本發(fā)明涉及分子生物學(xué)以及基因工程相關(guān)，特別是一種具有提高植物抗真菌侵染能力的岷江百合類(lèi)黃酮3'-羥化酶基因 lrf3'h及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、病毒、細(xì)菌和真菌等病原微生物常年危害植物，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)巨大損失，其中，真菌性病害占比在70%以上（高游慧,?鄭澤慧,?張?jiān)?，??根際微生態(tài)防治作物土傳真菌病害的機(jī)制研究進(jìn)展.?農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),?2021,?26(6):?100-113.）。病原真菌侵染植物的根、莖、葉、果實(shí)等部位，在植物的整個(gè)生長(zhǎng)周期均可致病，癥狀為組織的壞死、腐爛、萎蔫等。真菌病害的發(fā)生影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，導(dǎo)致植物的減產(chǎn)和品質(zhì)的降低?；瘜W(xué)防治是農(nóng)業(yè)上控制植物真菌病害的主要方法，但隨著農(nóng)藥的大量反復(fù)使用，不僅誘發(fā)了病原菌的抗藥性，而且農(nóng)藥殘留帶來(lái)的食品安全和環(huán)境污染等問(wèn)題也日益嚴(yán)重。因此，使用綠色、高效、安全的防治方法是必然趨勢(shì)。轉(zhuǎn)基因技術(shù)作為一項(xiàng)先進(jìn)的生物科學(xué)技術(shù)，用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中可以培育出抗性品種，大量減少農(nóng)藥的使用，改善作物的生長(zhǎng)性狀，對(duì)于農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展有巨大益處。

2、植物的次生代謝物是為應(yīng)對(duì)環(huán)境變化產(chǎn)生的重要物質(zhì)。植物的次生代謝產(chǎn)物種類(lèi)繁多，大約有10萬(wàn)種物質(zhì)。類(lèi)黃酮代謝物普遍具有防御功能、化感作用、阻止病蟲(chóng)害入侵作用、抗紫外線(xiàn)作用，還具有抗氧化作用（葛詩(shī)蓓,?張學(xué)寧,?韓文炎,?等.?植物類(lèi)黃酮的生物合成及其抗逆作用機(jī)制研究進(jìn)展.?園藝學(xué)報(bào),?2023,?50(01):?209-224.）?；诮Y(jié)構(gòu)的差異，類(lèi)黃酮通常分為七個(gè)亞類(lèi)：黃酮醇、黃酮、異黃酮、花青素、黃烷酮、黃烷醇和查耳酮。類(lèi)黃酮作為一類(lèi)植物抵御病原菌的一類(lèi)抗菌化合物，通過(guò)引起微生物膜裂解或破裂、抑制生物膜形成、抑制細(xì)胞的膜合成、抑制核酸合成、干擾電子傳遞鏈和atp合成等作用機(jī)制抑制真菌的生長(zhǎng)繁殖（shen?n,?wang?t,?gan?q,?et?al.?plant?flavonoids:classification,?distribution,?biosynthesis,?and?antioxidant?activity.?foodchemistry,?2022,?383:?132531.）。櫻花素是類(lèi)黃酮代謝物，是一種酚類(lèi)植物抗毒素，對(duì)稻瘟病菌（ magnaporthe?oryzae）具有抗菌活性，可以抑制稻瘟病菌效應(yīng)蛋白的胞吞并增強(qiáng)水稻對(duì)稻瘟病抗性（jiang?l,?zhang?x,?zhao?y,?et?al.?phytoalexin?sakuranetinattenuates?endocytosis?and?enhances?resistance?to?rice?blast.?naturecommunications,?2024,?15(1):?3437.）。

3、類(lèi)黃酮3'-羥化酶（flavonoid?3'-hydroxylase,?f3'h）是細(xì)胞色素p450家族的成員，在類(lèi)黃酮生物合成途徑中，b環(huán)羥基化模式由屬于p450家族的兩種單加氧酶決定，即類(lèi)黃酮3'-羥化酶（f3'h）和類(lèi)黃酮3'5'-羥化酶（f3'5'h）。類(lèi)黃酮生物合成中的關(guān)鍵酶f3'h可以催化柚皮素（naringenin）和二氫山萘酚（dihydrokaempferol）的b環(huán)3'位置羥基化，生成圣草酚(eriodictyol)和二氫槲皮素（dihydroquercetin），這兩種產(chǎn)物是花青素和原花青素生物合成的重要前體（liu?x,?gong?q,?zhao?c,?et?al.?genome-wide?analysis?ofcytochrome?p450?genes?in citrus?clementinaand?characterization?of?a?cyp?geneencoding?flavonoid?3'-hydroxylase.?horticulture?research,?2023,?10(2):uhac283.）。植物中花青素含量以及植物體的顏色狀態(tài)與 f3'h基因表達(dá)水平有關(guān)，西蘭花 f3'h表達(dá)量的降低減少了花青素和飛燕草素的積累（gu?h,?yu?h,?wang?j,?et?al.?a?43bp-deletion?in?the f3'hgene?reducing?anthocyanins?is?responsible?for?keepingbuds?green?at?low?temperatures?in?broccoli.?international?journal?ofmolecular?sciences,?2023,?24(14):?11391）。杜鵑花在不同花期和不同組織中調(diào)節(jié) f3'h基因的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)花青素的含量，過(guò)表達(dá) f3'h基因會(huì)導(dǎo)致花瓣中花青素含量的顯著增加（吳澤航等.?比利時(shí)杜鵑花類(lèi)黃酮3'-羥化酶（f3'h）基因克隆及功能分析.?生物技術(shù)通報(bào),2024,?40(06):?251-259.）。

4、百合是百合科（liliaceae）百合屬（ lilium）所有種、亞種、變種、變型和品種的統(tǒng)稱(chēng)，為多年生球根花卉。百合在中國(guó)有著悠久的栽培歷史，分布廣泛。近年來(lái)，其種植面積逐年擴(kuò)大，發(fā)展迅速，然而在百合生產(chǎn)過(guò)程中，病害的威脅成為了制約其產(chǎn)量的重要因素。其中，真菌病害尤為突出，主要包括枯萎病、灰霉病和炭疽病。特別是百合枯萎病發(fā)病頻繁、危害嚴(yán)重，受到廣泛的關(guān)注?？菸≈饕社牭秾伲? fusarium?spp .）真菌引起，可引起百合葉片、根和莖的腐爛。感染枯萎病的百合植株矮小，發(fā)病初期植株下部葉片先死亡,向上發(fā)展后,上部葉片也死亡。感染后，其地下部分，根轉(zhuǎn)變?yōu)榈厣?，并腐爛，嚴(yán)重時(shí)整個(gè)鱗莖腐爛，從而引起莖根腐爛，致使植株死亡（鄧杰玲,?黃鳳玲，陸杰思,?等.?觀賞百合主要病蟲(chóng)害綜合防治技術(shù).?農(nóng)業(yè)研究與應(yīng)用,?2016,?(06):?69-71.）。岷江百合（ lilium?regalewilson）原產(chǎn)于中國(guó)，僅分布于岷江流域海拔800～2700?m的河谷到山腰的巖石縫中，對(duì)枯萎病具有極強(qiáng)的抗性，是現(xiàn)代百合育種的重要種質(zhì)資源。類(lèi)黃酮合成途徑與植物的防御機(jī)制密切相關(guān)，類(lèi)黃酮3'-羥化酶作為類(lèi)黃酮次生代謝物生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，對(duì)岷江百合中 lrf3'h基因的發(fā)掘及功能分析具有重要的研究意義及應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種岷江百合類(lèi)黃酮3'-羥化酶基因 lrf3'h及其在提高煙草對(duì)草莖點(diǎn)霉（ phoma?herbarum）及茄鏈格孢（ alternaria?solani）抗性中的應(yīng)用。

2、本發(fā)明從岷江百合中克隆獲得類(lèi)黃酮3'-羥化酶基因 lrf3'h， lrf3'h核苷酸序列如seq?id?no:1所示，該基因cdna全長(zhǎng)序列為740bp，包含一個(gè)426bp的開(kāi)放閱讀框、284bp的5’非翻譯區(qū)、30bp的3’非翻譯區(qū)，編碼如seq?id?no:2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。

3、本發(fā)明中 lrf3'h基因的編碼區(qū)是序列表seq?id?no:1中第285-710位所示的核苷酸序列。

4、本發(fā)明分離克隆岷江百合的一個(gè)類(lèi)黃酮3'-羥化酶基因 lrf3'h的完整cdna片段，利用根癌農(nóng)桿菌（ agrobacterium?tumefaciens）介導(dǎo)將目的基因轉(zhuǎn)入受體植物中并過(guò)量表達(dá)，通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該基因是否具有提高植物抗真菌的活性，為后期利用該基因改良煙草及其他植物抵御真菌病害的能力奠定基礎(chǔ)，發(fā)明人將這個(gè)基因命名為 lrf3'h。

5、上述 lrf3'h基因應(yīng)用于提高煙草的抗真菌特性，具體操作如下：

6、（1）采用擴(kuò)增 lrf3'h的特異引物，從岷江百合根中提取總rna，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse?transcription-polymerase?chain?reaction，rt-pcr）擴(kuò)增出 lrf3'h的全長(zhǎng)編碼區(qū)，然后將其連接到pgem-t載體上，經(jīng)測(cè)序獲得具有目的基因的克?。?

7、（2）用限制性?xún)?nèi)切酶 ecori和 bamhi酶切pgem-t- lrf3'h載體，通過(guò)膠回收得到目的基因片段，用同樣的內(nèi)切酶酶切植物表達(dá)載體pcambia2300s，膠回收獲得所需載體大片段，再將所獲得 lrf3'h基因片段與pcambia2300s片段連接，構(gòu)建植物超表達(dá)載體，之后將所構(gòu)建的重組載體通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入煙草中表達(dá)；

8、（3）以重組載體t-dna上具有的抗性標(biāo)記篩選轉(zhuǎn)化子，并通過(guò)pcr檢測(cè)得到真正的轉(zhuǎn)基因植株，分析轉(zhuǎn)基因植株抗真菌侵染的能力，最后篩選出對(duì)真菌抗性明顯增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株。

9、本發(fā)明通過(guò)基因工程手段培育抗病植物可以克服傳統(tǒng)育種的不足，不僅育種周期縮短，而且操作簡(jiǎn)單，容易獲得高抗材料。本發(fā)明來(lái)自岷江百合的 lrf3'h基因能增強(qiáng)植物對(duì)真菌的抗性，將該基因?qū)霟煵葜?，可以產(chǎn)生具有真菌抗性的新品種和新材料。利用基因工程技術(shù)培育抗性植物品種和材料具有明顯的優(yōu)勢(shì)和不可取代的重要性；它不僅可以為大規(guī)模生產(chǎn)農(nóng)作物、藥材、園藝植物等提供方便，大量減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，還可以為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)節(jié)約成本、減小環(huán)境污染，為提高植物對(duì)真菌病害的抗性提供了一種新的方法，因此本發(fā)明具有廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景。