本技術(shù)屬于生物，特別涉及用于酵母菌表達的轉(zhuǎn)錄單元和用該轉(zhuǎn)錄單元構(gòu)建的真核表達載體。

背景技術(shù)：

1、可誘導(dǎo)基因表達系統(tǒng)(inducible?gene?expression?system)允許轉(zhuǎn)基因在特定的時間或特定的組織、細胞類型內(nèi)調(diào)控基因的表達水平。可誘導(dǎo)基因表達系統(tǒng)作為一種常用且重要的工具，廣泛應(yīng)用于各種生物學(xué)研究和工業(yè)生產(chǎn)中，包括表達外源基因、對靶基因進行功能分析以及互補實驗等。

2、在酵母表達系統(tǒng)中，目前有兩類主要的誘導(dǎo)系統(tǒng)用于基因表達的調(diào)控。第一類誘導(dǎo)系統(tǒng)依賴于改變酵母代謝途徑來激活不同類型的啟動子，包括常見的半乳糖誘導(dǎo)啟動子和甲醇誘導(dǎo)啟動子(誘導(dǎo)型啟動子是指在某些特定的物理或化學(xué)信號的刺激下，該種類型的啟動子可以大幅度地提高基因的轉(zhuǎn)錄水平)。半乳糖誘導(dǎo)的基因gal1-10啟動子是釀酒酵母最常用的調(diào)控性啟動子，它可以被半乳糖誘導(dǎo)，在培養(yǎng)中需要先進行棉子糖饑餓處理后半乳糖誘導(dǎo)。但這種誘導(dǎo)系統(tǒng)受到葡萄糖含量的抑制，而葡萄糖是正常培養(yǎng)基的碳源，更換培養(yǎng)基耗時耗力。甲醇營養(yǎng)型酵母誘導(dǎo)系統(tǒng)主要應(yīng)用于畢赤酵母(pichia?pastoris)蛋白表達系統(tǒng)，在釀酒酵母中的應(yīng)用較少。

3、第二類誘導(dǎo)系統(tǒng)使用人工設(shè)計的載體，這些載體包括三個基本元件：

4、1.識別特定靶標結(jié)合位點的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域，如gal4蛋白介導(dǎo)的結(jié)合、lexa(調(diào)節(jié)sos反應(yīng)的阻遏蛋白)介導(dǎo)的結(jié)合、tet(四環(huán)素)阻遏蛋白介導(dǎo)的結(jié)合以及鋅指結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的結(jié)合。gal4具有兩個結(jié)構(gòu)域：位于n末端的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域(bd)和位于c末端的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(ad)。dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域(bd)能識別基因啟動子的上游激活序列(upstream?activatingsequence，uas)，轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(ad)可同轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的其他成分作用，啟動基因的轉(zhuǎn)錄。lexa系統(tǒng)中，dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域由一個完整的原核蛋白lexa構(gòu)成，轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域則由一個88個氨基酸的酸性的大腸桿菌多肽b42構(gòu)成，它在酵母中可以活化基因的轉(zhuǎn)錄。gal4和lexa蛋白目前被廣泛用于酵母雙雜交系統(tǒng)，因此需要考慮其他識別不同dna序列的結(jié)合蛋白來構(gòu)建后續(xù)的誘導(dǎo)系統(tǒng)。

5、2.負責調(diào)節(jié)基因表達的小分子響應(yīng)結(jié)構(gòu)域，如銅離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域、四環(huán)素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和雌二醇結(jié)合結(jié)構(gòu)域；tet-on(四環(huán)素)系統(tǒng)是一種利用原核調(diào)控元件在真核細胞中定量并特異地控制外源基因表達的體系，其應(yīng)用的范圍廣泛，與之配套的四環(huán)素分子穩(wěn)定且誘導(dǎo)效率高，但是最新的研究發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素的使用會損傷細胞中的線粒體，可能阻礙了其介導(dǎo)的誘導(dǎo)系統(tǒng)進一步推廣；銅離子介導(dǎo)的誘導(dǎo)系統(tǒng)效率低下。鋅指結(jié)構(gòu)域多樣性程度高，避免了誘導(dǎo)系統(tǒng)對宿主的影響，逐漸成為研究者的首選。

6、3.決定轉(zhuǎn)錄特征和活性的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。包括來自轉(zhuǎn)錄單元oct-1、oct-2a和sp1的富含谷氨酰胺的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，來自轉(zhuǎn)錄單元ctf/nfi和ap-2的富含脯氨酸的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，來自皰疹病毒vp16、gala、p65(nf-xb)和tfe3(轉(zhuǎn)錄單元結(jié)合ighm增強子3)的富含負電荷的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，以及來自itf-1和itf-2(腸三葉因子)的富含絲氨酸/蘇氨酸的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域等。

7、目前在酵母表達系統(tǒng)中，廣泛使用的是vp16(皰疹病毒vp16蛋白)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，但其對游離的載體具有較高的激活背景，本技術(shù)的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)發(fā)展表達高效且背景低的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄單元是需解決的問題。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、通過文獻檢索已發(fā)表的具有轉(zhuǎn)錄激活功能的轉(zhuǎn)錄單元，將轉(zhuǎn)錄單元的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域提取出來，放到pondr網(wǎng)站進行分析，結(jié)果如表1所示，具有轉(zhuǎn)錄激活功能的構(gòu)建體往往含有內(nèi)在無序區(qū)(idr)結(jié)構(gòu)域，序列分析的結(jié)果提示在酵母中，idr結(jié)構(gòu)域可能具有轉(zhuǎn)錄激活功能。

2、表1

3、

4、

5、通過生物信息學(xué)的結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄活性可能依賴于轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域中固有無序蛋白(idps)或固有無序區(qū)域(idrs)。固有無序區(qū)域(idrs)指的是蛋白質(zhì)中缺乏明確定義的三維結(jié)構(gòu)的片段。與具有特定折疊結(jié)構(gòu)的傳統(tǒng)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域不同，idrs具有固有的靈活性和動態(tài)性。這些區(qū)域具有高度的無序性，缺乏穩(wěn)定、有序的構(gòu)象。盡管缺乏固定的結(jié)構(gòu)，idrs在各種細胞過程中發(fā)揮著重要的作用，包括信號傳導(dǎo)、調(diào)控和分子識別。idrs通常與多種蛋白相互作用，使其能夠參與多樣的生物學(xué)功能，如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細胞信號傳導(dǎo)和蛋白質(zhì)相互作用。

6、鑒于目前尚缺乏表達背景低，誘導(dǎo)速度快，目的蛋白表達量高，同時兼容多系統(tǒng)的酵母誘導(dǎo)表達轉(zhuǎn)錄單元。在此，本技術(shù)深入研究了固有無序區(qū)域(idrs)對誘導(dǎo)表達系統(tǒng)的相關(guān)性影響后，繼而提出以下
技術(shù)實現(xiàn)要素：
。

7、本技術(shù)的第一目的，在于提供一種用于真核細胞誘導(dǎo)表達的轉(zhuǎn)錄單元，其包括seqid?no:1所示的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域、seq?id?no:2所示的人類雌激素受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，其中所述轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域包括具有相變能力的固有無序區(qū)域。

8、根據(jù)本技術(shù)中的一些實施方案，固有無序區(qū)域包括且不限于seq?id?no:3所示的核疏蛋白98和/或seq?id?no:4所示的fus蛋白和/或seq?id?no:5所示的taf15蛋白。

9、本技術(shù)的第二目的，在于提供一種用于酵母菌的真核表達載體。

10、根據(jù)本技術(shù)中的一些實施方案，真核表達載體包括本技術(shù)的第一目的中所提供的轉(zhuǎn)錄單元以及啟動子、終止子、真核復(fù)制起始點、多克隆位點、原核復(fù)制起始點和抗生素抗性基因等表達元件。該啟動子能與該誘導(dǎo)表達轉(zhuǎn)錄單元相結(jié)合，隨后激活轉(zhuǎn)錄。

11、本技術(shù)的第三目的，在于提供包括以上誘導(dǎo)表達轉(zhuǎn)錄單元的酵母菌或包括具有該轉(zhuǎn)錄單元的真核表達載體的酵母菌，酵母菌包括且不限于畢赤酵母或釀酒酵母。

12、本技術(shù)的第四目的，提供包含以上轉(zhuǎn)錄單元的酵母菌或包含具有轉(zhuǎn)錄單元的真核表達載體的酵母菌在表達目的蛋白中的應(yīng)用。

13、本技術(shù)的第五目的，在于提供一種誘導(dǎo)蛋白表達的方法。

14、根據(jù)本技術(shù)中的一些實施方案，誘導(dǎo)蛋白表達的方法包括制備和使用包含以上轉(zhuǎn)錄單元的酵母菌或包含具有轉(zhuǎn)錄單元的真核表達載體的酵母菌。

15、根據(jù)本技術(shù)中的一些實施方案，還需先將pcr擴增后的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域片段、人類雌激素受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域片段和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域片段連接到包含啟動子、真核復(fù)制起始點、多克隆位點、原核復(fù)制起始點和抗生素抗性基因的真核表達載體中，構(gòu)建重組誘導(dǎo)表達載體。然后，將重組誘導(dǎo)表達載體轉(zhuǎn)化到酵母感受態(tài)細胞中。然后將酵母感受態(tài)細胞接種到適當?shù)呐囵B(yǎng)基中加入雌二醇誘導(dǎo)，30℃振蕩擴大培養(yǎng)數(shù)小時后，收集菌液、離心去上清和收集菌體。

16、發(fā)明的有益效果

17、本技術(shù)提供的酵母誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄單元，分別融合表達三種具有不同相變能力的idr結(jié)構(gòu)域，通過與vp16陽性對照比較后發(fā)現(xiàn)，三種酵母誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄單元中都展現(xiàn)的表達背景低和表達量高的雙重優(yōu)勢。其中nup98誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄單元的表達背景最低和表達量最高。因此，盡管不同的idr結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄單元的轉(zhuǎn)錄活性有一定差異，但具有idr結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄單元的真核表達載體在釀酒酵母表達系統(tǒng)中均呈現(xiàn)出快速誘導(dǎo)動力學(xué)、精確的表達水平控制、極低的背景表達的絕對優(yōu)勢，并且此類酵母也不需要限定的生長培養(yǎng)基，對于目的蛋白表達的應(yīng)用范圍更大。