本發(fā)明屬于藥物合成領(lǐng)域，具體涉及一種聚乙二醇化生物素衍生物的制備方法。
背景技術(shù)：
聚乙二醇(polyethyleneglycol，peg)是由環(huán)氧乙烷與水或乙二醇逐步發(fā)生加成聚合而得到的一類分子量較低的水溶性聚醚。小分子量的低聚聚乙二醇為無色、無臭有吸濕性的粘稠液體，分子中既有醚鏈，又有羥基,故具有獨(dú)特的溶解性能,能與水、醇混溶，微溶于醚。單分散長鏈聚乙二醇聚合度一定，分子量一定，結(jié)構(gòu)一定，在醫(yī)藥、材料和工程等領(lǐng)域具有很重要的應(yīng)用前景。例如，在藥物制劑領(lǐng)域，聚乙二醇化的藥物、多肽以及蛋白質(zhì)等可以對藥物的穩(wěn)定性，免疫原性及藥代動力學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生顯著的影響。
生物素又稱維生素h、輔酶r，是水溶性維生素，也屬于維生素b族，b7。它是合成維生素c的必要物質(zhì)，是脂肪和蛋白質(zhì)正常代謝不可或缺的物質(zhì)，是一種維持人體自然生長、發(fā)育和正常人體機(jī)能健康必要的營養(yǎng)素。生物素是20世紀(jì)30年代在研究酵母生長因子和根瘤菌的生長與呼吸促進(jìn)因子時，從肝中發(fā)現(xiàn)的一種可以防治由于喂食生雞蛋蛋白誘導(dǎo)的大鼠脫毛和皮膚損傷的因子。其在肝、腎、酵母、牛乳中含量較多，是生物體固定二氧化碳的重要因素。生物素容易同雞蛋白中一種蛋白質(zhì)結(jié)合，大量食用生蛋白可阻礙生物素的吸收導(dǎo)致生物素缺乏，如脫毛、體重減輕、皮炎等。生物素在脂肪合成、糖質(zhì)新生等生化反應(yīng)途徑中扮演重要角色。
維生素h對于糖原的異生，脂肪酸的綜合作用以及某些氨基酸的新陳代謝，都是一個關(guān)鍵的調(diào)控元件，并且能夠通過幫助能量的產(chǎn)生對某些蛋白質(zhì)的合成起到促進(jìn)作用；同時可協(xié)助細(xì)胞生長、制造脂肪酸、代謝糖類、脂肪及蛋白質(zhì)，且有助于維他命b群的利用；促進(jìn)汗腺、神經(jīng)組織，骨髓、男性性腺的健康；維護(hù)皮膚及毛發(fā)的正常運(yùn)作和生長，減輕濕疹、皮炎癥狀；預(yù)防白發(fā)及脫發(fā)，有助于治療禿頂；緩和肌肉疼痛；對憂郁、失眠確有一定助益；還參與維生素b12、葉酸、泛酸的代謝；促進(jìn)尿素合成與排泄；提高人體的免疫功能。
一方面，將peg與生物素相連接，使得生物素更有益于人體吸收，延長有效期；另一方面，基于生物素為羧化酶的輔酶，參與體內(nèi)脂肪代謝和其他羧化反應(yīng)，腫瘤細(xì)胞的快速增長需要大量生物素，因而在細(xì)胞表面會過量表達(dá)生物素受體，生物素與生物素受體結(jié)合力強(qiáng)，而生物素受體在某些腫瘤細(xì)胞表面高度表達(dá)，遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞中的水平，因而具有良好的腫瘤組織特異性。
基于上述，將靶向分子生物素與短鏈peg相結(jié)合，以擴(kuò)大在生命健康領(lǐng)域及治療腫瘤領(lǐng)域的應(yīng)用，而現(xiàn)有技術(shù)中很少有文獻(xiàn)報道聚乙二醇化生物素衍生物的制備方法及條件。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明將提供一種聚乙二醇化生物素衍生物及其制備方法，該制備方法peg-生物素的合成路線簡單，并得了具有較高的收率和純度聚乙二醇化生物素衍生物。
一種聚乙二醇化生物素衍生物的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟：1)雙羥基聚乙二醇和金屬堿溶于第一有機(jī)溶劑中，滴入丙烯酸叔丁酯，制得羥基聚乙二醇丙酸叔丁酯；2)將得到的羥基聚乙二醇丙酸叔丁酯和堿溶于第一有機(jī)溶劑中，滴加對甲苯磺酰氯進(jìn)行磺酰化反應(yīng)得到對甲苯磺酸酯聚乙二醇丙酸叔丁酯；3)將對甲苯磺酸酯聚乙二醇丙酸叔丁酯溶于第二有機(jī)溶劑中，加入氫氧化銨反應(yīng)得到氨基聚乙二醇丙酸叔丁酯；4)將生物素溶于第三有機(jī)溶劑中，加入n-羥基琥珀酰亞胺，二環(huán)己基碳二亞胺，反應(yīng)得到活化的生物素，生物素-n-琥珀酰亞胺基酯；5)將氨基聚乙二醇丙酸叔丁酯和生物素-n-琥珀酰亞胺基酯溶于第三有機(jī)溶劑，加入堿，反應(yīng)得到生物素-聚乙二醇丙酸叔丁酯；6)將生物素-聚乙二醇丙酸叔丁酯溶于第三有機(jī)溶劑中，加入三氟乙酸，反應(yīng)得到生物素聚乙二醇丙酸，所述生物素聚乙二醇丙酸的結(jié)構(gòu)式為：
進(jìn)一步地，所述第一有機(jī)溶劑為四氫呋喃、二氯甲烷、二氧六環(huán)中的一種。
進(jìn)一步地，所述第二有機(jī)溶劑為二氯甲烷、甲醇、乙醇中的一種。
進(jìn)一步地，所述第三有機(jī)溶劑為二甲基甲酰胺、二氧六環(huán)、二氯甲烷中的一種。
進(jìn)一步地，所述堿為三乙胺、氫氧化鈉、吡啶中的一種。
進(jìn)一步地，所述步驟1)中聚乙二醇、丙烯酸叔丁酯和金屬堿的摩爾比為1：0.55～0.82：0.02～0.04。
進(jìn)一步地，所述步驟1)中金屬堿為鈉、鉀、鋰中的一種。
進(jìn)一步地，所述步驟2)中的磺?；磻?yīng)是于溫度為20℃～40℃，反應(yīng)時間為10～15h的條件下進(jìn)行的。
進(jìn)一步地，所述步驟3)中由對甲苯磺酸酯聚乙二醇丙酸叔丁酯制得氨基聚乙二醇丙酸叔丁酯的反應(yīng)過程是于溫度為20～50℃，時間為24～48h的條件下進(jìn)行的。
本發(fā)明中，以聚乙二醇和生物素為原料，經(jīng)過6步反應(yīng)，將靶向分子生物素與短鏈peg相結(jié)合，得到最終純品，具有制備方法簡單，原料簡單易得，純化簡單等有益效果。
具體實(shí)施步驟
一種聚乙二醇化生物素衍生物的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：1)peg和金屬堿溶于第一有機(jī)溶劑中，滴入丙烯酸叔丁酯，制得羥基聚乙二醇丙酸叔丁酯(oh-peg-tbu)；其中聚乙二醇、丙烯酸叔丁酯和金屬堿的摩爾比為1：0.55～0.82：0.02～0.04；所述金屬堿為鈉、鉀、鋰中的一種。2)將得到的羥基聚乙二醇丙酸叔丁酯和堿溶于第一有機(jī)溶劑中，滴加對甲苯磺酰氯于溫度為20℃～40℃，反應(yīng)時間為10～15h的條件下進(jìn)行磺?；磻?yīng)得到對甲苯磺酸酯聚乙二醇丙酸叔丁酯(toso-peg-tbu)；3)將對甲苯磺酸酯聚乙二醇丙酸叔丁酯(toso-peg-tbu)溶于第二有機(jī)溶劑中，加入氫氧化銨于溫度為20～50℃，時間為24～48h的條件下反應(yīng)得到氨基聚乙二醇丙酸叔丁酯(nh2-peg-tbu)；4)將生物素溶于第三有機(jī)溶劑中，加入n-羥基琥珀酰亞胺，二環(huán)己基碳二亞胺，反應(yīng)得到活化的生物素，生物素-n-琥珀酰亞胺基酯(biotin-nhs)；5)將氨基聚乙二醇丙酸叔丁酯(nh2-peg-tbu)和生物素-n-琥珀酰亞胺基酯(biotin-nhs)溶于第三有機(jī)溶劑，加入堿，反應(yīng)得到生物素-聚乙二醇丙酸叔丁酯(biotin-peg-tbu)；6)將biotin-peg-tbu溶于第三有機(jī)溶劑中，加入三氟乙酸，反應(yīng)得到生物素聚乙二醇丙酸(biotin-peg-cooh)，所述生物素聚乙二醇丙酸的結(jié)構(gòu)式為：
具體的制備路線如下：
,其中n為1-20的整數(shù)。
實(shí)施例1
(1)將100g三甘醇加入至400ml四氫呋喃中，稱取0.36g碎的金屬鈉加入上述溶液中，并室溫攪拌1h。稱取50g丙烯酸叔丁酯滴加到上述反應(yīng)液中，室溫攪拌12h。tlc顯示反應(yīng)結(jié)束，加20ml水淬滅反應(yīng)，旋除溶劑四氫呋喃，再加入300ml水，然后用400ml二氯甲烷萃取3次。無水硫酸鈉干燥二氯甲烷相，旋干，得到約100g粗產(chǎn)物(ho-peg3-tbu)；
(2)將步驟(1)得到的100g粗產(chǎn)物，38g三乙胺加入到400ml二氯甲烷中，攪拌，稱取55g對甲苯磺酰氯溶于150ml二氯甲烷，在冰水浴條件下滴加至反應(yīng)體系中，滴畢，30℃反應(yīng)12h。tlc顯示反應(yīng)結(jié)束，加300ml水洗，分液，無水硫酸鈉干燥有機(jī)相，旋干，得到約150g磺?；拇之a(chǎn)物(toso-peg3-tbu)；
(3)將步驟(2)得到的150g磺酰化的粗產(chǎn)物加入到200ml二氯甲烷中，再加入100ml氫氧化銨，20g四丁基溴化銨，升溫到50℃，攪拌24h。反應(yīng)結(jié)束，旋干，分別用3m鹽酸和氫氧化鈉溶液處理，再用二氯甲烷300ml萃取3次，無水硫酸鈉干燥，旋干，得到22g氨基端的產(chǎn)物(nh2-peg3-tbu)。核磁數(shù)據(jù)如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：3.702(t，j＝6.4hz，2h)；3.652～3.615(m，10h)；3.330(t，j＝4.8hz，2h)；2.853(t，j＝6.8hz，2h)；1.974(s，2h)；1.442(s，9h)；
(4)將50g生物素和24gnhs溶于400ml二甲基甲酰胺中，在冰浴下，分批緩慢加入46g二環(huán)己基碳二亞胺。升溫至50℃，攪拌10h。反應(yīng)結(jié)束，冷卻至室溫，反應(yīng)液緩慢倒入3l飽和食鹽水中，析出白色固體，抽濾，濾餅用甲醇洗2次，干燥后得到40g產(chǎn)品(biotin-nhs)。核磁數(shù)據(jù)如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：6.499(s，1h)；6.429(s，1h)；4.350(t，j＝6.4hz，1h)；4.189(t，j＝4.8hz，1h)；3.156～3.109(m，1h)；2.880(t，j＝4.8hz，1h)；2.720(t，j＝7.2hz，2h)；2.621(d，j＝12.8hz，1h)；2.531(s，1h)；1.707～1.434(m，6h)；
(5)將23gbiotin-nhs和22gnh2-peg3-tbu溶于250ml二甲基甲酰胺中，加入8.8g三乙胺，并室溫攪拌12h。反應(yīng)結(jié)束，反應(yīng)液緩慢倒入1l飽和食鹽水中，500ml二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉干燥，旋干，粗產(chǎn)品用硅膠柱層析分離，得到27g產(chǎn)品，白色固體(biotin-peg3-tbu)。核磁數(shù)據(jù)如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：6.953(s，1h)；6.668(s，1h)；4.546(t，j＝6.4hz，1h)；4.354(t，j＝4.8hz，1h)；3.761(t，j＝6.0hz，2h)；3.629～3.435(m，12h)；3.189(t，j＝4.8hz，1h)；2.946(t，j＝4.8hz，2h)；2.780(d，j＝12.8hz，1h)；2.547(t，j＝5.2hz，2h)；2.282(t，j＝7.2hz，2h)；1.805～1.661(m，4h)；1.440(s，11h)；
(6)將27gbiotin-peg3-tbu溶于300ml二氯甲烷中，加入60ml三氟乙酸，并室溫攪拌5h。反應(yīng)結(jié)束，用飽和碳酸鈉調(diào)ph為中性，再用二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉干燥，旋干，粗產(chǎn)品用硅膠柱層析分離，得到16g產(chǎn)品，白色固體(biotin-peg3-cooh)。核磁數(shù)據(jù)如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：7.870(s，1h)；6.465(s，1h)；6.402(s，1h)；4.346(t，j＝6.4hz，1h)；4.187(t，j＝4.8hz，1h)；3.651(t，j＝6.0hz，2h)；3.607～3.396(m，12h)；3.358(t，j＝4.8hz，1h)；3.180(t，j＝4.8hz，2h)；2.868(d，j＝12.8hz，1h)；2.616(t，j＝5.2hz，2h)；2.108(t，j＝7.2hz，2h)；1.661～1.271(m，6h)。
實(shí)施例2
(1)將100g六甘醇加入至400ml二氧六環(huán)中，稱取0.16g碎的金屬鉀加入上述溶液中，并室溫攪拌1h。稱取25g丙烯酸叔丁酯滴加到上述反應(yīng)液中，室溫攪拌12h。tlc顯示反應(yīng)結(jié)束，加20ml水淬滅反應(yīng)，旋除溶劑二氧六環(huán)，再加入300ml水，然后用400ml二氯甲烷萃取3次。無水硫酸鈉干燥二氯甲烷相，旋干，得到約90g粗產(chǎn)物(ho-peg6-tbu)；
(2)將步驟(1)得到的90g粗產(chǎn)物，19g吡啶加入到400ml二氧六環(huán)中，攪拌，稱取25g對甲苯磺酰氯溶于100ml二氧六環(huán)，在冰水浴條件下滴加至反應(yīng)體系中，滴畢，20℃反應(yīng)15h。tlc顯示反應(yīng)結(jié)束，加300ml水洗，dcm萃取，分液，無水硫酸鈉干燥有機(jī)相，旋干，得到約120g磺?；拇之a(chǎn)物(toso-peg6-tbu)；
(3)將步驟(2)得到的120g磺酰化的粗產(chǎn)物加入到200ml甲醇中，再加入100ml氫氧化銨，20g四丁基溴化銨，升溫到35℃，攪拌36h。反應(yīng)結(jié)束，旋干，分別用3m鹽酸和氫氧化鈉溶液處理，再用二氯甲烷300ml萃取3次，無水硫酸鈉干燥，旋干，得到40g氨基端的產(chǎn)物(nh2-peg6-tbu)。核磁數(shù)據(jù)如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：3.712(t，j＝6.4hz，2h)；3.662～3.610(m，22h)；3.320(t，j＝4.8hz，2h)；2.833(t，j＝6.8hz，2h)；1.955(s，2h)；1.440(s，9h)；
(4)將50g生物素和24gnhs溶于400ml二甲基甲酰胺中，在冰浴下，分批緩慢加入46g二環(huán)己基碳二亞胺。升溫至50℃，攪拌10h。反應(yīng)結(jié)束，冷卻至室溫，反應(yīng)液緩慢倒入3l飽和食鹽水中，析出白色固體，抽濾，濾餅用甲醇洗2次，干燥后得到40g產(chǎn)品，biotin-nhs。核磁數(shù)據(jù)如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：6.499(s，1h)；6.429(s，1h)；4.350(t，j＝6.4hz，1h)；4.189(t，j＝4.8hz，1h)；3.156～3.109(m，1h)；2.880(t，j＝4.8hz，1h)；2.720(t，j＝7.2hz，2h)；2.621(d，j＝12.8hz，1h)；2.531(s，1h)；1.707～1.434(m，6h)；
(5)將12gbiotin-nhs和20gnh2-peg6-tbu溶于250ml二甲基甲酰胺中，加入4.5g三乙胺，并室溫攪拌12h。反應(yīng)結(jié)束，反應(yīng)液緩慢倒入1l飽和食鹽水中，500ml二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉干燥，旋干，粗產(chǎn)品用硅膠柱層析分離，得到21g產(chǎn)品，白色固體(biotin-peg6-tbu)。核磁數(shù)據(jù)如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：6.951(s，1h)；6.663(s，1h)；4.536(t，j＝6.4hz，1h)；4.332(t，j＝4.8hz，1h)；3.721(t，j＝6.0hz，2h)；3.609～3.431(m，24h)；3.180(t，j＝4.8hz，1h)；2.926(t，j＝4.8hz，2h)；2.763(d，j＝12.8hz，1h)；2.527(t，j＝5.2hz，2h)；2.262(t，j＝7.2hz，2h)；1.790～1.641(m，4h)；1.441(s，11h)；
(6)將21gbiotin-peg6-tbu溶于300ml二氯甲烷中，加入60ml三氟乙酸，并室溫攪拌5h。反應(yīng)結(jié)束，用飽和碳酸鈉調(diào)ph為中性，再用二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉干燥，旋干，粗產(chǎn)品用硅膠柱層析分離，得到17g產(chǎn)品，白色固體(biotin-peg6-cooh)。核磁數(shù)據(jù)如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：7.880(s，1h)；6.455(s，1h)；6.395(s，1h)；4.336(t，j＝6.4hz，1h)；4.180(t，j＝4.8hz，1h)；3.641(t，j＝6.0hz，2h)；3.600～3.390(m，24h)；3.348(t，j＝4.8hz，1h)；3.178(t，j＝4.8hz，2h)；2.860(d，j＝12.8hz，1h)；2.607(t，j＝5.2hz，2h)；2.101(t，j＝7.2hz，2h)；1.651～1.269(m，6h)。
實(shí)施例3
(1)將10g十二甘醇加入至100ml二氯甲烷中，稱取13mg碎的金屬鈉加入上述溶液中，并室溫攪拌1h。稱取1.9g丙烯酸叔丁酯滴加到上述反應(yīng)液中，室溫攪拌12h。tlc顯示反應(yīng)結(jié)束，加20ml水淬滅反應(yīng)，旋除溶劑二氯甲烷，再加入100ml水，然后用200ml二氯甲烷萃取3次。無水硫酸鈉干燥二氯甲烷相，旋干，得到約9g粗產(chǎn)物(ho-peg12-tbu)；
(2)將步驟(1)得到的9g粗產(chǎn)物，2g氫氧化鈉加入到100ml四氫呋喃中，攪拌，稱取3.7g對甲苯磺酰氯溶于20ml四氫呋喃，在冰水浴條件下滴加至反應(yīng)體系中，滴畢，40℃反應(yīng)10h。tlc顯示反應(yīng)結(jié)束，加100ml水洗，分液，無水硫酸鈉干燥有機(jī)相，旋干，得到約12g磺?；拇之a(chǎn)物(toso-peg12-tbu)；
(3)將步驟(2)得到的12g磺?；拇之a(chǎn)物加入到50ml乙醇中，再加入100ml氫氧化銨，2g四丁基溴化銨，升溫到20℃，攪拌48h。反應(yīng)結(jié)束，旋干，分別用3m鹽酸和氫氧化鈉溶液處理，再用二氯甲烷200ml萃取3次，無水硫酸鈉干燥，旋干，得到5g氨基端的產(chǎn)物(nh2-peg12-tbu)。核磁數(shù)據(jù)如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：3.652(t，j＝6.4hz，2h)；3.612～3.555(m，46h)；3.301(t，j＝4.8hz，2h)；2.783(t，j＝6.8hz，2h)；1.915(s，2h)；1.422(s，9h)；
(4)將50g生物素和24gnhs溶于400ml二甲基甲酰胺中，在冰浴下，分批緩慢加入46g二環(huán)己基碳二亞胺。升溫至50℃，攪拌10h。反應(yīng)結(jié)束，冷卻至室溫，反應(yīng)液緩慢倒入3l飽和食鹽水中，析出白色固體，抽濾，濾餅用甲醇洗2次，干燥后得到40g產(chǎn)品，biotin-nhs。核磁數(shù)據(jù)如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：6.499(s，1h)；6.429(s，1h)；4.350(t，j＝6.4hz，1h)；4.189(t，j＝4.8hz，1h)；3.156～3.109(m，1h)；2.880(t，j＝4.8hz，1h)；2.720(t，j＝7.2hz，2h)；2.621(d，j＝12.8hz，1h)；2.531(s，1h)；1.707～1.434(m，6h)；
(5)將1.5gbiotin-nhs和3gnh2-peg12-tbu溶于30ml二甲基甲酰胺中，加入0.7g三乙胺，并室溫攪拌12h。反應(yīng)結(jié)束，反應(yīng)液緩慢倒入200ml飽和食鹽水中，100ml二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉干燥，旋干，粗產(chǎn)品用硅膠柱層析分離，得到2.5g產(chǎn)品，白色固體(biotin-peg12-tbu)。核磁數(shù)據(jù)如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：6.961(s，1h)；6.653(s，1h)；4.516(t，j＝6.4hz，1h)；4.325(t，j＝4.8hz，1h)；3.710(t，j＝6.0hz，2h)；3.619～3.423(m，48h)；3.170(t，j＝4.8hz，1h)；2.915(t，j＝4.8hz，2h)；2.749(d，j＝12.8hz，1h)；2.518(t，j＝5.2hz，2h)；2.260(t，j＝7.2hz，2h)；1.788～1.638(m，4h)；1.445(s，11h)；
(6)將2.5gbiotin-peg12-tbu溶于50ml二氯甲烷中，加入10ml三氟乙酸，并室溫攪拌5h。反應(yīng)結(jié)束，用飽和碳酸鈉調(diào)ph為中性，再二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉干燥，旋干，粗產(chǎn)品用硅膠柱層析分離，得到1.5g產(chǎn)品，白色固體(biotin-peg12-cooh)。核磁數(shù)據(jù)如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：7.860(s，1h)；6.450(s，1h)；6.390(s，1h)；4.322(t，j＝6.4hz，1h)；4.169(t，j＝4.8hz，1h)；3.634(t，j＝6.0hz，2h)；3.589～3.376(m，48h)；3.338(t，j＝4.8hz，1h)；3.170(t，j＝4.8hz，2h)；2.851(d，j＝12.8hz，1h)；2.601(t，j＝5.2hz，2h)；2.105(t，j＝7.2hz，2h)；1.641～1.260(m，6h)。
實(shí)施例4
(1)將10g十八甘醇加入至100ml四氫呋喃中，稱取11.4mg碎的金屬鈉加入上述溶液中，并室溫攪拌1h。稱取1.3g丙烯酸叔丁酯滴加到上述反應(yīng)液中，室溫攪拌12h。tlc顯示反應(yīng)結(jié)束，加20ml水淬滅反應(yīng)，旋除溶劑四氫呋喃，再加入300ml水，然后用400ml二氯甲烷萃取3次。無水硫酸鈉干燥二氯甲烷相，旋干，得到約10g粗產(chǎn)物(ho-peg18-tbu)；
(2)將步驟(1)得到的10g粗產(chǎn)物，1.5g三乙胺加入到100ml二氯甲烷中，攪拌，稱取2.5g對甲苯磺酰氯溶于10ml二氯甲烷，在冰水浴條件下滴加至反應(yīng)體系中，滴畢，30℃反應(yīng)12h。tlc顯示反應(yīng)結(jié)束，加100ml水洗，分液，無水硫酸鈉干燥有機(jī)相，旋干，得到約11g磺?；拇之a(chǎn)物(toso-peg18-tbu)；
(3)將步驟(2)得到的11g磺?；拇之a(chǎn)物加入到150ml二氯甲烷中，再加入50ml氫氧化銨，2g四丁基溴化銨，升溫到50℃，攪拌24h。反應(yīng)結(jié)束，旋干，分別用3m鹽酸和氫氧化鈉溶液處理，再用二氯甲烷200ml萃取3次，無水硫酸鈉干燥，旋干，得到7g氨基端的產(chǎn)物(nh2-peg18-tbu)。核磁數(shù)據(jù)如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：3.702(t，j＝6.4hz，2h)；3.652～3.615(m，70h)；3.330(t，j＝4.8hz，2h)；2.853(t，j＝6.8hz，2h)；1.974(s，2h)；1.442(s，9h)；
(4)將50g生物素和24gnhs溶于400ml二甲基甲酰胺中，在冰浴下，分批緩慢加入46gdcc。升溫至50℃，攪拌10h。反應(yīng)結(jié)束，冷卻至室溫，反應(yīng)液緩慢倒入3l飽和食鹽水中，析出白色固體，抽濾，濾餅用甲醇洗2次，干燥后得到40g產(chǎn)品(biotin-nhs)。核磁數(shù)據(jù)如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：6.499(s，1h)；6.429(s，1h)；4.350(t，j＝6.4hz，1h)；4.189(t，j＝4.8hz，1h)；3.156～3.109(m，1h)；2.880(t，j＝4.8hz，1h)；2.720(t，j＝7.2hz，2h)；2.621(d，j＝12.8hz，1h)；2.531(s，1h)；1.707～1.434(m，6h)；
(5)將23gbiotin-nhs和7gnh2-peg18-tbu溶于250ml二甲基甲酰胺中，加入8.8g三乙胺，并室溫攪拌12h。反應(yīng)結(jié)束，反應(yīng)液緩慢倒入1l飽和食鹽水中，500ml二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉干燥，旋干，粗產(chǎn)品用硅膠柱層析分離，得到20g產(chǎn)品，白色固體(biotin-peg3-tbu)。核磁數(shù)據(jù)如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：6.953(s，1h)；6.668(s，1h)；4.546(t，j＝6.4hz，1h)；4.354(t，j＝4.8hz，1h)；3.761(t，j＝6.0hz，2h)；3.629～3.435(m，72h)；3.189(t，j＝4.8hz，1h)；2.946(t，j＝4.8hz，2h)；2.780(d，j＝12.8hz，1h)；2.547(t，j＝5.2hz，2h)；2.282(t，j＝7.2hz，2h)；1.805～1.661(m，4h)；1.440(s，11h)；
(6)將20gbiotin-peg18-tbu溶于300ml二氯甲烷中，加入60ml三氟乙酸，并室溫攪拌5h。反應(yīng)結(jié)束，用飽和碳酸鈉調(diào)ph為中性，再用二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉干燥，旋干，粗產(chǎn)品用硅膠柱層析分離，得到16g產(chǎn)品，白色固體(biotin-peg18-cooh)。核磁數(shù)據(jù)如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：7.870(s，1h)；6.465(s，1h)；6.402(s，1h)；4.346(t，j＝6.4hz，1h)；4.187(t，j＝4.8hz，1h)；3.651(t，j＝6.0hz，2h)；3.607～3.396(m，72h)；3.358(t，j＝4.8hz，1h)；3.180(t，j＝4.8hz，2h)；2.868(d，j＝12.8hz，1h)；2.616(t，j＝5.2hz，2h)；2.108(t，j＝7.2hz，2h)；1.661～1.271(m，6h)。
實(shí)施例5
(1)將10g二十四甘醇加入至100ml四氫呋喃中，稱取2mg碎的金屬鋰加入上述溶液中，并室溫攪拌1h。稱取0.8g丙烯酸叔丁酯滴加到上述反應(yīng)液中，室溫攪拌12h。tlc顯示反應(yīng)結(jié)束，加20ml水淬滅反應(yīng)，旋除溶劑二氯甲烷，再加入100ml水，然后用200ml二氯甲烷萃取3次。無水硫酸鈉干燥二氯甲烷相，旋干，得到約9g粗產(chǎn)物(ho-peg24-tbu)；
(2)將步驟(1)得到的9g粗產(chǎn)物，2g三乙胺加入到100ml二氯甲烷中，攪拌，稱取1.9g對甲苯磺酰氯溶于20ml二氯甲烷，在冰水浴條件下滴加至反應(yīng)體系中，滴畢，40℃反應(yīng)10h。tlc顯示反應(yīng)結(jié)束，加100ml水洗，分液，無水硫酸鈉干燥有機(jī)相，旋干，得到約10g磺?；拇之a(chǎn)物(toso-peg24-tbu)；
(3)將步驟(2)得到的10g磺?；拇之a(chǎn)物加入到50ml甲醇中，再加入50ml氫氧化銨，2g四丁基溴化銨，升溫到20℃，攪拌48h。反應(yīng)結(jié)束，旋干，分別用3m鹽酸和氫氧化鈉溶液處理，再用二氯甲烷200ml萃取3次，無水硫酸鈉干燥，旋干，得到5g氨基端的產(chǎn)物(nh2-peg24-tbu)。核磁數(shù)據(jù)如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：3.652(t，j＝6.4hz，2h)；3.612～3.555(m，94h)；3.301(t，j＝4.8hz，2h)；2.783(t，j＝6.8hz，2h)；1.915(s，2h)；1.422(s，9h)；
(4)將50g生物素和24gnhs溶于400ml二甲基甲酰胺中，在冰浴下，分批緩慢加入46g二環(huán)己基碳二亞胺。升溫至50℃，攪拌10h。反應(yīng)結(jié)束，冷卻至室溫，反應(yīng)液緩慢倒入3l飽和食鹽水中，析出白色固體，抽濾，濾餅用甲醇洗2次，干燥后得到40g產(chǎn)品，biotin-nhs。核磁數(shù)據(jù)如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：6.499(s，1h)；6.429(s，1h)；4.350(t，j＝6.4hz，1h)；4.189(t，j＝4.8hz，1h)；3.156～3.109(m，1h)；2.880(t，j＝4.8hz，1h)；2.720(t，j＝7.2hz，2h)；2.621(d，j＝12.8hz，1h)；2.531(s，1h)；1.707～1.434(m，6h)；
(5)將1.5gbiotin-nhs和5gnh2-peg24-tbu溶于30ml二甲基甲酰胺中，加入0.7g三乙胺，并室溫攪拌12h。反應(yīng)結(jié)束，反應(yīng)液緩慢倒入200ml飽和食鹽水中，100ml二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉干燥，旋干，粗產(chǎn)品用硅膠柱層析分離，得到5g產(chǎn)品，白色固體(biotin-peg24-tbu)。核磁數(shù)據(jù)如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：6.961(s，1h)；6.653(s，1h)；4.516(t，j＝6.4hz，1h)；4.325(t，j＝4.8hz，1h)；3.710(t，j＝6.0hz，2h)；3.619～3.423(m，96h)；3.170(t，j＝4.8hz，1h)；2.915(t，j＝4.8hz，2h)；2.749(d，j＝12.8hz，1h)；2.518(t，j＝5.2hz，2h)；2.260(t，j＝7.2hz，2h)；1.788～1.638(m，4h)；1.445(s，11h)；
(6)將5gbiotin-peg24-tbu溶于50ml二氧六環(huán)中，加入10ml三氟乙酸，并室溫攪拌5h。反應(yīng)結(jié)束，用飽和碳酸鈉調(diào)ph為中性，再二氧六環(huán)萃取，無水硫酸鈉干燥，旋干，粗產(chǎn)品用硅膠柱層析分離，得到4g產(chǎn)品，白色固體(biotin-peg24-cooh)。核磁數(shù)據(jù)如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：7.860(s，1h)；6.450(s，1h)；6.390(s，1h)；4.322(t，j＝6.4hz，1h)；4.169(t，j＝4.8hz，1h)；3.634(t，j＝6.0hz，2h)；3.589～3.376(m，96h)；3.338(t，j＝4.8hz，1h)；3.170(t，j＝4.8hz，2h)；2.851(d，j＝12.8hz，1h)；2.601(t，j＝5.2hz，2h)；2.105(t，j＝7.2hz，2h)；1.641～1.260(m，6h)。