一種轉(zhuǎn)氨酶的固定化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種轉(zhuǎn)氨酶的固定化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 轉(zhuǎn)氨酶可將化合物中的幾基轉(zhuǎn)化為氨基。可W高效生產(chǎn)手性胺，因其底物相對(duì)廉 價(jià)、產(chǎn)物純度高、反應(yīng)條件溫和的特點(diǎn)，應(yīng)用價(jià)值巨大。
[0003] 固定化酶易于與產(chǎn)品分離并可回收重復(fù)使用，比游離酶具有更好的穩(wěn)定性W及更 長(zhǎng)的操作周期。酶或細(xì)胞的固定化方法很多，如物理吸附、親和聯(lián)結(jié)、共價(jià)交聯(lián)、凝絮包埋 等。
[0004] CN201280031237使用樹(shù)脂為載體固定轉(zhuǎn)氨酶，但W樹(shù)脂為載體，存在樹(shù)脂價(jià)格昂 貴，載酶量低的缺點(diǎn)。W該專(zhuān)利實(shí)施例1~5為例，1克樹(shù)脂載體僅能固載0. 125克轉(zhuǎn)氨酶， 固定化轉(zhuǎn)氨酶酶活單位低；且現(xiàn)有固定化方法無(wú)純化過(guò)程，會(huì)將游離酶中的雜質(zhì)蛋白也固 定于載體。
[0005] 聚己締醇海綿是由聚己締醇縮醒化而得，具有優(yōu)異的吸水和力學(xué)性能，比表面積 大，有作為轉(zhuǎn)氨酶固定化載體的潛質(zhì)，但聚己締醇海綿僅含有哲基活性基團(tuán)，不利于采用化 學(xué)鍵固定轉(zhuǎn)氨酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種經(jīng)濟(jì)可行的，載酶量高、固定化酶酶活 高、有純化作用的轉(zhuǎn)氨酶的固定化方法。
[0007] 本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)氨酶的固定化方法，其特征包括如下步驟：
[000引 a、氧化；取聚己締醇海綿，在雙氧水溶液中，加入鐵鹽為催化劑，將聚己締醇海綿 上部分哲基氧化為幾基；氧化后的聚己締醇海綿離屯、或擠壓去除氧化溶液，加水，再離屯、或 擠壓脫水。
[0009] b、轉(zhuǎn)氨；將脫水海綿與轉(zhuǎn)氨酶水溶液混合，加入輔酶、氨基供體，將海綿上的幾基 轉(zhuǎn)化氨基；再離屯、或擠壓去除海綿中溶液。
[0010] C、交聯(lián)固定；加入絮凝劑使酶沉淀于海綿孔壁內(nèi)，再離屯、或擠壓去除海綿中溶液； 再將海綿與多元醒混合交聯(lián)轉(zhuǎn)氨酶，離屯、或擠壓去除海綿中溶液。
[0011] t視需要重復(fù)步驟b至C數(shù)次，W增加酶或細(xì)胞在載體上的載量。水洗漆固定化 酶。
[0012] 其中，a步驟所述的雙氧水溶液體積濃度為0.01~0.1%，雙氧水溶液與聚己締醇 海綿重量比為20~100:1。
[0013] 其中，a步驟所述的鐵鹽選自硫酸亞鐵、硫酸鐵、氯化亞鐵、氯化鐵的一種或多種。
[0014] 其中，a步驟所述的氧化反應(yīng)溫度為20°C~70°C，進(jìn)一步優(yōu)選為55°C~65°C。
[0015] 其中，b步驟所述的氨基供體為2-丙胺。
[0016] 其中，b步驟所述的輔酶為B族維生素，進(jìn)一步優(yōu)選為化唉醒、化唉胺、磯酸化唉 醇、磯酸化唉胺、磯酸化唉醒的一種或多種。
[0017]其中，b步驟所述的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)溫度為20°C~60°C。
[001引其中，C步驟所述的絮凝劑選自殼聚糖、聚己締亞胺（PEI)、駿甲基聚己締亞胺 (CMPEI)0
[0019] 其中，C步驟所述的多元醒為戊二醒。
[0020] 本發(fā)明的有益技術(shù)效果：
[0021] 1、使用聚己締醇海綿為載體，聚己締醇海綿具有孔洞豐富，比較面積大，載酶量大 的特點(diǎn)；2、聚己締醇海綿中部分哲基氧化為幾基，幾基經(jīng)轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)化為氨基，氨基通過(guò)戊二 醒與轉(zhuǎn)氨酶化學(xué)交聯(lián)，化學(xué)鍵連接酶與載體更牢固，酶不易脫落，穩(wěn)定性好；3、轉(zhuǎn)氨過(guò)程中， 轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)入海綿孔洞，催化海綿上的幾基轉(zhuǎn)化為氨基，從而轉(zhuǎn)氨酶"富集"于海綿中，加入絮 凝劑，轉(zhuǎn)氨酶則沉淀于海綿孔壁內(nèi)，其他雜質(zhì)則無(wú)該"富集"現(xiàn)象，雜質(zhì)在"離屯、或擠壓去除 海綿中溶液"步驟中隨溶液被除去，本發(fā)明對(duì)轉(zhuǎn)氨酶有純化作用，可在固定化酶應(yīng)用過(guò)程中 消除部分雜酶引起的副反應(yīng)。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 實(shí)施例1
[0023] 本實(shí)施例的轉(zhuǎn)氨酶的固定化方法，包括如下步驟：
[0024]a、將聚己締醇海綿切成27mm3,取10. 0克海綿顆粒加入燒杯中，加入1000ml水，機(jī) 械攬拌，加入O.OlOg硫酸亞鐵，加入1.00ml30%雙氧水，升溫至60°C，反應(yīng)4小時(shí)。將反 應(yīng)液倒入布袋中，將布袋中的海綿顆粒擠壓干，在將布袋浸泡于純化水中5分鐘，再將布袋 中的海綿顆粒擠壓干脫水，得氧化聚己締醇海綿。
[002引 b、將氧化聚己締醇海綿，加入燒杯中，加入1000ml水，機(jī)械攬拌，加入10克 ATA-113轉(zhuǎn)氨酶（Codex⑥），加入1克異丙胺鹽酸鹽，加入0. 50克磯酸化唉醒，用異丙胺調(diào) 節(jié)抑至7. 5,加熱至40°C反應(yīng)6小時(shí)，將反應(yīng)液倒入布袋中，將布袋中的海綿顆粒擠壓干， 得氨基化聚己締醇海綿。
[0026] C、將氨基化聚己締醇海綿倒入燒杯中，加入0. 1 %殼聚糖溶液100ml，混合10 分鐘，將反應(yīng)液倒入布袋中，將布袋中的海綿顆粒擠壓干；將所得海綿倒入燒杯中，加入 0. 1 %戊二醒溶液100ml，混合，靜置5分鐘，將反應(yīng)液倒入布袋中，將布袋中的海綿顆粒擠 壓干，得固定化酶。
[0027] 將所得固定化酶重復(fù)步驟b至c5次，W增加酶在載體上的載量。
[002引純化水浸泡固定化酶，擠壓脫水，40°C真空干燥8小時(shí)，得31. 7克固定化轉(zhuǎn)氨酶。
[0029] 每1克聚己締醇海綿載體固載約2克轉(zhuǎn)氨酶，遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于CN2012800312371克樹(shù)脂 載體僅能固載0. 125克轉(zhuǎn)氨酶的水平；酶活收率高達(dá)96%，說(shuō)明未固載損失的重量為去除 的雜質(zhì)的重量。
[0030] 實(shí)施例2
[0031] 本實(shí)施例的轉(zhuǎn)氨酶的固定化方法，包括如下步驟：
[0032]a、將聚己締醇海綿切成27mm3。2000升反應(yīng)蓋中，加入1000升水，開(kāi)啟攬拌，加入 10. 00千克海綿顆粒，加入加入10克硫酸亞鐵，加入1. 00升30%雙氧水，升溫至55°C，反 應(yīng)5小時(shí)。將反應(yīng)液使用=足式離屯、機(jī)過(guò)濾，加入純化水洗漆，離屯、脫水，得氧化聚己締醇 海綿。
[0033]b、2000升反應(yīng)蓋中，加入1000升水，開(kāi)啟攬拌，加入氧化聚己締醇海綿，加入20千 克ATA-117轉(zhuǎn)氨酶（Codex⑧），加入2. 00千克異丙胺鹽酸鹽，加入0. 75千克磯酸化唉醒， 用異丙胺調(diào)節(jié)抑至8. 0,加熱至37°C反應(yīng)8小時(shí)，將反應(yīng)液離屯、過(guò)濾，脫除溶液，得氨基化 聚己締醇海綿。
[0034] C、將氨基化聚己締醇海綿倒入100升0. 3 %殼聚糖溶液中，混合10分鐘，將混合液 離屯、過(guò)濾，脫除溶液；將所得海綿倒入燒杯中，加入100升0.2%戊二醒溶液中，混合，靜置 10分鐘，將將混合液離屯、過(guò)濾，脫除溶液，得固定化酶。
[0035] 將所得固定化酶重復(fù)步驟b至c3次，W增加酶在載體上的載量。
[0036] 純化水洗漆，離屯、脫水，40°C真空干燥12小時(shí)，得35. 32千克固定化轉(zhuǎn)氨酶。
[0037] 實(shí)施例3
[003引本實(shí)施例的轉(zhuǎn)氨酶的固定化方法，包括如下步驟：
[0039] a、將聚己締醇海綿切成27mm3。2000升反應(yīng)蓋中，加入1000升水，開(kāi)啟攬拌，加入 10. 00千克海綿顆粒，加入加入10克氯化鐵和5千克氯化亞鐵，加入4. 00升10 %雙氧水， 升溫至60°C，反應(yīng)5小時(shí)。將反應(yīng)液使用=足式離屯、機(jī)過(guò)濾，加入純化水洗漆，離屯、脫水，得 氧化聚己締醇海綿。
[0040] b、2000升反應(yīng)蓋中，加入1000升水，開(kāi)啟攬拌，加入氧化聚己締醇海綿，加入5千 克ATA-117轉(zhuǎn)氨酶（Codex⑧），加入2. 00千克異丙胺鹽酸鹽，加入0. 5千克磯酸化唉醇和 0. 5千克磯酸化唉胺，用異丙胺調(diào)節(jié)抑至8. 0,加熱至30°C反應(yīng)8小時(shí)，將反應(yīng)液離屯、過(guò)濾， 脫除溶液，得氨基化聚己締醇海綿。
[0041] C、將氨基化聚己締醇海綿倒入100升0. 4%聚己締亞胺溶液中，混合10分鐘，將混 合液離屯、過(guò)濾，脫除溶液；將所得海綿倒入燒杯中，加入100升0. 3%戊二醒溶液中，混合， 靜置8分鐘，將將混合液離屯、過(guò)濾，脫除溶液，得固定化酶。
[0042] 將所得固定化酶重復(fù)步驟b至C12次，W增加酶在載體上的載量。
[0043] 純化水洗漆，離屯、脫水，40°C真空干燥14小時(shí)，得35. 87千克固定化轉(zhuǎn)氨酶。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種轉(zhuǎn)氨酶的固定化方法，其特征包括如下步驟： a、 氧化：取聚乙烯醇海綿，在雙氧水溶液中，加入鐵鹽為催化劑，20°C~70°C反應(yīng)，將 聚乙烯醇海綿上部分羥基氧化為羰基；氧化后的聚乙烯醇海綿離心或擠壓去除氧化溶液， 加水，再離心或擠壓脫水； b、 轉(zhuǎn)氨：將脫水海綿與轉(zhuǎn)氨酶水溶液混合，加入輔酶、氨基供體，將海綿上的羰基轉(zhuǎn)化 氨基；再離心或擠壓去除海綿中溶液； c、 交聯(lián)固定：加入絮凝劑使酶沉淀于海綿孔壁內(nèi)，再離心或擠壓去除海綿中溶液；再 將海綿與多元醛混合交聯(lián)轉(zhuǎn)氨酶，離心或擠壓去除海綿中溶液； d、 視需要重復(fù)步驟b至c步O~20次，以增加酶或細(xì)胞在載體上的載量，水洗滌固定 化酶。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述固定化方法，其特征在于：a步驟所述的雙氧水溶液體積濃度為 0.01~0. 1%，雙氧水溶液與聚乙烯醇海綿重量比為20~100:1。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述固定化方法，其特征在于：a步驟所述的鐵鹽為硫酸亞鐵、硫酸 鐵、氯化亞鐵、氯化鐵中的一種或多種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述固定化方法，其特征在于：a步驟所述反應(yīng)溫度為55°C~65°C。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述固定化方法，其特征在于：b步驟所述的氨基供體為2-丙胺。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述固定化方法，其特征在于：b步驟所述的輔酶為B族維生素。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述固定化方法，其特征在于：b步驟所述的B族維生素為吡哆醛、 吡哆胺、磷酸吡哆醇、磷酸吡哆胺、磷酸吡哆醛中的一種或多種。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述固定化方法，其特征在于：b步驟所述的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)溫度為 20°C~60°C〇
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述固定化方法，其特征在于：c步驟所述的絮凝劑選自殼聚糖、聚 乙烯亞胺、羧甲基聚乙烯亞胺中的一種或多種。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述固定化方法，其特征在于：c步驟所述的多元醛為戊二醛。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)氨酶的固定化方法。將聚乙烯醇海綿上的羥基氧化為羰基，加入轉(zhuǎn)氨酶將羰基轉(zhuǎn)化為氨基，絮凝后，再用多元醛交聯(lián)固定化，得固定化轉(zhuǎn)氨酶。該固定化方法，具有酶活單位為高，可純化酶等優(yōu)點(diǎn)。
【IPC分類(lèi)】C12N11-08
【公開(kāi)號(hào)】CN104774830
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510140422
【發(fā)明人】黃清東, 張翔, 向世明
【申請(qǐng)人】成都百特萬(wàn)合醫(yī)藥科技有限公司
【公開(kāi)日】2015年7月15日
【申請(qǐng)日】2015年3月27日