用于生產(chǎn)萜烯的方法
【專利說(shuō)明】用于生產(chǎn)萜烯的方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及用于在真菌中生產(chǎn)萜烯的方法、修飾的萜烯生物合成基因簇、以及構(gòu) 巢曲霉（Aspergillus nidulans)用于生產(chǎn)多種類型的貓稀的用途。
[0002] 相關(guān)領(lǐng)域的描述
[0003] 萜烯是具有多種藥學(xué)和工業(yè)應(yīng)用的一大類化合物。萜烯可作為潛在的藥物或藥 物前體、生物活性化合物或燃料和化學(xué)品。這些應(yīng)用的實(shí)例是抗瘧的倍半萜紫穗槐二烯 (amorphadiene)、抗癌的二貓紫杉醇和倍半貓法呢稀，其可作為燃料和作為化學(xué)品的前體。 單萜，例如檸檬烯，具有作為噴氣燃料成分的應(yīng)用。
[0004] 萜烯是從寬范圍的生物體中的五碳前體分子合成的一類生物生成的分子。萜烯是 純的碳?xì)浠衔?，而萜類化合物可含有一個(gè)或多個(gè)氧原子。術(shù)語(yǔ)萜烯和萜類化合物可互換 使用。萜類化合物僅在植物和某些微生物中少量天然產(chǎn)生。然而，微生物生產(chǎn)是生產(chǎn)多種 萜烯的吸引人的替代。尤其是真菌具有低營(yíng)養(yǎng)需求，可以抵抗木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物上的抑 制劑，能夠使用多種碳源，并且也適合大規(guī)模生產(chǎn)，因此提供了所探求的成本合算的方式以 生產(chǎn)萜烯化合物。已經(jīng)通過(guò)在異源/組成型啟動(dòng)子下的途徑中表達(dá)某些基因而工程改造了 若干微生物，用于萜烯生產(chǎn)。
[0005] 這些經(jīng)遺傳改造的微生物宿主中的一個(gè)問(wèn)題就是因生物體中存在的天然活性所 致的低產(chǎn)量的結(jié)果或產(chǎn)生副產(chǎn)物。
[0006] 編碼生物合成途徑中的連續(xù)步驟的基因傾向于在染色體上簇集在一起形成"基因 簇"。簇集程度在生物體內(nèi)部和之間是高度可變的。次級(jí)代謝物是對(duì)生物體正常生長(zhǎng)而言 并非必需的化合物。它們的作用是在生態(tài)相互作用中作為防御化合物或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。許 多次級(jí)代謝物都具有吸引人的生物學(xué)性能，例如作為抗生素、抗癌藥、殺蟲劑、免疫抑制劑 和除草劑。在細(xì)菌中，控制這些化合物的生物合成的基因簇集在事實(shí)上是很普遍的。然而， 真核基因組也含有功能相關(guān)的、但并非同源的基因簇[Osbourn，2010]。
[0007] 很多用于次級(jí)代謝物合成的簇可以在絲狀真菌中找到。與從先前鑒定的代謝物所 預(yù)測(cè)的基因簇相比，絲狀生物包含多得多的用于次級(jí)代謝物生物合成的基因簇。次級(jí)代謝 的基因簇是用于代謝物生產(chǎn)的自含式的盒。它們含有編碼產(chǎn)生不同類型的次級(jí)代謝物的骨 架結(jié)構(gòu)的酶的基因，所述酶例如非核糖體肽合成酶（NRPS)酶、聚酮合酶（PKS)和萜烯合酶， 其稱為"標(biāo)簽"基因/酶。這些簇也含有用于修剪修飾次級(jí)代謝物骨架的酶的基因，所述酶 例如氧化還原酶、甲基轉(zhuǎn)移酶、?；D(zhuǎn)移酶和糖基轉(zhuǎn)移酶。在某些情況下，次級(jí)代謝簇也包 括用于途徑-特異性調(diào)節(jié)劑的基因和/或途徑終端產(chǎn)物抗性的基因[Osboum，2010]。
[0008] 次級(jí)代謝簇的表達(dá)通常處于環(huán)境和/或發(fā)育控制之下并且是由復(fù)雜的調(diào)控級(jí)聯(lián) 所介導(dǎo)，所述級(jí)聯(lián)將信號(hào)傳遞給途徑-特異性開關(guān)。Zn (II) 2Cys6-型轉(zhuǎn)錄因子的作用是通 過(guò)上調(diào)簇集基因的轉(zhuǎn)錄而作為次級(jí)代謝物簇的途徑-特異性激活物。次級(jí)代謝物基因的簇 集具有在染色質(zhì)水平上促進(jìn)調(diào)控的潛力。某些次級(jí)代謝物簇內(nèi)的基因的特定順序和位置可 提供有助于確定基因活化的時(shí)間和順序的結(jié)構(gòu)框架。已經(jīng)提出該過(guò)程組織貫穿途徑中的酶 步驟的連續(xù)的底物通道[Roze等人，2007]。功能相關(guān)基因的簇集的優(yōu)勢(shì)是需要共同調(diào)節(jié)生 物合成或發(fā)育途徑中的一組基因控制的連續(xù)步驟。簇集促進(jìn)了一組生物合成基因的最佳調(diào) 控。
[0009] 已經(jīng)證實(shí)基因間隔區(qū)和染色體定位在優(yōu)化基因表達(dá)中起作用。許多次級(jí)代謝物簇 位于染色體的亞端粒區(qū)，其中異染色質(zhì)轉(zhuǎn)錄受到位置調(diào)控。位于亞端粒區(qū)的某些簇顯示出 受到通用轉(zhuǎn)錄激活物例如LaeA或AreA的調(diào)節(jié)，其響應(yīng)環(huán)境刺激以釋放異染色質(zhì)區(qū)用于翻 譯。在這些區(qū)中的基因轉(zhuǎn)錄在正常生長(zhǎng)條件下沉默。當(dāng)外源基因隨機(jī)整合到宿主生物的基 因組上時(shí)，位置轉(zhuǎn)錄調(diào)控可在靶基因的基因表達(dá)中發(fā)揮作用[Palmer等人，2010]。
[0010] 除了隨機(jī)整合的轉(zhuǎn)化DNA造成的基因破壞所導(dǎo)致的不可預(yù)見(jiàn)的多效性外，已經(jīng)提 出某些染色體位置比其他位置更加有利于異源表達(dá)，也許是因?yàn)榕c局部調(diào)節(jié)元件的特定相 互作用，或更常見(jiàn)的是在正常高度表達(dá)的基因附近的活性天然轉(zhuǎn)錄[Davis等人，1991]。當(dāng) 從其原始基因座上被取代時(shí)，某些在空間或時(shí)間上被調(diào)控的曲霉基因，例如黃曲霉毒素簇 [Chiou等人，2002]和分生孢子-特異性基因[Miller等人，1987]，顯示出在調(diào)控反應(yīng)中的 巨大變化，并且也已報(bào)道了對(duì)異源表達(dá)的基因座作用[Verdoes等人，1995]。
[0011] 在Lubertozzi & Kiesling發(fā)表的論文中，將來(lái)自黃花蒿（Artemisia annua)的 紫穗槐二烯合酶基因轉(zhuǎn)化到構(gòu)巢曲霉中。在他們的方法中，與在大腸桿菌中相同的表達(dá)實(shí) 驗(yàn)相比，在構(gòu)巢曲霉中的產(chǎn)物特異性大大降低。猜測(cè)其原因?yàn)槠渌鼧?gòu)巢曲霉次生代謝產(chǎn)物 基因的干擾背景活性，而大腸桿菌中不存在這些基因，或者缺乏將萜類化合物碳骨架修飾 為紫穗槐二烯所需的支持性酶活性。
[0012] Bok等人公開了在構(gòu)巢曲霉中IaeA的過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)許多次級(jí)代謝物簇，包括推定的 萜類化合物簇。
[0013] WO 2002024865(Holzman)描述了使用位于洛伐他汀簇之外的Zn2(II)Cys6-轉(zhuǎn)錄 激活物對(duì)洛伐他汀生產(chǎn)的調(diào)節(jié)。
[0014] WO 2001 021779 (DSM)公開了在絲狀真菌中激活β-內(nèi)酰胺生產(chǎn)的簇特異性轉(zhuǎn)錄 激活物BlaR的鑒定、克隆和過(guò)表達(dá)。
[0015] WO 1999 025735描述了嵌合轉(zhuǎn)錄因子的過(guò)表達(dá)，以增加次級(jí)代謝物的產(chǎn)生。
[0016] Sakai等人已將紅曲霉（Monascus)的橘霉素生物合成基因簇引入米曲霉 (Aspergillus oryzae)中。他們通過(guò)進(jìn)一步引入由曲霉trpC啟動(dòng)子控制的多拷貝的激活 物基因 CtnA而能夠增加橘霉素的產(chǎn)量。
[0017] Chiang等人已經(jīng)能夠通過(guò)用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子取代轉(zhuǎn)錄激活物的啟動(dòng)子而在構(gòu)巢曲 霉中活化其它沉默聚酮簇。
[0018] WO 2006 014837提出了具有例如不同萜烯合酶的宿主細(xì)胞的遺傳修飾，以獲得類 異戊二烯前體或類異戊二烯化合物。
[0019] WO 2010104763公開了使用編碼萜烯合酶的核酸生產(chǎn)萜烯和萜類化合物。該發(fā)明 描述了在調(diào)節(jié)區(qū)（啟動(dòng)子）下的基因表達(dá)，但不用基因簇。
[0020] 同樣，WO 2008039499公開了包含編碼萜烯合酶的核苷酸序列的核酸，WO 0240694 公開了具體包含紫杉烷合成途徑的表達(dá)載體，WO 2007140339公開了經(jīng)由生物合成途徑生 產(chǎn)類異戊二烯。
[0021] US 2009/0137014 Al描述了用微生物從乙醇中生產(chǎn)紫穗槐-4,11-二烯或法呢 稀。W008133658描述了通過(guò)釀酒酵母和大腸桿菌從糖類中生產(chǎn)單貓。有若干其它專利/專 利申請(qǐng)，例如WO 2008045555,其中使用微生物生產(chǎn)法呢烯。
[0022] 也描述了在工程化微生物中生產(chǎn)單貓（Carter，Peters & Croteau2003)。他們 發(fā)現(xiàn)表達(dá)來(lái)自綠薄荷的檸檬烯合酶的大腸桿菌，生產(chǎn)低濃度的檸檬烯。通過(guò)在大腸桿菌 中過(guò)表達(dá)來(lái)自挪威云杉（Picea abies)的單貓環(huán)化酶3-蒈稀環(huán)化酶，形成單貓梓檬稀、 α-薇稀、月桂稀、檜稀、3-蒈稀、α-貓品稀、β-水序稀、α-貓品稀和貓品油稀的混合物 (Reiling 等人· 2004)。
[0023] 倍半貓的生物合成的生產(chǎn)也描述于Kimura Μ.等人（2007)。
[0024] 因此，用于生產(chǎn)萜烯的生物合成途徑是已知的。然而，所引用的出版物中無(wú)一公開 特別激活屬于萜烯生物合成途徑的基因簇的轉(zhuǎn)錄因子的過(guò)表達(dá)。尤其是，這些出版物都沒(méi) 有教導(dǎo)替換簇的某些基因以獲得不同的萜烯產(chǎn)物，或?qū)е卤磉_(dá)水平的改變。
[0025] 生物合成途徑中的關(guān)鍵性基因的表達(dá)水平的平衡可以影響產(chǎn)物的結(jié)果和生物體 本身的活力。很多時(shí)候，基因產(chǎn)物的充足將導(dǎo)致對(duì)其表達(dá)的抑制。表征了許多這樣的負(fù)反 饋環(huán)，例如Bergmann等人（2007)，其中描述了基因簇的單個(gè)基因的過(guò)表達(dá)通常導(dǎo)致對(duì)同一 簇的另一基因產(chǎn)物的限制。另外，中間體的積累可以負(fù)面調(diào)節(jié)特定途徑的后續(xù)步驟。因此， 對(duì)于生物合成途徑基因，最高可達(dá)到的基因表達(dá)不一定與所述途徑的終產(chǎn)物的最高得率相 關(guān)。因此，重要的是發(fā)現(xiàn)負(fù)責(zé)生物合成中的特定步驟的各基因的最佳表達(dá)水平。通過(guò)使用 生物合成基因的引入啟動(dòng)子，這可能是困難的。
[0026] 現(xiàn)有技術(shù)解決方案的缺點(diǎn)在于難以獲得萜烯的高產(chǎn)物得率。另外的缺點(diǎn)是通過(guò)微 生物發(fā)酵得到的產(chǎn)物通常包含大量不確定的副產(chǎn)物和其它不需要的化合物。另外，每個(gè)基 因都不得不具有自身的調(diào)節(jié)區(qū)（啟動(dòng)子）?？傊?，存在對(duì)獲得較高得率的富集產(chǎn)物而無(wú)實(shí)質(zhì) 量的副產(chǎn)物的萜烯生產(chǎn)方法的需求。
[0027] 本發(fā)明的目標(biāo)和概述
[0028] 本發(fā)明目的是提供用于通過(guò)微生物發(fā)酵生產(chǎn)萜烯的方法，并具有將產(chǎn)物代謝物從 天然產(chǎn)生的某一種變?yōu)榱硪环N的選項(xiàng)。優(yōu)選地，同時(shí)使產(chǎn)物得率得以改善或者至少維持在 可接受水平，并且產(chǎn)物為富集的。特別地，目的是提供這樣的方法，其中真菌固有的轉(zhuǎn)錄調(diào) 節(jié)能力用于將萜烯生物合成基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)維持在最佳水平，以在微生物宿主中生產(chǎn)多種 具有商業(yè)價(jià)值的萜烯化合物。
[0029] 這些和其它目的通過(guò)下文描述和要求保護(hù)的本發(fā)明來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0030] 本發(fā)明的第一方面是用于在真菌中生產(chǎn)萜烯的方法。該方法包括以下步驟：
[0031] (a)提供在宿主細(xì)胞中的修飾的萜烯生物合成基因簇，所述基因簇具有天然存 在的萜烯生物合成基因和啟動(dòng)子，其中一個(gè)或多個(gè)這些基因或啟動(dòng)子已被取代、截短或移 除；
[0032] (b)提供在所述宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子，使得所述轉(zhuǎn)錄因子與天然或修飾的啟動(dòng) 子中的一個(gè)操作性連接以增加其表達(dá)，所述轉(zhuǎn)錄因子激活具有萜烯生物合成基因的修飾的 萜烯生物合成基因簇和與所述基因操作性連接的調(diào)節(jié)區(qū)；
[0033] (C)在允許所述激活簇的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述宿主；和
[0034] (d)任選回收由此產(chǎn)生的萜烯產(chǎn)物。
[0035] 依照該方面，提供具有生物合成基因簇的天然啟動(dòng)子、和任選能夠激活所述修飾 的基因簇的合適轉(zhuǎn)錄因子的額外拷貝的宿主細(xì)胞。
[0036] 本發(fā)明的第二方面是修飾的萜烯生物合成基因簇。所述簇的特征在于其基本上包 含推定地編碼以下的基因：
[0037] (a)Zn(II)2Cys6-型轉(zhuǎn)錄因子（AN1599);單萜合酶（例如γ-萜品烯合酶、檸檬 烯合酶、萜品油烯合酶、桉油醇合酶或水芹烯合酶或倍半萜合酶（例如α-法呢烯合 酶、紫穗槐二稀合酶、杜松稀合酶、石竹稀合酶或紅沒(méi)藥稀合酶）或二貓合酶（例如ent-海 松 -8 (14)，15-二稀（ent-pimara-8 (14)，15-diene)合酶 AN1594、紫杉二稀合酶、貝殼杉稀 合酶、fusicoccadiene合酶、casbene合酶或松香二稀合酶）；GGPP_合酶（AN1592)或GPP 合酶或FPP合酶、HMG-CoA還原酶（AN1593)，和
[0038] (b)任選翻譯延伸因子1-γ (AN1595)、細(xì)胞色素 P450(AN1598)、短鏈脫氫酶 (AN1596)、與甲基轉(zhuǎn)移酶具有一些相似性的推定蛋白（AN1597)、與所述基因操作性連接的 調(diào)節(jié)區(qū)和任選AAA家族ATP酶（AN1591)和
[0039] (c)與條目（a)的基因和與條目（b)的任選基因操作性連接的調(diào)節(jié)區(qū)。
[0040] Zn (II) 2Cys6型轉(zhuǎn)錄因子（即AN1599)，是天然存在于萜烯生物合成基因簇內(nèi)的轉(zhuǎn) 錄因子，能夠調(diào)節(jié)位于該生物合成途徑的所有基因。原本位于簇內(nèi)部或與簇接近的轉(zhuǎn)錄因 子是優(yōu)選的，這是因?yàn)槠淇杀蝗菀椎罔b定。然而，轉(zhuǎn)化到同源或異源宿主中后，插入的與簇 相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的基因組位置不是關(guān)鍵性的。
[0041] 本發(fā)明的第三方面是用于在真菌中生產(chǎn)多種萜烯的如本文所述的修飾的萜烯生 物合成基因簇的調(diào)節(jié)區(qū)。
[0042] 本發(fā)明的第四方面是以SEQ ID NO :1或與SEQ ID NO :1具有至少80%同一性的 序列為特征的轉(zhuǎn)錄因子的用途。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，與SEQ ID NO :52的同一性程度 為82%、85%、87%、90%、92%、95%、98%或甚至99%。
[0043] 本發(fā)明的第五方面是構(gòu)巢曲霉用于生產(chǎn)多種萜烯的用途。
[0044] 本發(fā)明第六方面是可用于本發(fā)明方法的生產(chǎn)宿主。根據(jù)本發(fā)明，所述宿主包含上 述的萜烯生物合成途徑基因簇和任選引入的與啟動(dòng)子操作性連接的轉(zhuǎn)錄因子，其中一個(gè)或 多個(gè)基因或它們的啟動(dòng)子已被交換、截短或移除，其中所述轉(zhuǎn)錄因子能夠激活萜烯生物合 成基因簇。在這方面使用的引入的與啟動(dòng)子操作性連接的轉(zhuǎn)錄因子意指，與未經(jīng)修剪用于 本發(fā)明范圍內(nèi)的宿主相比，宿主細(xì)胞還攜帶（除可能的內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子外）與啟動(dòng) 子操作性連接的轉(zhuǎn)錄因子的一個(gè)或多個(gè)拷貝。引入的轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子可以是與宿主同源 或異源的。任選地，引入的與轉(zhuǎn)錄因子操作性連接的啟動(dòng)子可用于指導(dǎo)該轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄。 另外引入的啟動(dòng)子可以是與宿主同源或異源的。
[0045] 本文所述的所謂的"AN1599轉(zhuǎn)化體"或"AN1599轉(zhuǎn)化體菌株"或"oe :AN1599"是構(gòu) 巢曲霉菌株，其具有處于組成型活性的gpdA-啟動(dòng)子下的Zn (II) 2Cys6轉(zhuǎn)錄因子AN1599的 額外拷貝。表達(dá)構(gòu)建體的整合位點(diǎn)和拷貝數(shù)是未知的。本文所述的所謂的"gpdA > AN1599" 是構(gòu)巢曲霉菌株，其具有靶向基因簇的組成型活性的gpdA-啟動(dòng)子以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子AN1599 的表達(dá)。
[0046] 術(shù)語(yǔ)"修飾的簇"意圖指一個(gè)或多個(gè)基因或這些基因簇的調(diào)節(jié)區(qū)已被改變或移除。 因此，萜烯簇中的基因是可交換的。例如，可將萜烯合酶（AN1594)替換為任何單萜、二萜或 倍半萜的合酶以生產(chǎn)單萜、二萜或倍半萜。同樣，GGPP-合酶（AN1592)基因可被GPP或FPP 合酶編碼基因替換，以促進(jìn)例如單萜合成。同樣，可改變簇中的任何基因以促進(jìn)優(yōu)化的萜烯 生產(chǎn)。同樣，可改變?cè)摯氐纳锖铣苫虻娜魏螁?dòng)子以促進(jìn)優(yōu)化表達(dá)。該方法得益于經(jīng) 協(xié)調(diào)和調(diào)節(jié)的表達(dá)所致的簇組構(gòu)。
[0047] 基因缺失的效應(yīng)可有益于次級(jí)代謝物的生產(chǎn)。⑶Hl所編碼的NADPH-依賴性谷氨 酸脫氫酶的缺失被認(rèn)為是在酵母中改進(jìn)倍半萜生物合成的最佳靶基因[Asadollahi]。也已 經(jīng)報(bào)道了生物合成基因簇的單個(gè)基因的缺失以增加其它類型的次級(jí)代謝物的生產(chǎn)。在構(gòu)巢 曲霉中，在DHMBA的生物合成基因簇中的細(xì)胞色素 P450基因缺失之后，提高了聚酮2,4-二 羥-3-甲基-6-(2-氧丙基）苯甲醛（DHMBA)的生產(chǎn)[Gerke]。諸如這些的修飾可用于本發(fā) 明。
[0048] 另外其它類型的修飾例如基因截短可增加萜烯生產(chǎn)。在酵母中，導(dǎo)致萜烯前體生 產(chǎn)的甲羥戊酸（MVA)途徑經(jīng)歷了復(fù)雜的反饋調(diào)節(jié)，其中HMG-CoA還原酶作為主要調(diào)節(jié)靶標(biāo) [Dimster-Denk等人，1994]。HMG-CoA還原酶催化HMG-CoA向甲輕戊酸轉(zhuǎn)化，并且在轉(zhuǎn)錄和 轉(zhuǎn)錄后水平上被調(diào)節(jié)。從酵母HMG-CoA還原酶同工酶I(HMGl)中移除N-末端調(diào)節(jié)結(jié)