試劑盒及其在生殖道病原體擴(kuò)增檢測(cè)中的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物檢測(cè)，具體地，本發(fā)明涉及包含序列的試劑盒、病原體檢測(cè)方法 及裝置。
【背景技術(shù)】
[0002] 2000年衛(wèi)生部在15個(gè)省開展的部分城市已婚婦女婦科病常見流行病學(xué)調(diào)查研 究結(jié)果顯示：生殖道感染患病率為婦科疾病之首，42. 9%已婚婦女至少患有1種生殖道感 染，19%生殖道感染患者存在2種或2種以上混合感染。慢性宮頸炎患病率最高，39. 3% ; 細(xì)菌性陰道?。˙V)，5.3% ;假絲酵母菌性陰道炎（VVC)，4.8% ;生殖道CT感染，4.4% ;盆 腔炎，4. 1% ;滴蟲性陰道炎，2. 6%。而生殖道病原體感染會(huì)導(dǎo)致以下病癥：1)泌尿系統(tǒng)感 染、盆腔炎等；2)增加男女不孕癥、孕產(chǎn)婦的異位妊娠、流產(chǎn)、早產(chǎn)、死產(chǎn)的發(fā)生率；3)淋病、 梅毒、AIDS/HIV傳給孩子，影響出生孩子的素質(zhì)和下一代的健康；4)生殖系統(tǒng)的慢性炎癥 增加 HIV感染幾率。
[0003] 生殖道感染導(dǎo)致的不孕不育比較嚴(yán)重，加強(qiáng)對(duì)婦女生殖道感染的檢測(cè)，將對(duì)指導(dǎo) 和治療不孕癥有重大意義。
[0004] 由于引起生殖道感染的病原體復(fù)雜、多樣，為臨床治療帶來(lái)困難，因此迫切需要尋 求一種特異性強(qiáng)、敏感性高同時(shí)又快速、經(jīng)濟(jì)的病原學(xué)檢測(cè)方法，為臨床病原學(xué)治療提供實(shí) 驗(yàn)依據(jù)。
[0005] 目前臨床用于生殖道感染病原體檢測(cè)的方法有培養(yǎng)技術(shù)、免疫技術(shù)和PCR技術(shù) 等，這些技術(shù)在臨床診斷中已發(fā)揮了巨大的作用，但仍存在一些缺點(diǎn)。培養(yǎng)技術(shù)繁瑣而費(fèi) 時(shí)；免疫技術(shù)要有特異的抗血清。PCR技術(shù)本身的優(yōu)越性是無(wú)可厚非的，但是使用不當(dāng)很容 易引起交叉污染，出現(xiàn)假陽(yáng)性；如果反應(yīng)條件控制不好可能也會(huì)出現(xiàn)假陰性。這些缺點(diǎn)需要 應(yīng)用新的技術(shù)去彌補(bǔ)。
[0006] 近幾年發(fā)展起來(lái)的基因芯片技術(shù)為生殖道感染的病原學(xué)診斷提供了一種強(qiáng)有力 的手段，其快速、高效、高通量、并行化的檢測(cè)特點(diǎn)在病原學(xué)診斷方面占有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)?；?于基因芯片技術(shù)的生殖道病原體試劑盒也在不斷地別研發(fā)生產(chǎn)出來(lái)，廣泛用于生殖道病原 體的臨床檢測(cè)。這些試劑盒大都針對(duì)于單一的病原體設(shè)計(jì)，一次病原體檢測(cè)需要用到不同 的試劑盒，工作較繁瑣且對(duì)于臨床樣本量的需求也比較大。
[0007] 近來(lái)已有學(xué)者通過(guò)檢索相關(guān)細(xì)菌的16S~23S rRNA間區(qū)基因序列，針對(duì)不同細(xì)菌 的共同序列和特異序列，設(shè)計(jì)通用引物和特異寡核苷酸探針并制成可同時(shí)檢測(cè)單一樣品 中多種病原體的復(fù)合基因芯片。但是由于生殖道感染的并不僅僅由于細(xì)菌而導(dǎo)致，這種檢 測(cè)方法會(huì)將巨細(xì)胞病毒、乙型肝炎病毒、單純皰疹病毒等比較重要的病毒類生殖道病原體 忽略，進(jìn)而對(duì)臨床診斷及治療造成一定的阻礙。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 依據(jù)本發(fā)明的一方面，提供一種試劑盒，其包括如SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2， SEQ ID NO :3 和 SEQ ID NO :4, SEQ ID NO :5 和 SEQ ID NO :6, SEQ ID NO :7 和 SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO :9 和 SEQ ID NO :10, SEQ ID NO :11 和 SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13 和 SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO :15 和 SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO :17 和 SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19 和 SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :21 和 SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23 和 SEQ ID NO :24 以 及SEQ ID NO :25和SEQ ID NO :26所示的13對(duì)引物序列中的至少2對(duì)。
[0009] 依據(jù)本發(fā)明的另一方面提供上述試劑盒在病原體擴(kuò)增和/或檢測(cè)中的用途，所述 病原體包括巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒、淋病奈瑟球菌、陰道毛滴蟲、解脲脲原體、沙眼衣原 體、白假絲酵母菌、人型支原體、生殖支原體、陰道加德納菌、杜克嗜血桿菌、梅毒螺旋體和B 族鏈球菌。
[0010] 依據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供一種病原體檢測(cè)方法，所述病原體包括巨細(xì)胞病毒、 單純皰疹病毒、淋病奈瑟球菌、陰道毛滴蟲、解脲脲原體、沙眼衣原體、白假絲酵母菌、人型 支原體、生殖支原體、陰道加德納菌、杜克嗜血桿菌、梅毒螺旋體和B族鏈球菌中的至少一 種，該法包括：（1)提取待測(cè)樣本核酸；（2)對(duì)（1)中的核酸中的至少一部分進(jìn)行擴(kuò)增，獲得 擴(kuò)增產(chǎn)物，所述擴(kuò)增本發(fā)明一方面提供的試劑盒進(jìn)行的；（3)對(duì)（2)中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列 測(cè)定，獲得測(cè)定序列；(4)利用（3)中的測(cè)定序列，確定待測(cè)樣本中包含的病原體種類。該 方法還可包括：（5)利用（4)中的結(jié)果，計(jì)算所述確定的各種病原體的豐度，將每種病原體 的豐度與該種病原體的不致病豐度進(jìn)行比較，兩者有顯著性差異則確定宿主感染該種病原 體。
[0011] 依據(jù)本發(fā)明的又一方面還提供一種病原體檢測(cè)裝置，所述病原體包括巨細(xì)胞病 毒、單純皰疹病毒、淋病奈瑟球菌、陰道毛滴蟲、解脲脲原體、沙眼衣原體、白假絲酵母菌、人 型支原體、生殖支原體、陰道加德納菌、杜克嗜血桿菌、梅毒螺旋體和B族鏈球菌中的至少 一種，該裝置包括:A.核酸提取單元，用于提取獲得待測(cè)樣本核酸；B.擴(kuò)增單元，與A單元 相連，用于對(duì)來(lái)自A的核酸的至少一部分進(jìn)行擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，所述擴(kuò)增利用權(quán)利要求 1的試劑盒中進(jìn)行；C.序列測(cè)定單元，與B單元相連，用于對(duì)接收自B單元的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 序列測(cè)定，獲得測(cè)定序列；D.病原體種類確定單元，與C單元相連，用于利用接收自C單元 的測(cè)定序列，確定待測(cè)樣本包含的病原體種類。該裝置進(jìn)一步包括：E.病原體感染判定單 元，與D單元相連，用于利用接收自D單元的結(jié)果，計(jì)算所述確定的各種病原體的豐度，將每 種病原體的豐度與該種病原體的不致病豐度進(jìn)行比較，兩者有顯著性差異則判定宿主感染 該種病原體。
[0012] 本發(fā)明的試劑盒、方法和/裝置旨在開發(fā)一種基于新一代測(cè)序技術(shù)的用于輔助臨 床診斷的多種病原體感染篩查技術(shù)，能夠一次性地將巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒、淋病奈瑟 球菌、陰道毛滴蟲、解脲脲原體、沙眼衣原體、白假絲酵母菌、人型支原體、生殖支原體、陰道 加德納菌、杜克嗜血桿菌、梅毒螺旋體和B族鏈球菌13種可造成生殖系統(tǒng)等感染的病原體 同時(shí)檢出。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施方式的描述中將 變得明顯和容易理解，其中 ：
[0014] 圖1是本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中的病原體檢測(cè)流程；
[0015] 圖2是本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中的樣本CMV檢測(cè)結(jié)果示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 依據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方式，提供一種試劑盒，其包括如SEQ ID N0 :1和SEQ ID N0:2，SEQ ID N0:3 和 SEQ ID N0:4，SEQ ID N0:5 和 SEQ ID N0:6，SEQ ID N0:7 和 SEQ ID NO :8, SEQ ID NO :9 和 SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO :11 和 SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO :13 和 SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO :15 和 SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO :17 和 SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO :19 和 SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :21 和 SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23 和 SEQ ID NO :24 以及SEQ ID NO :25和SEQ ID NO :26所示的13對(duì)引物序列中的至少2對(duì)。根據(jù)本發(fā)明的 一個(gè)具體的實(shí)施方式，該試劑盒包括上述13對(duì)引物序列中的至少4對(duì)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè) 具體的實(shí)施方式，該試劑盒包括上述13對(duì)引物序列中的至少6對(duì)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體 的實(shí)施方式，該試劑盒包括上述13對(duì)引物序列中的至少8對(duì)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí) 施方式，該試劑盒包括上述13對(duì)引物序列中的至少10對(duì)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施 方式，該試劑盒包括上述13對(duì)引物序列中的至少12對(duì)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方 式，該試劑盒包括前述13對(duì)引物序列。利用該試劑盒能夠多重?cái)U(kuò)增出樣本包含的病原體， 一次測(cè)定多種病原體檢測(cè)多種病原體，多種病原體包括常見的生殖道感染病原體中的解脲 脲原體（UU)、