抗生素抗性譜不局限于以上抗生素種類。

本發(fā)明的另外一個目的在于益生菌在食品生產(chǎn)加工過程中的應用。本發(fā)明的益生菌所產(chǎn)抗菌肽可以用作生物防腐劑，防止食源性腐敗菌導致的食物腐敗，包括由芽孢桿菌類引起的食物腐敗變質(zhì)。本發(fā)明益生菌對外界環(huán)境壓力具有極強的耐受性，除了酸和膽鹽，還能耐堿、鹽、高溫、低溫、高壓、紫外輻射等，因此在生產(chǎn)加工過程中，能保持一定的活菌數(shù)。

本發(fā)明得到的微生物菌株，是一株新穎的益生菌菌株，它能產(chǎn)生至少3種廣譜抗菌肽，抗菌肽能同時殺死革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，包括多耐藥菌。此外，該菌株具有良好的環(huán)境耐受性。因此，本發(fā)明面包乳桿菌mn047益生菌菌株具有極大的應用價值。

附圖說明

為了更好地理解本發(fā)明及顯示本發(fā)明是如何實施的，現(xiàn)將參考附圖作為示例，其中：

圖1面包乳桿菌mn047全基因組；a為染色體的圈圖；b為質(zhì)粒1的圈圖；c為質(zhì)粒2的圈圖。

圖2抗菌肽的分離純化及抑菌。a1為hiprepqxl16/10陰離子交換柱洗脫曲線及q1抑菌圈，其中q1、q2、q3、q4和q5分別為280nm下的5個吸收峰；a2為resourcerpc反相柱洗脫曲線，其中r1、r2、r3和r4分別為280nm下的4個吸收峰；a3為spsepharosefastflow陽離子交換柱洗脫曲線，其中s1和s2分別為280nm下的2個吸收峰；a4為再一次resourcerpc反相柱洗脫曲線及其抑菌圈,其中p為280nm下的吸收峰；b1為a2獲得4個峰的抑菌圈；b2為a3獲得的2個峰的抑菌圈及緩沖液的抑菌圈。

圖3抗菌肽mn047blc-ms/ms質(zhì)譜序列。

圖4抗菌肽mn047clc-ms/ms質(zhì)譜序列。

圖5抗菌肽mn047dlc-ms/ms質(zhì)譜序列。

圖6金黃色葡萄球菌的掃描電鏡和透射電鏡圖；a1和a2為未經(jīng)抗菌肽處理；b1和b2為經(jīng)過抗菌肽處理。

圖7大腸桿菌的掃描電鏡和透射電鏡圖；a1和a2為未經(jīng)抗菌肽處理；b1和b2為經(jīng)過抗菌肽處理。

具體實施方式

以下是結(jié)合具體實施例來對本發(fā)明進行詳細說明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。

實施例1：本發(fā)明微生物菌株mn047的篩選鑒定

酸馬奶提供了豐富的乳酸菌資源，它是一種傳統(tǒng)發(fā)酵的馬奶飲料，流行于中國(內(nèi)蒙古、新疆、青海)、蒙古、哈薩克斯坦、吉爾吉斯斯坦、俄羅斯等游牧地區(qū)(danovaetal.2005)。酸馬奶以新鮮馬奶為原料，在固有的天然微生物(乳酸菌和酵母菌為主)菌群的作用下自然發(fā)酵而成(montanarietal.1996)。數(shù)百年以來，酸馬奶以促進健康的飲料聞名，它擁有豐富的營養(yǎng)物并具有一定的醫(yī)療保健作用，屬于功能性食品。酸馬奶在我國飲用歷史悠久，據(jù)記載兩千多年前人們已經(jīng)開始飲用酸馬奶。大量研究表明酸馬奶能夠提高消化道系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、腎功能、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等，同時能夠輔助治療肝炎、慢性潰瘍、肺結(jié)核等(wangetal.2008,muetal.2012)。一般認為，酸馬奶的醫(yī)療保健功能與它本身含有的乳酸菌所分泌的抗菌類物質(zhì)有著直接的關(guān)系(xieetal.2011)。

發(fā)明人從新疆傳統(tǒng)發(fā)酵的酸馬奶中，經(jīng)分離、篩選，獲得了一株微生物菌株，該菌株命名為面包乳桿菌mn047(lactobacilluscrustorummn047)。

(1)微生物菌株的分離與篩選：

用滅菌生理鹽水以10倍的稀釋梯度對酸馬奶樣品進行稀釋。分別取100μl10^-4、10^-5、10^-6稀釋度稀釋液涂布到mrs固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)48h。挑取乳酸菌單菌落并進一步采用劃線分離法對特征菌落進行反復地分離純化，記錄各菌落的形態(tài)特征并采用革蘭氏染色鏡檢，觀察。

所述的mrs固體培養(yǎng)基主要成分組成：葡萄糖2％、蛋白胨1％、牛肉膏1％、酵母膏0.5％、乙酸鈉0.5％、吐溫800.1％、檸檬酸氫二胺0.1％、硫酸鎂0.02％、硫酸錳0.005％、瓊脂粉1.5％、蒸餾水。

菌落形態(tài)特征：在mrs瓊脂平板上菌落形狀為圓形、表明光滑且稍微凸起，菌落顏色為淺乳白色。

個體形態(tài)特征：革蘭氏陽性(g+)，短桿狀，單個或成對，無芽孢，無鞭毛。

(2)微生物菌株的鑒定：

將菌株mn047接種于mrs液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12h。按omega的bacterialdnakit試劑盒所示方法提取細菌基因組dna。以乳酸菌基因組dna為模板、27f(5’-agagtttgatcctggctcag-3’)和1495r(5’-ctacggctaccttgttacga-3’)為引物進行16srdna擴增，并對pcr擴增產(chǎn)物進行測序分析。

結(jié)果：共測得1479bp核苷酸，并將該16srdna序列提交至ncbi的genbank(genbankaccessionno.kj152778.1)，它與ncbi數(shù)據(jù)庫中的面包乳桿菌屬(lactobacilluscrustorum)相似度為99％，因此本發(fā)明菌株鑒定為面包乳桿菌。

實施例2：本發(fā)明面包乳桿菌mn047的全基因組序列測定

使用第三代pacbiorsii測序技術(shù)，構(gòu)建20-kb單分子實時(smrt)文庫。得到的原始數(shù)據(jù)使用smrtanalysisv2.3.0軟件的rs_hgapassembly3(pacificbiosciences,usa)進行從頭組裝。產(chǎn)生了3個contig。然后通過illuminahiseq4000獲得的數(shù)據(jù)使用soapsnp和soapindel軟件對contig進行校正。最后得到了一個環(huán)狀染色體和2個環(huán)狀質(zhì)粒(0gaps)。使用glimmer3.02軟件進行基因預測。

結(jié)果：面包乳桿菌mn047全基因組組成：染色體大小為2,261,471bp，平均gc含量為35.02％；質(zhì)粒1大小為46,788bp，平均gc含量為37.91％；質(zhì)粒2大小為8,220bp，平均gc含量為36.19％。全基因組共含有2218個蛋白編碼基因、55個trna基因、12個rrna基因和3個srna基因，具體統(tǒng)計如表1。

表1面包乳桿菌mn047基因組特性

實施例3：本發(fā)明面包乳桿菌mn047的基因功能注釋

對獲得的面包乳桿菌mn047全基因組dna序列，使用nr(non-redundantproteindatabase),swiss-prot,trembl,cog(theclustersoforthologousgroupsofproteins),kegg(thekyotoencyclopediaofgenesandgenomes)和go(geneontology)6個數(shù)據(jù)庫進行blast比對，從而對相應基因進行功能注釋。

結(jié)果：總共2176個基因進行了功能注釋，分為988個cog分類、975個kegg分類和294個go分類(表4，圖1)。其中包括14個耐酸和耐膽鹽功能基因(表2)，28個堿、鹽、高溫、低溫、高壓、紫外輻射等外界環(huán)境壓力耐受功能基因(表3)。

表2面包乳桿菌mn047耐酸和耐膽鹽功能基因及相應基因產(chǎn)物。

表3面包乳桿菌mn047耐堿、鹽、熱、冷、高壓和耐紫外輻射功能基因及相應基因產(chǎn)物。

表4面包乳桿菌mn047蛋白編碼基因功能預測的cog分類

實施例4：本發(fā)明微生物菌株mn047產(chǎn)抗菌肽粗樣的制備及分離純化

(1)抗菌肽粗樣的制備

配制6l的mrs液體培養(yǎng)基，按1％接種量接入mn047菌株，30℃靜置培養(yǎng)72h，離心除去菌體(6000rpm,15min,4℃)，用lmol/lnaoh將上清液ph值調(diào)節(jié)到7.0，以中和有機酸的干擾。加入硫酸銨至飽和度為60％，4℃過夜沉淀，離心除沉淀(10000rpm,15min,4℃)。上清液繼續(xù)加入硫酸銨至飽和度為80％，4℃過夜沉淀，離心(10000rpm,15min,4℃)獲得沉淀，即抗菌肽粗樣。

(2)抗菌肽的分離純化

使用akta純化系統(tǒng)(aktapurifier100,ge,sweden)對抗菌肽進行純化。硫酸銨沉淀獲得的粗抗菌肽首先使用hiprep26/10脫鹽柱脫鹽。脫鹽后的樣品使用hiprepqxl16/10陰離子交換柱分離，在含有1mnacl的ph6.0檸檬酸-磷酸鹽緩沖液中洗脫。然后使用resourcerpc反相柱分離，洗脫過程為100％buffera(95％water,5％acetonitrile,0.1％tfa)到100％bufferb(100％acetonitrile)的線性洗脫。接著使用spsepharosefastflow陽離子交換柱進行分離，緩沖液為ph3.0檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。最后，再一次使用resourcerpc反相柱進行分離。以上過程中，每步分離得到的抑菌活性最好的峰進行下一步分離，活性檢測方法為牛津杯法抑菌實驗(實施例6)，指示菌為金黃色葡萄球菌atcc29213。

結(jié)果：如圖2所示，在整個純化過程中，在通過陰離子交換柱后，只有峰q1具有抑菌活性；將q1峰通過rpc反相柱時，峰r1和r2同時具有抑菌活性；將r2峰通過陽離子交換柱后，峰s1和s2同時具有抑菌活性。由此可見，峰r1、s1和s2三個峰分別含有某一種或多種抗菌肽，即本發(fā)明益生菌菌株能產(chǎn)生至少3種抗菌肽。

實施例5：抗菌肽的鑒定

將實施例3中制備的抗菌肽粗樣使用截留分子量3500的透析袋，在4℃層析柜中透析，收集透過液，真空冷凍干燥濃縮。濃縮后的樣品采用c18固相萃取柱進行純化(活化、平衡、上樣、洗滌、洗脫)，洗脫液冷凍抽干，進行l(wèi)c-ms/ms串聯(lián)質(zhì)譜分析。同時，將實施例3中最后一步純化得到的p峰進行l(wèi)c-ms/ms串聯(lián)質(zhì)譜分析。

lc-ms/ms通過島津公司lc-20ad型號的納升液相色譜儀進行分離，偶聯(lián)q-exactive(thermofisherscientific)質(zhì)譜，離子源為納噴離子源。樣品上樣量為30μl，所用的柱子包括trap柱和分析柱兩部分。分離程序如下：先以8μl/min的流速在4min內(nèi)將樣品loading到trap柱上，緊接著一個總流速為300nl/min的分析梯度將樣品帶入分析柱，分離并傳輸至質(zhì)譜系統(tǒng)。hplc洗脫程序為：5％bufferb(95％can，0.1％fa)，5min；5％bufferb-35％bufferb，35min；35％bufferb-60％bufferb，5min；60％bufferb-80％bufferb，2min；80％bufferb，2min。質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集的主要參數(shù)設置如下：dda(datadependentacquisition)模式進行一級質(zhì)譜(ms)和二級質(zhì)譜(ms/ms)之間自動切換掃描和數(shù)據(jù)采集；一級質(zhì)譜掃描質(zhì)荷比(m/z)范圍為350-1800，采用分辨率為70000；二級質(zhì)譜碎裂模式為hcd(high-energycollisionaldissociation)，選擇二級碎裂的電荷設置為+2價態(tài)以上，碎片離子掃描檢測分辨率為17500；母離子動態(tài)排除設置為：在一半的出峰時間內(nèi)(約8s)，相同母離子的碎裂不超過2次。

獲得的原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用maxquant和mascot軟件進行搜索鑒定，數(shù)據(jù)庫使用mn047全基因組序列、uniprotantimicrobialpeptide和uniprotbacteriocin。

結(jié)果：對mn047全基因組序列鑒定到的可疑抗菌肽序列進行化學合成(上海波泰生物科技有限公司)，并進行抗菌活性驗證。最終確定以下3條抗菌肽：

mn047b:egpvgladpdgpasaplgap(圖3)；

mn047c:gpvgllsspgslppvggap(圖4)；

mn047d:ksieeamnkllkmsa(圖5)。

實施例6：抗微生物活性的測定

(1)抗微生物譜

食源性腐敗菌和食源性致病菌標準菌株及其耐藥菌經(jīng)活化后接種于lb液體培養(yǎng)基中，37℃搖瓶培至對數(shù)期。使用牛津杯法測定抗菌肽對指示菌的抑菌活性。

牛津杯法步驟如下：

將5ml2％無菌瓊脂倒入無菌平皿中使其將平皿底部覆蓋，待凝固后，將4個滅菌后的牛津杯用鑷子等距離放到瓊脂平板上。培養(yǎng)至對數(shù)期的指示菌，使用新鮮的lb液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)菌體濃度至10⁸cfu/ml左右，取1ml指示菌稀釋液加入到冷卻至45℃左右的100ml含有0.75％瓊脂的lb培養(yǎng)基中。混合均勻后，倒入20ml到平板中(不要倒入到牛津杯的孔里)，待完全凝固后，小心地用無菌鑷子夾出牛津杯。用移液槍吸取樣品100μl，分別加入到周圍的3個小孔中，另一孔加入100μlph7.0的檸檬酸磷酸鹽緩沖液作為對照。平板放到4℃下2h，使樣品充分擴散后，轉(zhuǎn)移到37℃下培養(yǎng)12h，觀察抑菌現(xiàn)象，并測量抑菌圈直徑。

上述lb液體培養(yǎng)基主要成分為：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，nacl1％，蒸餾水。

結(jié)果：如表5所示，面包乳桿菌mn047所產(chǎn)抗菌肽具有廣譜抑菌活性。能同時殺死革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，并且能殺死多重耐藥菌。其對多耐藥菌的殺死能力同標準菌相當，故這些耐藥菌對面包乳桿菌mn047所產(chǎn)抗菌肽不具有耐藥性。由此可見，本發(fā)明益生菌mn047所產(chǎn)抗菌肽具有極大的應用價值。

表5抗菌肽的抗微生物譜

am氨芐青霉素、amx阿莫西林、an阿米卡星、c氯霉素、cip環(huán)丙沙星、cf先鋒霉素、cfp頭孢哌酮鈉、clr克拉霉素、cro頭孢曲松、cxm頭孢呋辛、fox頭孢西丁、gat加替沙星、gm慶大霉素、k卡那霉素、lvx左氧氟沙星、mi二甲胺四環(huán)素、na萘啶酸、nn妥布霉素、ofx氧氟沙星、ox苯甲異噁唑青霉素、p盤尼西林、pip哌拉西林、ra利福平、s鏈霉素、sxt復方新諾明、tc四環(huán)素、va萬古霉素。

(2)電子顯微鏡觀察

以標準金黃色葡萄球菌atcc29213和標準大腸桿菌atcc25922分別作為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的代表，利用掃描電鏡來觀察經(jīng)抗菌肽處理后指示菌的形態(tài)變化。指示菌在lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期后離心獲得菌體，并重新懸浮到新鮮的lb液體培養(yǎng)基中，菌體密度約為10⁹cfu/ml。加入抗菌肽至終濃度為10mg/ml后在37℃下培養(yǎng)2h。未加入抗菌肽的指示菌經(jīng)相同處理作為空白對照。

金黃色葡萄球菌結(jié)果：如圖6所示，未經(jīng)處理的金黃色葡萄球菌具有正常的外部結(jié)構(gòu)，細胞壁完整，細胞周圍沒有任何碎片，細胞壁外周輪廓完整光滑無毛刺，細胞膜緊密地附著在細胞壁內(nèi)側(cè)，細胞質(zhì)物質(zhì)的密度均勻。經(jīng)抗菌肽處理2h后的金黃色葡萄球菌細胞形態(tài)發(fā)生明顯的轉(zhuǎn)變，細胞表面變得不規(guī)則、凹凸不平。一方面，細胞質(zhì)物質(zhì)圍繞著細胞膜凝聚或細胞質(zhì)物質(zhì)濃縮，導致細胞內(nèi)出現(xiàn)空白體積，細胞質(zhì)物質(zhì)不再均勻分布；另一方面，細胞內(nèi)物質(zhì)大量滲漏，甚至觀察到有的細胞表面出現(xiàn)大的空洞。

大腸桿菌結(jié)果：如圖7所示，未經(jīng)處理的大腸桿菌具有完整飽滿的外部結(jié)構(gòu)，細胞壁厚度均勻，完整光滑，無褶皺變形，細胞膜緊密地附著在細胞壁內(nèi)側(cè)，細胞質(zhì)物質(zhì)的密度均勻。經(jīng)抗菌肽處理2h后的大腸桿菌細胞壁出現(xiàn)大的凹洞，周圍有小碎片，細胞壁和細胞膜嚴重分離，細胞質(zhì)物質(zhì)濃縮聚集，細胞內(nèi)物質(zhì)滲漏，甚至變空。

由以上之實施例可知，本發(fā)明所提供的益生菌面包乳桿菌mn047所產(chǎn)抗菌肽具有廣譜殺菌活性(包括多重耐藥菌)，具有產(chǎn)業(yè)上的利用價值。

核苷酸序列表電子文件

<110>西北農(nóng)林科技大學

<120>面包乳桿菌、抗菌肽及其應用

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<212>多肽

<213>mn047b

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<212>多肽

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<212>多肽

<213>mn047d

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ksieeamnkllkmsa