與非生物性脅迫反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)、其編碼基因及用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種與非生物性脅迫反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途，特別是 涉及一種來(lái)源于高粱的耐鹽蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，世界上有至少20%的耕地和超過(guò)50%的灌溉土地在不同程度上 受到鹽脅迫的影響，而鹽脅迫作為非生物性脅迫的一種，是植物生長(zhǎng)和產(chǎn)量的主要限制性 因素，可引起植物體內(nèi)產(chǎn)生一系列的生理和代謝反應(yīng)，從而造成植物死亡或減產(chǎn)。由于大多 數(shù)植物尤其是農(nóng)作物屬于對(duì)鹽脅迫敏感的甜土植物，因此鹽脅迫已經(jīng)嚴(yán)重的影響了全球的 糧食產(chǎn)量。而實(shí)踐證明，改良鹽漬土是一項(xiàng)復(fù)雜、難度大、用時(shí)長(zhǎng)的工作，故揭示植物應(yīng)對(duì)鹽 脅迫的機(jī)制，并據(jù)此提高植物的耐鹽能力，已經(jīng)成為促進(jìn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要基礎(chǔ)。
[0003] 近幾年研宄表明，植物的耐鹽性在本質(zhì)上復(fù)雜并涉及細(xì)胞適應(yīng)的多重機(jī)制以及多 種代謝途徑，植物要達(dá)到離子平衡，必須要進(jìn)行三方面相互聯(lián)系的調(diào)節(jié)，首先必須防止植物 收到毒害，其次植物在逆境下要重建一個(gè)平衡的體內(nèi)環(huán)境，最后生長(zhǎng)必須可以恢復(fù)。植物耐 鹽的復(fù)雜性使得利用傳統(tǒng)育種的方法來(lái)提高作物的耐鹽能力十分困難，因而使用生物技術(shù) 方法從遺傳上設(shè)計(jì)耐鹽作物成為當(dāng)前農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的研宄熱點(diǎn)。
[0004] 迄今為止，已有許多與植物耐鹽相關(guān)的基因被克隆研宄，包括編碼各種有機(jī)溶質(zhì) 合成酶的基因：如參與脯氨酸合成的P5CS基因、與甜菜堿合成有關(guān)的基因、與甘露醇合成 有關(guān)的基因；LEA蛋白基因；具有抗氧化脅迫作用的過(guò)氧化酶基因等，但大多需要與其它多 個(gè)耐鹽基因共同作用才可能獲得較為理想的耐鹽效果。因此需要從不同種類(lèi)的植物中有目 的地克隆其它不影響植物正常生長(zhǎng)的耐鹽基因，以期獲得具有良好耐鹽性的作物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種與非生物性脅迫反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)、其編碼基因及用 途，所述耐鹽蛋白可以在植物中（如擬南芥）表達(dá)，并使轉(zhuǎn)基因植物具有較好的耐鹽性，對(duì) 于農(nóng)作物改良和培育耐鹽品種具有重要意義。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種與非生物性脅迫反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)，包括：
[0007] (a)具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或
[0008] (b)在（a)中的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且 具有耐受非生物脅迫活性的由（a)衍生的蛋白質(zhì)。
[0009] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種與非生物性脅迫反應(yīng)相關(guān)的基因，包括：
[0010] (a)編碼所述與非生物性脅迫反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或
[0011] (b)在嚴(yán)格條件下與（a)限定的核苷酸序列雜交且編碼具有耐受非生物脅迫活性 的蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或
[0012] (C)具有SEQIDNO: 1所示的核苷酸序列。
[0013] 所述嚴(yán)格條件可為在6XSSC(檸檬酸鈉）、0. 5 %SDS(十二烷基硫酸鈉）溶液中， 在65°C下雜交，然后用2XSSC、0. 1%SDS和1XSSC、0. 1%SDS各洗膜1次。
[0014] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種表達(dá)盒，包含在有效連接的調(diào)控序列調(diào)控 下的所述與非生物性脅迫反應(yīng)相關(guān)的基因。
[0015] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種包含所述與非生物性脅迫反應(yīng)相關(guān)的基因 或所述表達(dá)盒的重組載體。
[0016] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生耐鹽植物的方法，包括：將所述與非生 物性脅迫反應(yīng)相關(guān)的基因或所述表達(dá)盒或所述重組載體導(dǎo)入植物。
[0017] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種賦予植物鹽耐受性的方法，包括：將所述與 非生物性脅迫反應(yīng)相關(guān)的基因或所述表達(dá)盒或所述重組載體導(dǎo)入植物，使導(dǎo)入后的植物產(chǎn) 生足夠量的蛋白質(zhì)以賦予其鹽脅迫耐受性。
[0018] 優(yōu)選地，所述植物為擬南芥、高粱、玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。
[0019] 在本發(fā)明中，將所述與非生物性脅迫反應(yīng)相關(guān)的基因或所述表達(dá)盒或所述重組載 體導(dǎo)入植物，常規(guī)轉(zhuǎn)化方法包括但不限于，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、微量發(fā)射轟擊、直接將DNA 攝入原生質(zhì)體、電穿孔或晶須硅介導(dǎo)的DNA導(dǎo)入。
[0020] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種增加植物產(chǎn)量的方法，包括：在含鹽的土地 上種植耐鹽植物，所述耐鹽植物為所述方法所產(chǎn)生的植物，其與種植不具有鹽脅迫耐受性 的同種植物相比使單位面積內(nèi)的植物產(chǎn)量增加。
[0021 ] 優(yōu)選地，所述植物為擬南芥、高粱、玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。
[0022] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種所述與非生物性脅迫反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)或 由所述與非生物性脅迫反應(yīng)相關(guān)的基因編碼的蛋白質(zhì)賦予植物鹽脅迫耐受性的用途。
[0023] 本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中，所述核酸的表達(dá)引起與相應(yīng)的未轉(zhuǎn)化野生型植物細(xì) 胞相比較對(duì)環(huán)境脅迫增加的耐性，環(huán)境脅迫為鹽度和/或干旱。
[0024] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"增加"、"提高"、"升高"、"增強(qiáng)"或"改善"涉及相應(yīng)特性在生物 或生物的部分，如組織、種子、根、葉、花等中或在細(xì)胞中的改變并且可互換使用。當(dāng)增加或 增強(qiáng)涉及基因產(chǎn)物活性的增加或增強(qiáng)時(shí)，體積內(nèi)的整體活性?xún)?yōu)選地增加或增強(qiáng)，無(wú)論基因 產(chǎn)物的數(shù)量或該基因產(chǎn)物的特異活性或兩者是否增加或增強(qiáng)或者編碼該基因產(chǎn)物的核酸 序列或基因的數(shù)量、穩(wěn)定性或翻譯效率是否增加或增強(qiáng)。術(shù)語(yǔ)"減少"、"降低"或"缺失"涉 及相應(yīng)特性在生物或生物的部分如組織、種子、根、葉、花等中或在細(xì)胞中的改變。當(dāng)減少、 降低或缺失涉及基因產(chǎn)物活性的減少時(shí)，體積內(nèi)的整體活性?xún)?yōu)選地減少、降低或缺失，無(wú)論 基因產(chǎn)物的數(shù)量或該基因產(chǎn)物的特異活性或兩者是否減少、降低或缺失或者編碼該基因產(chǎn) 物的核酸序列或基因的數(shù)量、穩(wěn)定性或翻譯效率是否減少、降低或缺失。
[0025] 在"特性的改變"中，應(yīng)當(dāng)理解為基因產(chǎn)物的活性、表達(dá)水平或數(shù)量或代謝物含量 在特定體積內(nèi)相對(duì)于對(duì)照、參考或野生型的相應(yīng)體積受到改變，包括此活性或表達(dá)的從頭 產(chǎn)生。
[0026] 術(shù)語(yǔ)"提高"或"降低"包括僅在本發(fā)明中所述特性的改變，例如，修飾作用可以在 細(xì)胞區(qū)室如細(xì)胞器，或在植物的部分如組織、種子、根、葉、花等內(nèi)存在，但是當(dāng)檢測(cè)完整主 題及完整細(xì)胞或植物時(shí)，修飾作用檢測(cè)不到。優(yōu)選地，增加或減少在細(xì)胞水平上存在，因此 術(shù)語(yǔ)"活性的增加"或"代謝物含量的增加"涉及與野生型細(xì)胞相比細(xì)胞水平的增加。
[0027] 因此，術(shù)語(yǔ)"提高"或"降低"意指酶的特異活性及化合物或代謝物的量，例如多肽、 核酸分子的量或本發(fā)明精細(xì)化學(xué)品或編碼性mRNA或DNA的量可以在一定體積內(nèi)得到提高 或降低。
[0028] 術(shù)語(yǔ)"野生型"、"對(duì)照"或"參考"可以互換并且可以是這樣的細(xì)胞，或生物的部分 如器官或組織，或者生物，尤其微生物或植物，其未受本發(fā)明方法修飾或處理。因此用作野 生型、對(duì)照或參考的細(xì)胞，或生物的部分如器官或組織，或者生物，尤其微生物或植物盡可 能與細(xì)胞、生物或其部分對(duì)應(yīng)，并且除了在本發(fā)明方法的結(jié)果的方面以外，在其它任何特性 上與本發(fā)明的主題盡可能完全相同。因此，野生型、對(duì)照或者參考受到了完全相同或盡可能 完全相同地處理，也即僅不影響所測(cè)試特性的品質(zhì)的條件或特性可以不同。
[0029] 優(yōu)選地，參考、對(duì)照或野生型僅在本發(fā)明多肽的細(xì)胞活性方面例如因?yàn)楸景l(fā)明核 酸分子的水平增加或本發(fā)明多肽特異活性的增加，例如因?yàn)榛蛴捎诰哂忻{迫相關(guān)性蛋白 (SRP)活性的蛋白質(zhì)或其同系物的表達(dá)水平或活性、該蛋白質(zhì)的生物化學(xué)原因或遺傳原因 以及與相應(yīng)的未轉(zhuǎn)化野生型植物相比較對(duì)環(huán)境脅迫增加的耐性和/或抗性而與本發(fā)明的 對(duì)象不同。
[0030] 本發(fā)明中所述"耐鹽性"或"耐鹽能力"或"耐受鹽脅迫"或"抗鹽性"是指能耐受 高濃度鹽類(lèi)環(huán)境而生長(zhǎng)發(fā)育的性質(zhì)。
[0031] 本發(fā)明中所述"鹽脅迫"或"鹽處理"主要是指細(xì)胞或者組織滲透壓的增大導(dǎo)致了 花色素甙的合成。鹽脅迫的實(shí)質(zhì)是滲透脅迫，在外界環(huán)境中，鹽含量高到足以明顯改變水 勢(shì)，可以對(duì)植物生長(zhǎng)產(chǎn)生影響。所述鹽包括但不限于NaCl、KC1、CaCl2，土壤中鹽含量達(dá)到 0. 1% -1. 0 %時(shí)就可以對(duì)植物生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響。
[0032] 本發(fā)明中所述的植物、植物組織或植物細(xì)胞的基因組，是指植物、植物組織或植物 細(xì)胞內(nèi)的任何遺傳物質(zhì)，且包括細(xì)胞核和質(zhì)體和線粒體基因組。
[0033] 術(shù)語(yǔ)"表達(dá)"指轉(zhuǎn)錄和/或翻譯編碼性基因片段或基因。通常，得到的產(chǎn)物是mRNA 或蛋白質(zhì)。然而，表達(dá)產(chǎn)物還可以包括功能性RNA如反義核酸、tRNA、snRNA、rRNA、RNAi、 siRNA、核酶等。表達(dá)可以是全身性、局部性或暫時(shí)性的，例如限于某些細(xì)胞類(lèi)型、組織、器官 或時(shí)間段。
[0034] 本發(fā)明中所述的多核苷酸和/或核苷酸形成完整"基因"，在所需宿主細(xì)胞中編碼 蛋白質(zhì)或多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易認(rèn)識(shí)到，可以將本發(fā)明的多核苷酸和/或核苷酸置 于目的宿主中的調(diào)控序列控制下。
[0035] 本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，DNA典型的以雙鏈形式存在。在這種排列中，一條鏈與 另一條鏈互補(bǔ)，反之亦然。由于DNA在植物中復(fù)制產(chǎn)生了DNA的其它互補(bǔ)鏈。這樣，本發(fā)明 包括對(duì)序列表中示例的多核苷酸及其互補(bǔ)鏈的使用。本領(lǐng)域常使用的"編碼鏈"指與反義 鏈結(jié)合的鏈。為了在體內(nèi)表達(dá)蛋白質(zhì)，典型將DNA的一條鏈轉(zhuǎn)錄為一條mRNA的互補(bǔ)鏈，它 作為模板翻譯出蛋白質(zhì)。mRNA實(shí)際上是從DNA的"反義"鏈轉(zhuǎn)錄的。"有義"或"編碼"鏈有 一系列密碼子（密碼子是三個(gè)核苷酸，一次讀三個(gè)可以產(chǎn)生特定氨基酸），其可作為開(kāi)放閱 讀框（ORF)閱讀來(lái)形成目的蛋白質(zhì)或肽。本發(fā)明還包括與示例的DNA有相當(dāng)功能的RNA和 PNA(肽核酸）。
[0036] 本發(fā)明"cDNA"是指與RNA分子互補(bǔ)的DNA，其是通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶從得自真核細(xì)胞的 成熟的、經(jīng)過(guò)剪接的mRNA分子反轉(zhuǎn)錄而來(lái)的單鏈或雙鏈的DNA分子。如此，cDNA中不含本 來(lái)可能存在于與之對(duì)應(yīng)的基因組DNA序列中的任何內(nèi)含子。