一種熱帶假絲酵母dk2菌株制備漆酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物紡織技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種熱帶假絲酵母DK2菌株制備漆酶的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 漆酶（Laccase，EC. 1. 10. 3. 2)是一種含銅的多酚氧化酶，與植物中的抗壞血酸氧 化酶、哺乳動(dòng)物血漿中的銅藍(lán)蛋白同屬于銅藍(lán)氧化酶家族。真菌漆酶由于它具有較高的氧 化還原電勢(shì)，作用底物范圍非常廣泛，能催化氧化多種酚和芳胺類化合物，同時(shí)將分子氧還 原成水。漆酶突出的催化特性是它的底物具有廣泛性、催化反應(yīng)具有復(fù)雜性，生成的產(chǎn)物具 有環(huán)境友好性.所以，近年來利用真菌制備漆酶在麻纖維脫膠中的應(yīng)用研宄越來越廣泛。
[0003] 麻纖維種類繁多，它們由不同比重的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、果膠和雜質(zhì)組成， 紡織加工中，必須經(jīng)過"脫膠"，即去除果膠、半纖維素和木質(zhì)素等非纖維素物質(zhì)（統(tǒng)稱為膠 質(zhì)），才能獲得用于輕紡的纖維，實(shí)現(xiàn)其使用價(jià)值。麻行業(yè)常用的煮練方法主要是化學(xué)方法， 即利用強(qiáng)酸強(qiáng)堿對(duì)原麻或粗紗進(jìn)行處理，化學(xué)脫膠工藝耗能大，設(shè)備損耗大，且排放的廢水 無法循環(huán)利用，污染問題嚴(yán)重。酶法脫膠就是將脫膠菌培養(yǎng)到菌生長(zhǎng)的衰老期后進(jìn)行過濾 或離心等處理，再用得到的粗酶液浸漬原麻。粗酶液可以將麻纖維中的果膠、半纖維素、木 質(zhì)素等物質(zhì)分解轉(zhuǎn)化為簡(jiǎn)單的低分子物質(zhì)，從而完成麻纖維的脫膠過程。也可將粗酶液提 純，濃縮為液劑，或者將該濃縮液干燥成為粉劑。使用時(shí)將液劑稀釋或?qū)⒎蹌┤苡谒?，把?麻浸漬在酶稀釋液中進(jìn)行酶解脫膠。酶法脫膠工藝無需專用設(shè)備，快速高效，無污染，生產(chǎn) 的精干麻質(zhì)量好。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種熱帶假絲酵母DK2菌株制備漆酶的方法， 該方法具有工藝簡(jiǎn)單、適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)等特點(diǎn)，制備的漆酶活性高、用量少且酶活穩(wěn) 定。
[0005] 本發(fā)明的一種熱帶假絲酵母DK2菌株制備漆酶的方法，包括：
[0006] (1)將熱帶假絲酵母DK2菌株由PDA斜面培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接入裝有基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基的三 角瓶中，在搖床中30~40°C恒溫震蕩培養(yǎng)3~4d后，發(fā)酵液經(jīng)過濾得到菌絲體，菌絲體用 無菌水洗凈打散，隨后收集于無菌水中制成菌絲懸浮液，保存?zhèn)溆茫?br>[0007] (2)在基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中分別加入1~2% w/v的天然底物和不同濃度的 CuSO4 · 5H20作為產(chǎn)酶培養(yǎng)基，在三角瓶中裝入產(chǎn)酶培養(yǎng)基，接入上述菌絲懸浮液，在搖床中 30~40°C恒溫震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中定時(shí)提取發(fā)酵液，離心后取上清液即為粗酶液；
[0008] (3)將上述粗酶液于4~6°C離心，取上清液即得漆酶。
[0009] 所述步驟（1)中的熱帶假絲酵母DK2菌株的ITS序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0010] 根據(jù)ITS測(cè)序Blast及聚類分析結(jié)果，該菌與熱帶假絲酵母菌相似性為99 %，結(jié)合 生理生化試驗(yàn)結(jié)果和鏡檢分析，命名此菌株為熱帶假絲酵母（Candida tropicalis)DK2菌 株。ITS測(cè)序中，所采用的正向引物為：ITSl(5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）、反向引物為IT S4 (5 '-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 '），均為國(guó)際通用引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限 公司合成。
[0011] 本發(fā)明所采用的熱帶假絲酵母（Candida tropicalis)DK2菌株，保藏單位名稱： CGMCC中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西 路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研宄所，保藏號(hào)為CGMCC NO. 10186,保藏日期為2014年12 月15日。建議分類命名為：熱帶假絲酵母（Candida tropicalis)。
[0012] 所述步驟（1)中的基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基的組成為：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水 lOOOmL，pH 自然。
[0013] 所述步驟（1)中的收集所用的無菌水與發(fā)酵液等體積。
[0014] 所述步驟（1)中的保存溫度為40°C。
[0015] 所述步驟（2)中的天然底物為茶葉、稻草或麥草；CuSO4 · 5H20的濃度范圍為 〇-4mM〇
[0016] 所述步驟⑵中的產(chǎn)酶培養(yǎng)基的組成為：NaN032. 5g，KH2PO4Ig, CaCl2 · 6H20 0· lg， MgSO4O. 3g，NaCl 0. lg，F(xiàn)eCl30.0 1g，油菜稻稈粉 0. 5g，蒸飽水 lOOOmL，pH 用稀鹽酸調(diào)至 6. 0_7. 0〇
[0017] 所述步驟⑴和⑵中的震蕩轉(zhuǎn)速為180rpm。
[0018] 所述步驟（3)中的離心轉(zhuǎn)速為8000r/min。
[0019] 所述步驟（3)得到的漆酶活力為100-300U/ml，在ρΗ5· 0-6. 0、20-50°C下酶活力穩(wěn) 定。
[0020] 上述漆酶活力經(jīng)DNS比色法測(cè)定。DNS法即3, 5 -二硝基水楊酸比色法，其測(cè)定原 理是3, 5-二硝基水楊酸在中性或偏堿性條件下與多糖水解的還原糖共熱后被還原成棕紅 色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)，還原糖的量和反應(yīng)液的顏色呈正比；DNS比色法是還原糖 和纖維素酶活力常用的測(cè)定方法。
[0021] 有益效果
[0022] 本發(fā)明具有工藝簡(jiǎn)單、適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)等特點(diǎn)，制備的漆酶活性高、用量少 且酶活穩(wěn)定，菌、酶均無毒性，無環(huán)境污染，可以有效去除亞麻、黃麻、紅麻或竹纖維中的非 纖維素膠質(zhì)，具有脫膠效率高，脫膠周期短，纖維分散率高，精干麻質(zhì)量好等優(yōu)點(diǎn)，具有良好 的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0023] 圖1和圖2均為本發(fā)明菌株顯微鏡染色照片（油鏡）。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
[0025] 實(shí)施例1
[0026] 熱帶假絲酵母DK2菌株制備漆酶的方法：
[0027] (1)菌絲懸浮液：熱帶假絲酵母DK2菌株由PDA斜面培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接入裝有50mL基礎(chǔ) 液體培養(yǎng)基的300mL三角瓶中，在搖床中180rpm，30°C恒溫震蕩培養(yǎng)3d后，發(fā)酵液經(jīng)無菌紗 布過濾，菌絲體用無菌水洗凈并在Waring高速打碎杯中打散15s，收集于無菌水（與發(fā)酵液 等體積）中制成菌絲懸浮液，于40°C下保存?zhèn)溆谩?br>[0028] 基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水lOOOmL，pH自然。
[0029] (2)搖瓶產(chǎn)酶：在基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中分別加入1% (w/v)的天然底物）和不同濃度 的CuSO4 · 5H20(0-4mM)即為產(chǎn)酶培養(yǎng)基。300mL三角瓶中裝入產(chǎn)酶培養(yǎng)基80mL，接入20mL 菌絲懸浮液，