本發(fā)明涉及l(fā)-纈氨酸，具體為一種提高l-纈氨酸發(fā)酵產(chǎn)率和糖酸轉(zhuǎn)化率的方法。

背景技術(shù)：

1、纈氨酸化學(xué)名稱為2-氨基-3-甲基丁酸，屬于支鏈氨基酸，是人體必需的8種氨基酸和生糖氨基酸，它能促進(jìn)身體正常生長，修復(fù)組織，調(diào)節(jié)血糖，并提供需要的能量。可用異丁醛作原料合成。為白色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，在水中溶解，在乙醇中幾乎不溶。

2、纈氨酸被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、飼料和化妝品等領(lǐng)域，特別是在醫(yī)藥領(lǐng)域，纈氨酸可用于與其他必需氨基酸配制成復(fù)合氨基酸輸液，尤其是高支鏈氨基酸輸液及口服液，不僅可以提高人體免疫力，還能促進(jìn)病人康復(fù)及手術(shù)后復(fù)原。

3、l-纈氨酸的化學(xué)合成法的特點(diǎn)是生產(chǎn)成本高，反應(yīng)復(fù)雜，步驟多，且有許多副產(chǎn)物，例如異丁醛與氨生成氨基異丁醇，再與氰化氫合成氨基異丁腈，然后水解得到纈氨酸，外消旋體的拆分也有多種方法，例如用酰基-dl-氨基酸的酶進(jìn)行水解，再利用游離氨基酸與?；w的溶解度差進(jìn)行分離。

4、微生物發(fā)酵法生產(chǎn)l-纈氨酸具有原料成本低，反應(yīng)條件溫和及可大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，是一種非常經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)方法。

5、然而現(xiàn)有的l-纈氨酸發(fā)酵產(chǎn)率和發(fā)酵菌的糖酸轉(zhuǎn)化率均相對較低，限制了l-纈氨酸的產(chǎn)量，提高了成本，降低了經(jīng)濟(jì)效益。

6、基于此，我們提出了一種提高l-纈氨酸發(fā)酵產(chǎn)率和糖酸轉(zhuǎn)化率的方法，希冀解決現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、(一)解決的技術(shù)問題

2、針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種提高l-纈氨酸發(fā)酵產(chǎn)率和糖酸轉(zhuǎn)化率的方法。

3、(二)技術(shù)方案

4、為實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

5、一種提高l-纈氨酸發(fā)酵產(chǎn)率和糖酸轉(zhuǎn)化率的方法，將l-纈氨酸發(fā)酵菌接種至含有促進(jìn)劑的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到l-纈氨酸；

6、所述促進(jìn)劑包括：螯合物、b族維生素；

7、所述螯合物、b族維生素混合質(zhì)量比為：3:1-1.6。

8、作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，所述促進(jìn)劑在發(fā)酵培養(yǎng)基中含量為0.5-10.5g/l。

9、作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，所述螯合物制備方法為：

10、首先，將硫酸鋅、氯化鎂依次添加到蒸餾水中，在室溫條件下，以500r/min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行攪拌混合至硫酸鋅、氯化鎂全部溶解，得到混合水溶液；

11、將羥基蛋氨酸、助劑混合物添加到混合水溶液中，調(diào)節(jié)溫度至78℃，以120r/min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行保溫?cái)嚢?0min，然后再添加氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)溫度至80℃，以200r/min的轉(zhuǎn)速繼續(xù)保溫?cái)嚢?小時，再進(jìn)行靜置1小時，然后進(jìn)行抽濾，水洗至中性，真空干燥，得到螯合物；

12、所述混合水溶液中硫酸鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2-3％，其中，氯化鎂與硫酸鋅摩爾比為1：1；

13、所述硫酸鋅、氯化鎂、氯化鎂羥基蛋氨酸、助劑混合物、氫氧化鈉摩爾比為1：1：3：1：3；

14、所述真空干燥溫度為55℃；

15、真空干燥時間為1小時。

16、作為進(jìn)一步的技術(shù)方案：所述助劑混合物制備方法為：

17、首先，將β-丙氨酸添加到甲醇中，攪拌10min，然后再添加氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)溫度至30℃，保溫?cái)嚢?0min，再添加l-組氨酸，繼續(xù)攪拌40min，然后進(jìn)行旋蒸干燥，得到助劑混合物；

18、所述β-丙氨酸、甲醇混合質(zhì)量比為1:10-12；

19、β-丙氨酸與氫氧化鈉溶液混合質(zhì)量比例為1:4-5；

20、所述氫氧化鈉溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.5％；

21、所述β-丙氨酸與l-組氨酸混合質(zhì)量比為3:1。

22、作為進(jìn)一步的技術(shù)方案：所述l-纈氨酸發(fā)酵菌為谷氨酸棒桿菌。

23、作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為：葡萄糖45-58g/l，硫酸錳1-1.5g/l，玉米漿12-15ml/l，氯化銨1-2g/l，磷酸二氫鉀1-1.5g/l，檸檬酸鈉0.8-1.2g/l，鉬酸鈉0.002-0.005g/l，促進(jìn)劑0.5-10.5g/l，活性多肽0.1-0.15g/l；

24、其中，發(fā)酵培養(yǎng)基的ph值為6.9-7.0；

25、所述活性多肽制備方法為：

26、將黑斑蛙進(jìn)行脫皮，得到黑斑蛙皮，將黑斑蛙皮在去離子水中浸泡1小時，然后再反復(fù)清洗10min，取出，切碎，得到黑斑蛙碎皮；

27、將黑斑蛙碎皮與異丙醇進(jìn)行混合到一起，真空浸漬攪拌4小時，然后進(jìn)行過濾，洗滌，低溫干燥，得到與處理黑斑蛙碎皮；

28、其中，黑斑蛙碎皮與異丙醇混合質(zhì)量比為1:12；

29、真空浸漬溫度為4℃，真空度為0.2pa；

30、低溫干燥溫度為4℃；

31、將預(yù)處理黑斑蛙碎皮與去離子水進(jìn)行混合均勻，然后添加到打漿機(jī)中，進(jìn)行打漿處理20min，得到碎皮漿液；

32、預(yù)處理黑斑蛙碎皮與去離子水混合質(zhì)量比為1:4；

33、向碎皮漿液中添加中性蛋白酶，進(jìn)行酶解處理8小時，得到酶解液；

34、以碎皮漿液總質(zhì)量計(jì)，中性蛋白酶添加量2％；其中酶解處理的溫度為42℃；

35、對酶解液進(jìn)行滅酶處理：在95℃水浴中加熱10min；

36、經(jīng)過滅酶處理后，再進(jìn)行離心處理，取上清液；

37、其中，離心處理轉(zhuǎn)速為10000r/min，時間為10min；

38、對上清液進(jìn)行冷凍干燥，得到活性多肽。

39、作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，所述玉米漿制備方法為：

40、首先，稱取新鮮玉米粒，將新鮮玉米粒添加到亞硫酸溶液中，進(jìn)行浸泡處理，其中，浸泡處理分兩個階段，包括普通浸泡階段與真空浸泡階段；

41、其中，先進(jìn)行普通浸泡階段再進(jìn)行真空浸泡階段，普通浸泡階段時間為35-40小時，真空浸泡時間為10-15小時；

42、其中普通浸泡階段溫度為48℃，真空浸泡階段溫度為51℃，真空度為0.1-0.2pa；

43、經(jīng)過浸泡完成后，再進(jìn)行過濾，濾膜孔徑為0.055μm，得到過濾液；

44、對過濾液進(jìn)行濃縮，得到波美度為20的玉米漿，再進(jìn)行滅菌，即可；

45、所述亞硫酸溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.22-0.26％；

46、其中，玉米粒、亞硫酸溶液混合比例為20-25g：230ml。

47、作為進(jìn)一步的技術(shù)方案：所述滅菌為采用121℃蒸汽滅。

48、作為進(jìn)一步的技術(shù)方案：所述發(fā)酵的溫度為30-36℃，發(fā)酵時間為30-35小時。

49、作為進(jìn)一步的技術(shù)方案：所述b族維生素包括維生素b1與維生素b12；

50、所述維生素b1與維生素b12混合質(zhì)量比為1:3。

51、(三)有益效果

52、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種提高l-纈氨酸發(fā)酵產(chǎn)率和糖酸轉(zhuǎn)化率的方法，具備以下有益效果：

53、本發(fā)明提供的l-纈氨酸發(fā)酵方法，對于l-纈氨酸的發(fā)酵產(chǎn)量與糖酸轉(zhuǎn)化率均具有明顯的提高，從而提高了經(jīng)濟(jì)效益。

54、本發(fā)明技術(shù)方案中的l-纈氨酸通過谷氨酸棒狀桿菌進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)而得到，采用現(xiàn)有的發(fā)酵方法會存在糖酸轉(zhuǎn)化率不高的問題，因此，本發(fā)明通過對發(fā)酵培養(yǎng)基成分以及用量進(jìn)行了改進(jìn)，通過引入了特制的玉米漿與促進(jìn)劑，能夠大幅度的改善了糖酸轉(zhuǎn)化率不高的問題，明顯的提高了糖酸轉(zhuǎn)化率，進(jìn)而提高了l-纈氨酸的產(chǎn)量。

55、通過促進(jìn)劑的引入，能夠起到對谷氨酸棒桿菌代謝調(diào)控具有一定程度的影響，通過調(diào)控，能夠改變特定酶活力的高低，進(jìn)而，起到重新分配碳架物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的流向，能夠優(yōu)先的分配到l-纈氨酸合成路徑中，進(jìn)而提高l-纈氨酸的發(fā)酵產(chǎn)量。

56、l-纈氨酸合成主要以丙酮酸為前體物質(zhì)，經(jīng)過一系列的反應(yīng)，最終合成l-纈氨酸，因此，丙酮酸會影響到最終l-纈氨酸的產(chǎn)量，本發(fā)明在發(fā)酵培養(yǎng)基中，主要通過促進(jìn)劑中螯合物與b族維生素的協(xié)同作用，能夠加強(qiáng)表達(dá)丙酮酸生物合成途徑關(guān)鍵酶基因(包括：轉(zhuǎn)酮醇酶基因tkt、轉(zhuǎn)醛酶基因tal、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因pck)增加合成丙酮酸前體物的供應(yīng),從而加速了丙酮酸的合成，為后續(xù)l-纈氨酸合成的一系列反應(yīng)打下牢固的基礎(chǔ)。在發(fā)酵過程中，促進(jìn)劑與玉米漿中的玉米核黃素的配合會對乙酰羥酸合成酶、乙酰羥酸異構(gòu)還原酶、二羥酸脫水酶和支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的活性具有一定的提高效果，而乙酰羥酸合成酶、乙酰羥酸異構(gòu)還原酶、二羥酸脫水酶和支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶又參與l-纈氨酸的一系列合成反應(yīng)，加速了反應(yīng)的進(jìn)行，尤其是提高了糖酸轉(zhuǎn)化率，能夠促進(jìn)l-纈氨酸的合成的進(jìn)程，縮短了整個發(fā)酵周期，起到了在有限的時間內(nèi)，大幅度的提高了l-纈氨酸的產(chǎn)率，經(jīng)濟(jì)效益明顯。

57、本發(fā)明通過引入了活性多肽，作為小分子蛋白質(zhì)片段，含有豐富的氮源和生長因子，能夠直接被發(fā)酵菌吸收利用，從而促進(jìn)發(fā)酵菌的快速生長和繁殖。同時，它們還能激活發(fā)酵菌菌體內(nèi)的酶系統(tǒng)，加速代謝過程，為l-纈氨酸的合成提供更多的前體和能量。

58、由于l-纈氨酸的生物合成是一個復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)，涉及多個中間產(chǎn)物和酶的參與，同構(gòu)引入的本發(fā)明制備的活性多肽能夠通過調(diào)控關(guān)鍵酶的活性和表達(dá)水平，優(yōu)化代謝流向，使更多的碳源流向l-纈氨酸的合成路徑，從而提高產(chǎn)量，此外，還可能減少副產(chǎn)物的生成，進(jìn)一步提高l-纈氨酸的純度。

59、由于本發(fā)明制備的活性多肽具有一定的改善細(xì)胞膜通透性的功能，這有助于營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入發(fā)酵菌細(xì)胞和代謝產(chǎn)物排出細(xì)胞，從而提高整個發(fā)酵過程的效率，特別是在l-纈氨酸的分泌階段，增強(qiáng)的細(xì)胞膜通透性可以促進(jìn)l-纈氨酸的快速釋放到胞外，避免其在細(xì)胞內(nèi)積累造成的反饋抑制。