本發(fā)明與微生物有關，具體而言，與發(fā)酵菌劑有關，進一步來說，涉及秸稈的發(fā)酵菌劑。
技術背景
作物秸稈的有機質含量高，富含農作物生長所需的營養(yǎng)元素，幾乎不含雜質.是有機肥較佳的原料，由其生產的產品具有較高的農用價值。然而，秸稈類的含碳量較高、c/n比值高，并不適合單獨作為有機肥的原材料，而需要與含碳量較低、c/n比值低的糞便類配合使用。一般軟質作物秸稈的木質素、纖維素、半纖維素含量相對較低，較易腐熟，如水稻、小麥、油菜、玉米等。而硬質秸稈，如谷殼、木屑和樹皮的木質素、纖維素、半纖維素含量較高、c/n在100以上，不易分解，降解時間長，能較長期保持原有的形態(tài)。但黃豆、棉花、煙草等的桿，一般作為水分含量高、c/n比值低的污泥、畜禽糞尿的輔料，需要控制用量，物料粒徑要小，顆粒越細，才能加快降解速度。
對于不同種類的秸稈，要使其加快降解變?yōu)榉柿希瑐鹘y(tǒng)的方法就是通過將秸稈發(fā)酵。有機肥發(fā)酵過程會發(fā)生兩個主要變化，一個是把復雜的有機物質(纖維素、半纖維素、蛋白質等)分解為簡單的無機化合物，這是養(yǎng)分有效化的過程，稱之為礦質化過程；另一個是有機物礦質化過程中形成的中間產物，再合成為比原來更為復雜的腐殖質，稱之為腐殖化過程。眾所周知，發(fā)酵是一個微生物的生化過程，需要使用細菌。不同硬度的秸稈，使用的菌種也不一樣。
經(jīng)檢索，中國專利數(shù)據(jù)庫中涉及發(fā)酵菌或菌劑的專利申請件不很多，檢索到的有zl2006101461458號《栓菌ah28－2固態(tài)發(fā)酵生產漆酶的方法》、2011104132326號《一種大腸埃希氏菌rb3菌株及用它液態(tài)發(fā)酵制備乙酰酯酶的方法》、2014100753519號《一種西瓜用防病高產em菌劑發(fā)酵復合肥料》、2014100752658號《一種西瓜種植用em菌劑發(fā)酵復合肥料》、2015103288138號《一種鴿糞em菌發(fā)酵法》等，這些發(fā)酵菌劑并不能用于秸稈的發(fā)酵。適用于秸稈發(fā)酵的專利申請件有2011102578402號《一種秸稈發(fā)酵復合菌劑及其應用》，系由枯草芽孢桿菌、黃綠木霉、釀酒酵母、米曲霉、擴張青霉、綠色木霉復合而成。目前尚無用于硬質秸稈發(fā)酵菌劑的專利申請件。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明旨在提供一種硬質秸稈發(fā)酵菌劑的配制方法，用以提高硬質秸稈的發(fā)酵速度，從而用于制造有機肥料，為農業(yè)生產服務。
發(fā)明人提供的用于硬質秸稈發(fā)酵菌劑的配制方法包括以下步驟：
第一步，選定菌種：以真菌白腐菌和細菌枯草芽孢桿菌作為配制用于硬質秸稈發(fā)酵菌劑的原料菌種；所述真菌白腐菌購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter,cgmcc)，真菌白腐菌對纖維素降解能力較強；所述細菌枯草芽孢桿菌自行篩選和培養(yǎng)的。
對于選用的原料菌種，都需要通過常規(guī)的手段，測定其對煙草主要病原菌拮抗作用，鑒定選用的活性菌株分子；確定其用于配制混合菌劑的可行性。
第二步，菌種的培養(yǎng)：
(1)真菌白腐菌的培養(yǎng)
①真菌白腐菌母種的培養(yǎng)
事先將玉米粒浸泡72h后裝袋，并于121℃下高壓蒸汽滅菌30-40min后冷卻備用；接著將活化后的白腐菌接種于玉米粒培養(yǎng)基，置恒溫培養(yǎng)箱內28℃培養(yǎng)，等到菌絲長滿整個玉米粒之后備用；
②真菌白腐菌的擴大培養(yǎng)
將培養(yǎng)好的白腐菌母種接入到麥麩棉籽殼混合培養(yǎng)基中，置恒溫培養(yǎng)箱內28℃培養(yǎng)，待培養(yǎng)基表面長滿菌絲后，每48h翻拋1次，直到白腐菌布滿整個麥麩棉籽殼培養(yǎng)基。
(2)細菌枯草芽孢桿菌培養(yǎng)
①枯草芽孢桿菌種子液的制備：將保存的枯草芽孢桿菌菌株在na固體培養(yǎng)基、平板上于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h，然后挑取單菌落于種子培養(yǎng)基中，37℃，170r·min-1條件下培養(yǎng)16h作為種子液。
②枯草芽孢桿菌的固體發(fā)酵：將麥麩與按照質量配比3∶1組成的棉籽殼混合物在121℃、30min間隔滅菌兩次，得到麥麩棉籽殼混合培養(yǎng)基；然后將枯草芽孢桿菌種子液按10％的接種量接入到麥麩棉籽殼混合培養(yǎng)基中，麥麩棉籽殼混合培養(yǎng)基的添加量為20％，含水量為60％，發(fā)酵溫度為28℃，翻拋次數(shù)為1次/24h；實現(xiàn)枯草芽孢桿菌的固體發(fā)酵。
第三步白腐菌、枯草芽孢桿菌混合菌劑的配制
取第二步擴大培養(yǎng)后的白腐菌和擴大培養(yǎng)后的枯草芽孢桿菌按照1∶3的質量配比混合均勻，然后按照每包1000g的量裝入事先消毒殺菌的容器，儲存在陰涼、干燥、通風、避光處、避免和有毒物品一起儲運。在上述儲運條件下保質期18個月。
上述方法第一步中所述測定對煙草主要病原菌拮抗作用，是對煙草黑脛病菌(phytophthoraparasiticavar.nicotiana)、煙草青枯病菌(pseudomonassolanacearum)進行拮抗試驗；所述鑒定選用的活性菌株分子包括pcr擴增、dna序列測定與分析。
上述方法第二步中所述混合培養(yǎng)基是麥麩棉籽殼與棉籽殼按照質量配比3∶1的混合物，在121℃、30min間隔滅菌兩次制得的；所述na固體培養(yǎng)基是用牛肉膏3.0g、nacl5.0g、蛋白胨10.0g、瓊脂15-20g、水1000ml配制而得的，其ph7.2-7.5；所述種子培養(yǎng)基是用牛肉膏3.0g、nacl5.0g、蛋白胨10.0g、水1000ml配制而得的，其ph7.2-7.5。
上述方法第三步中所述容器可以是包裝袋、包裝桶、包裝罐、玻璃瓶中的一種。
為了配制用于硬質秸稈發(fā)酵菌劑，發(fā)明人進行了以下研究與試驗：
1拮抗細菌的分離、純化
1.1樣品的稀釋稱取煙草根際土壤樣品、有機肥各5g(精確到0.01g)，分別加入帶玻璃珠的45ml無菌水中，靜置20min，在旋轉式搖床上200r/min充分振蕩30min，即成樣品母液。對樣品母液進行10倍倍比稀釋。
1.2加樣及培養(yǎng)每個樣品取3個連續(xù)適宜的稀釋度，細菌取10-4、10-5、10-6。分別吸取不同稀釋度樣品懸浮液0.1ml，加至預先制備好的固體na培養(yǎng)基平板上，涂布直至液體被完全吸收，每個梯度3個重復。細菌放置于28℃條件下培養(yǎng)。
1.3分離細菌的純化、保存將分離得到的細菌通過平板劃線法進行純化，并將純化物接入相應的斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
2分離細菌對煙草主要病原菌拮抗作用的測定
2.1指示煙草病原菌的選擇以煙草黑脛病菌(phytophthoraparasiticavar.nicotiana)、煙草青枯病菌(pseudomonassolanacearum)作為靶標病原菌，利用平板對峙培養(yǎng)法和抑菌圈法，對分離得到的細菌進行抑菌活性篩選。
2.2細菌對煙草黑脛病菌的拮抗試驗將供試煙草病原真菌分別在pda平板上活化3d后，用打孔器(直徑6mm)沿供試煙草病原菌菌落邊緣打取菌碟備用，將分離得到的菌株在na培養(yǎng)基平板上活化24h后，用接種環(huán)取一環(huán)優(yōu)勢菌株在pda平板中央劃線，供試煙草病原菌分別接種在pda平板兩側，接種點均距平板中心2.5cm。同時以只接種病原菌的平板為對照，每處理設3次重復，置于25℃光照培養(yǎng)箱中黑暗條件下恒溫培養(yǎng)。培養(yǎng)至第3d時，逐日觀察記載病原菌菌落半徑，根據(jù)菌絲生長抑制率比較各分離菌株對供試煙草病原真菌的抑制效果。
菌落半徑＝測量菌落平均半徑–3.0mm
菌絲生長抑制率(％)＝(對照菌落半徑-處理菌落半徑)/對照菌落半徑×100
2.3細菌對煙草青枯病菌的拮抗試驗將細菌活化后涂布接種在平板上培養(yǎng)24h后，在無菌條件下用6mm打孔器制成菌碟，將菌碟放置于涂布接種有煙草青枯病菌的平板上，28℃培養(yǎng)，每隔12h觀察1次，培養(yǎng)48h后用十字交叉法測定抑菌圈的直徑，每處理重復3次，以無菌的培養(yǎng)基打孔代替菌碟做為對照(ck)。相對抑菌率(％)＝(抑菌圈直徑-菌碟直徑)/菌碟直徑×100％。
2.4細菌對煙草病原菌的拮抗試驗結果
通過平板對峙培養(yǎng)和抑菌圈法篩選獲得1株對煙草青枯病菌、煙草黑脛病菌具有強拮抗作用的菌株，用于下一步鑒定。
3活性菌株的分子鑒定
3.1pcr擴增
采用試劑盒法提取具有明顯抑菌活性細菌菌株的基因組dna(試劑盒購自上海生工生物工程有限公司)。擴增和測序所用的引物為xjf:5’-agagtttgatcatggctcag-3’和xjr:5’-aaggaggtgatccagccgca-3’，由上海生工生物工程有限公司合成。pcr反應采用20μl反應體系，包括模板dna溶液(濃度為50ng/μl)1μl、10×buffer2.0μl、dntp(濃度2.5mm)2.0μl、引物xjf(濃度10μmol/l)和xjr(濃度10μmol/l)各0.5μl、extaqdnapolymerase(5u/μl)0.5μl、加ddh2o至20μl。擴增反應程序為：94℃預變性5min；94℃變性30s、55℃退火30s，72℃延伸90s，33個循環(huán)；最后72℃延伸10min，4℃保存。pcr產物經(jīng)1.0％的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用于膠回收。
3.2dna序列測定與分析
pcr產物用tiangelmidipurificationkit瓊脂糖凝膠dna回收試劑盒回收，再與pmd18t-vector載體(大連takara公司)連接轉化感受態(tài)大腸桿菌，重組質粒純化后交由上海生工生物工程有限公司測序，測序結果用bioedit7.0軟件進行分析，并將dna序列提交于genbank數(shù)據(jù)庫中進行blast同源序列比對。
3.3活性菌株的分子鑒定結果
活性菌株經(jīng)分子鑒定為枯草芽孢桿菌(基因登錄號：kp777596)。
4白腐菌、枯草芽孢桿菌混合菌劑的比例設定
(1)將擴大培養(yǎng)后的白腐菌和擴大培養(yǎng)后的枯草芽孢桿菌分別按照1∶3、2∶3、3∶2、3∶1的比例進行混配，混合均勻后分別測不同配比菌劑的有效活菌數(shù)及蛋白酶酶活和纖維素酶酶活。
(2)4種配比混合菌劑的有效活菌數(shù)及酶活
4種配比混合菌劑的有效活菌數(shù)見表1。由表1可以看出，白腐菌：枯草芽孢桿菌(2∶3)配比濃度的混合菌劑，其真菌數(shù)量4.12×107個/g，細菌數(shù)量1.18×109個/g，其有效活菌數(shù)為1.2212×109。
4種配比混合菌劑的纖維素酶及蛋白酶活性見表2。由表2可看出，白腐菌∶枯草芽孢桿菌(2∶3)配比濃度的混合菌劑纖維素酶及蛋白酶活性分別為77.5715u/g、53.0000u/g，均高于其他配比濃度的混合菌劑。
表14種配比混合菌劑的有效活菌數(shù)檢測結果(個/g)
表24種配比混合菌劑的纖維素酶及蛋白酶活性(u/g)白腐菌：枯草
結合有效活菌數(shù)和兩種酶的活性考慮，選擇白腐菌：枯草芽孢桿菌2∶3為最佳配比濃度。
采用本發(fā)明方法配制的混合菌劑，用于硬質秸稈發(fā)酵菌劑，可有效地提高硬質秸稈的發(fā)酵速度，從而用于制造有機肥料，為農業(yè)生產服務。適用于農業(yè)生產中秸稈的回收利用。
附圖說明
圖1為本發(fā)明的菌劑與天地緣發(fā)酵菌的發(fā)酵溫度對比圖。
具體實施方式
實施例1：配制用于硬質秸稈發(fā)酵菌劑
選定真菌白腐菌和細菌枯草芽孢桿菌為配制用于硬質秸稈發(fā)酵菌劑的原料菌種；真菌白腐菌購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter,cgmcc)；細菌枯草芽孢桿菌自行培養(yǎng)；
對于選用的原料菌種，對煙草黑脛病菌(phytophthoraparasiticavar.nicotiana)、煙草青枯病菌(pseudomonassolanacearum)進行拮抗試驗，測定其對煙草主要病原菌拮抗作用；通過pcr擴增、dna序列測定與分析鑒定選用的活性菌株分子；確定其用于配制混合菌劑的可行性。
接著進行菌種的培養(yǎng)：
(1)真菌白腐菌的培養(yǎng)
①真菌白腐菌母種的培養(yǎng)
事先將玉米粒浸泡72h后裝袋，并于121℃下高壓蒸汽滅菌30-40min后冷卻備用；接著將活化后的白腐菌接種于玉米粒培養(yǎng)基，置恒溫培養(yǎng)箱內28℃培養(yǎng)，等到菌絲長滿整個玉米粒之后備用；
②真菌白腐菌的擴大培養(yǎng)
將培養(yǎng)好的白腐菌母種接入到麥麩棉籽殼混合培養(yǎng)基中，置恒溫培養(yǎng)箱內28℃培養(yǎng)，待培養(yǎng)基表面長滿菌絲后，每48h翻拋1次，直到白腐菌布滿整個麥麩棉籽殼培養(yǎng)基。所述混合培養(yǎng)基是麥麩棉籽殼與棉籽殼按照質量配比3∶1的混合物，在121℃、30min間隔滅菌兩次制得的；
(2)細菌枯草芽孢桿菌培養(yǎng)
①枯草芽孢桿菌種子液的制備：將保存的枯草芽孢桿菌菌株在na固體培養(yǎng)基、平板上于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h，然后挑取單菌落于種子培養(yǎng)基中，37℃，170r·min-1條件下培養(yǎng)16h作為種子液。所述na固體培養(yǎng)基是用牛肉膏3.0g、nacl5.0g、蛋白胨10.0g、瓊脂15-20g、水1000ml配制而得的，其ph7.2-7.5；所述種子培養(yǎng)基是用牛肉膏3.0g、nacl5.0g、蛋白胨10.0g、水1000ml配制而得的，其ph7.2-7.5。
②枯草芽孢桿菌的固體發(fā)酵：將麥麩與按照質量配比3∶1組成的棉籽殼混合物在121℃、30min間隔滅菌兩次，得到麥麩棉籽殼混合培養(yǎng)基；然后將枯草芽孢桿菌種子液按10％的接種量接入到麥麩棉籽殼混合培養(yǎng)基中，麥麩棉籽殼混合培養(yǎng)基的添加量為20％，含水量為60％，發(fā)酵溫度為28℃，翻拋次數(shù)為1次/24h；實現(xiàn)枯草芽孢桿菌的固體發(fā)酵。
最后，進行白腐菌、枯草芽孢桿菌混合菌劑的配制：取擴大培養(yǎng)后的白腐菌和擴大培養(yǎng)后的枯草芽孢桿菌按照2∶3的質量配比混合均勻，然后按照每包50kg的量裝入事先消毒殺菌的包裝袋，制得本發(fā)明的菌劑。
實施例2：實施本發(fā)明的硬質秸稈發(fā)酵菌劑效果案例之一
在安徽省合肥市中國科學技術大學煙草與健康研究中心實驗室利用發(fā)酵箱來驗證白腐菌∶枯草芽孢桿菌(2∶3)在腐熟硬質秸稈(甘蔗渣)上的實施效果。
試驗表明：
1.白腐菌∶枯草芽孢桿菌(2∶3)在用于一種硬質秸稈(甘蔗渣)有機肥發(fā)酵時，發(fā)酵平均溫度分別為33.3℃，高于天地緣發(fā)酵菌(粉劑)(32.4℃)，而且高于50℃溫度天數(shù)達15天，比天地緣發(fā)酵菌(粉劑)多2天。
2.白腐菌∶枯草芽孢桿菌(2∶3)的發(fā)酵菌劑在甘蔗渣有機肥生產中，能促進有機肥中真菌、細菌、放線菌等微生物的生長，并對大腸桿菌、霉菌等微生物以及蛔蟲卵的生長起到一定的抑制作用，提高有機肥成品質量，尤其是甘蔗渣有機肥成品的大腸桿菌達到ny884～2012生物有機肥料標準要求，好于天地緣發(fā)酵菌(粉劑)。
表1可以看出白腐菌∶枯草芽孢桿菌(2∶3)對發(fā)酵過程中有機肥微生物和蛔蟲卵數(shù)量的影響：
表1白腐菌∶枯草芽孢桿菌(2∶3)對發(fā)酵過程中有機肥微生物和蛔蟲卵數(shù)量的影響
3.添加白腐菌∶枯草芽孢桿菌(2∶3)的發(fā)酵菌劑生產的甘蔗渣有機肥成品的有機質、總氮、總磷、總鉀和腐殖酸等養(yǎng)分指標與天地緣發(fā)酵菌(粉劑)相當，達到ny525～2012有機肥料標準要求。但白腐菌∶枯草芽孢桿菌(2∶3)的發(fā)酵菌劑在發(fā)酵前期表現(xiàn)好。
表2白腐菌∶枯草芽孢桿菌(2∶3)對發(fā)酵過程中有機肥主要化學成分的作用
實施例3實施本發(fā)明的硬質秸稈發(fā)酵菌劑效果案例之二
2016年在貴州省興義市豬場坪有機肥工場利用有機肥規(guī)?，F(xiàn)場堆制來驗證白腐菌∶枯草芽孢桿菌(2∶3)在腐熟硬質秸稈(甘蔗渣和煙桿混合材料)有機肥堆制中的實施效果(以當前生產上使用效果較好的商品菌劑作對照)。
規(guī)模示范堆制表明：
⑴在硬質秸稈(甘蔗渣和煙桿)有機肥規(guī)模堆制發(fā)酵過程中，白腐菌∶枯草芽孢桿菌(2∶3)能能提高發(fā)酵溫度(特別是前期發(fā)酵溫度)和高于50℃溫度天數(shù)，有利于物料的分解和腐熟；其中平均發(fā)酵溫度為47.7℃高于天地緣發(fā)酵菌(粉劑)(45.0℃)，且高于50℃溫度天數(shù)為21天，比天地緣發(fā)酵菌(粉劑)多9天。本發(fā)明的菌劑與天地緣發(fā)酵菌的發(fā)酵溫度對比見附圖1。
⑵利用白腐菌∶枯草芽孢桿菌(2∶3)發(fā)酵后的有機肥質量符合ny525-2012農業(yè)部有機肥料行業(yè)標準，且總磷、總鉀、總養(yǎng)分含量和ph分別高于天地緣發(fā)酵菌(粉劑)0.22、0.10、0.30、0.08個百分點。
表1白腐菌∶枯草芽孢桿菌(2∶3)對發(fā)酵后有機肥質量的影響
3白腐菌∶枯草芽孢桿菌(2∶3)發(fā)酵能提高發(fā)酵后有機肥微生物數(shù)量，其中有益微生物細菌、真菌、放線菌數(shù)量數(shù)量分別比天地緣發(fā)酵菌(粉劑)提高23.2％、97.1％、22.2％。
表2白腐菌∶枯草芽孢桿菌(2∶3)對發(fā)酵后有機肥有益微生物數(shù)量的影響