本發(fā)明涉及由多能干細(xì)胞有效且大量地制造在醫(yī)療領(lǐng)域有用的自然殺傷細(xì)胞(以下，有時簡稱為“nk細(xì)胞”)的方法。

背景技術(shù)：

1、已經(jīng)有數(shù)量眾多的關(guān)于由多能干細(xì)胞誘導(dǎo)nk細(xì)胞的方法的報道。迄今為止的報道實(shí)例中，nk細(xì)胞的分化誘導(dǎo)工序以及其后的放大培養(yǎng)工序需要相當(dāng)長的時間，并且使用培養(yǎng)皿等的平面培養(yǎng)(二維培養(yǎng))是主流(參照例如非專利文獻(xiàn)1和2)。專利文獻(xiàn)1中記載了由多能干細(xì)胞球體經(jīng)由造血祖細(xì)胞誘導(dǎo)nk細(xì)胞的方法。但是專利文獻(xiàn)1中記載的多能干細(xì)胞球體的平均粒徑小，而且對利用灌流培養(yǎng)的培養(yǎng)基更換沒有任何記載。

2、現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

3、專利文獻(xiàn)

4、專利文獻(xiàn)1：wo2020/086889

5、非專利文獻(xiàn)

6、非專利文獻(xiàn)1：biochemical?and?biophysical?research?communicationsvolume?515,issue?1,12july?2019,pages?1-8

7、非專利文獻(xiàn)2：methods?mol?biol.2019；2048:107-119.

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、發(fā)明要解決的課題

2、依照迄今為止的報道實(shí)例誘導(dǎo)nk細(xì)胞時，分化誘導(dǎo)工序、放大培養(yǎng)工序需要相當(dāng)長的時間，進(jìn)而培養(yǎng)培養(yǎng)基的更換操作難以實(shí)現(xiàn)機(jī)械化，因此存在人為操作導(dǎo)致最終制品的品質(zhì)受到影響的風(fēng)險。另外，還預(yù)期培養(yǎng)基更換導(dǎo)致工時增加，從而造成制造成本也增加。特別是二維培養(yǎng)的情形中，培養(yǎng)規(guī)模的規(guī)模擴(kuò)大在理論上是有限的。從這樣的背景出發(fā)，需要與現(xiàn)有技術(shù)相比效率良好且可擴(kuò)大規(guī)模的nk細(xì)胞的誘導(dǎo)技術(shù)。

3、用于解決課題的手段

4、本發(fā)明人等進(jìn)行了反復(fù)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過使在三維培養(yǎng)中形成的多能干細(xì)胞的球體的平均粒徑為200μm以上并在該狀態(tài)下組合灌流培養(yǎng)法，可以效率良好且迅速地誘導(dǎo)nk細(xì)胞。另外還得知本方法制造的nk細(xì)胞具有高活性，冷凍解凍后也維持其活性，因此可以用作細(xì)胞藥品的有效成分。

5、本發(fā)明人等基于該見解進(jìn)一步反復(fù)研究，結(jié)果完成了本發(fā)明。

6、即，本發(fā)明如下所述。

7、[項(xiàng)目1]

8、自然殺傷(nk)細(xì)胞的制造方法，其特征在于，該制造方法包括：

9、(1)在第一培養(yǎng)基中形成平均粒徑200μm以上的多能干細(xì)胞球體的工序；

10、(2)通過使用第二培養(yǎng)基的三維培養(yǎng)，將工序(1)中形成的多能干細(xì)胞球體誘導(dǎo)為包含造血祖細(xì)胞的細(xì)胞群的工序；和

11、(3)通過使用第三培養(yǎng)基的三維培養(yǎng)，將工序(2)中所得的包含造血祖細(xì)胞的細(xì)胞群誘導(dǎo)為包含nk細(xì)胞的細(xì)胞群的工序；

12、且通過灌流培養(yǎng)法進(jìn)行工序(1)至(3)。

13、[項(xiàng)目2]

14、根據(jù)項(xiàng)目1所述的方法，其特征在于，在不使用三維培養(yǎng)用載體和細(xì)胞外基質(zhì)的情形下實(shí)施工序(1)至(3)。

15、[項(xiàng)目3]

16、根據(jù)項(xiàng)目2所述的方法，其中，工序(1)中的灌流培養(yǎng)使用細(xì)孔直徑15～75μm的分離膜進(jìn)行。

17、[項(xiàng)目4]

18、根據(jù)項(xiàng)目2所述的方法，其中，工序(2)中的灌流培養(yǎng)使用細(xì)孔直徑45～225μm的分離膜進(jìn)行。

19、[項(xiàng)目5]

20、根據(jù)項(xiàng)目2所述的方法，其中，工序(3)中的灌流培養(yǎng)使用細(xì)孔直徑0.2～10μm的分離膜進(jìn)行。

21、[項(xiàng)目6]

22、根據(jù)項(xiàng)目1～5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，通過連續(xù)的灌流培養(yǎng)法進(jìn)行工序(1)至(3)。

23、[項(xiàng)目7]

24、根據(jù)項(xiàng)目1～6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，第一培養(yǎng)基包含rock抑制劑。

25、[項(xiàng)目8]

26、根據(jù)項(xiàng)目1～7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，第二培養(yǎng)基包含vegf、bmp4和gsk3β抑制劑。

27、[項(xiàng)目9]

28、根據(jù)項(xiàng)目8所述的方法，其中，第二培養(yǎng)基進(jìn)一步包含rock抑制劑或bfgf。

29、[項(xiàng)目10]

30、根據(jù)項(xiàng)目1～7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，第二培養(yǎng)基包含scf、tgfβ/smad抑制劑和vegf。

31、[項(xiàng)目11]

32、根據(jù)項(xiàng)目10所述的方法，其中，第二培養(yǎng)基進(jìn)一步包含rock抑制劑或bfgf。

33、[項(xiàng)目12]

34、根據(jù)項(xiàng)目1～7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，第二培養(yǎng)基包含scf和flt3l。

35、[項(xiàng)目13]

36、根據(jù)項(xiàng)目12所述的方法，其中，第二培養(yǎng)基進(jìn)一步包含選自rock抑制劑、il-3和il-7中的至少一者。

37、[項(xiàng)目14]

38、根據(jù)項(xiàng)目1～7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，工序(2)中的三維培養(yǎng)包括：

39、(2－1)使用包含vegf、bmp4和gsk3β抑制劑的培養(yǎng)基作為第二培養(yǎng)基的培養(yǎng)工序；

40、(2－2)使用包含scf、tgfβ/smad抑制劑和vegf的培養(yǎng)基作為第二培養(yǎng)基的培養(yǎng)工序；和

41、(2－3)使用包含scf和flt3l的培養(yǎng)基作為第二培養(yǎng)基的培養(yǎng)工序。

42、[項(xiàng)目15]

43、根據(jù)項(xiàng)目1～14中任一項(xiàng)所述的方法，其中，第三培養(yǎng)基包含il-15和scf。

44、[項(xiàng)目16]

45、根據(jù)項(xiàng)目15所述的方法，其中，第三培養(yǎng)基進(jìn)一步包含il-7和flt3l。

46、[項(xiàng)目17]

47、根據(jù)項(xiàng)目1～16中任一項(xiàng)所述的方法，其不需要nk細(xì)胞的分選工序。

48、發(fā)明效果

49、本發(fā)明的特征在于，通過利用三維灌流培養(yǎng)的制造方法而有效地一次性制造大量的nk細(xì)胞。通過本發(fā)明的方法制造的nk細(xì)胞對各種癌細(xì)胞顯示高的細(xì)胞抑制活性，即使冷凍，該活性也不會降低而可以維持，因此可以大規(guī)模適用于臨床。

技術(shù)特征：

1.自然殺傷(nk)細(xì)胞的制造方法，其特征在于，該制造方法包括：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在不使用三維培養(yǎng)用載體和細(xì)胞外基質(zhì)的情形下實(shí)施工序(1)至(3)。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，工序(1)中的灌流培養(yǎng)使用細(xì)孔直徑15～75μm的分離膜進(jìn)行。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，工序(2)中的灌流培養(yǎng)使用細(xì)孔直徑45～225μm的分離膜進(jìn)行。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，工序(3)中的灌流培養(yǎng)使用細(xì)孔直徑0.2～10μm的分離膜進(jìn)行。

6.根據(jù)權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，通過連續(xù)的灌流培養(yǎng)法進(jìn)行工序(1)至(3)。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，第一培養(yǎng)基包含rock抑制劑。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，第二培養(yǎng)基包含vegf、bmp4和gsk3β抑制劑。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，第二培養(yǎng)基進(jìn)一步包含rock抑制劑或bfgf。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，第二培養(yǎng)基包含scf、tgfβ/smad抑制劑和vegf。

11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，第二培養(yǎng)基進(jìn)一步包含rock抑制劑或bfgf。

12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，第二培養(yǎng)基包含scf和flt3l。

13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，第二培養(yǎng)基進(jìn)一步包含選自rock抑制劑、il-3和il-7中的至少一者。

14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，工序(2)中的三維培養(yǎng)包括：

15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，第三培養(yǎng)基包含il-15和scf。

16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，第三培養(yǎng)基進(jìn)一步包含il-7和flt3l。

17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其不需要nk細(xì)胞的分選工序。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供新的NK細(xì)胞制造法，其能夠在短時間內(nèi)由多能干細(xì)胞簡便、廉價且安全地大量制造高品質(zhì)的自然殺傷(NK)細(xì)胞。具體地，提供NK細(xì)胞的制造方法，其特征在于，該制造方法包括：(1)在第一培養(yǎng)基中形成平均粒徑200μm以上的多能干細(xì)胞球體的工序；(2)通過使用第二培養(yǎng)基的三維培養(yǎng)，將工序(1)中形成的多能干細(xì)胞球體誘導(dǎo)為包含造血祖細(xì)胞的細(xì)胞群的工序；和(3)通過使用第三培養(yǎng)基的三維培養(yǎng)，將工序(2)中所得的包含造血祖細(xì)胞的細(xì)胞群誘導(dǎo)為包含NK細(xì)胞的細(xì)胞群的工序；且通過灌流培養(yǎng)法進(jìn)行工序(1)至(3)。

技術(shù)研發(fā)人員：倉知建始,山田雅司,木村博信,田村康一
受保護(hù)的技術(shù)使用者：希里歐斯株式會社
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/9/12