具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性的扁杏仁肽及其制備方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)用蛋白或肽/蛋白
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及兩種具有顯著的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE)抑制活性的扁杏仁肽及其制備方法?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]目前，天然生物活性肽研究的蛋白來源主要有：（1)植物性來源：大豆/豆柏、米糟、花生、杏仁等；（2)動(dòng)物性來源：蠶絲、豬肉、雞肉、動(dòng)物皮/骨、動(dòng)物毒液等。[0003]生物活性肽的作用研究方向主要有：（1)抗高血壓活性；（2)抗氧化活性；（3)抗血栓活性；(4)抗菌作用；（5)免疫作用；(6)拮抗與抗拮抗活性；（7)抗炎癥作用等。[0004]以上成果大多停留在色譜分析水平，沒有制取到足夠的純凈樣品。有的僅進(jìn)行了體外或細(xì)胞活性研究兩者中的一項(xiàng)，不能充分證明產(chǎn)物的安全和有效性?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供兩種具有顯著的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性的扁杏仁肽，以及這兩種扁杏仁肽的制備方法。[0006]解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：該扁杏仁肽的氨基酸序列為a-His-Thr-Asp-Asp，其中a代表Met或Gin。[0007]本發(fā)明具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性的扁杏仁肽的制備方法由下述步驟組成：[0008]1、提取扁杏仁蛋白[0009]將扁杏仁依次經(jīng)熱水脫皮、粉碎、脫脂、溶劑提取、乙醇和等電點(diǎn)沉降法復(fù)合沉淀、冷凍干燥，得到扁杏仁蛋白。[0010]2、蛋白酶解[0011]將步驟1得到的扁杏仁蛋白先用Protamex復(fù)合蛋白酶水解，然后用Alcalase堿性蛋白酶水解，離心分離，上清液冷凍干燥，得到扁杏仁總肽。[0012]3、葡聚糖凝膠層析[0013]將步驟2得到的扁杏仁總肽與超純水按質(zhì)量體積比為30~50g:1L混合，脫氣、超濾膜過濾后加入SephadexG-15填充柱中，以超純水為流動(dòng)相，采用自動(dòng)液相色譜分離層析儀進(jìn)行分離，進(jìn)樣量2mL，流速3mL/分鐘；收集19~40分鐘所有流出成分，冷凍干燥。[0014]4、反相制備色譜分離[0015]將步驟3冷凍干燥后得到的產(chǎn)品與超純水按質(zhì)量體積比為40~60g:1L混合，用超濾膜過濾，超聲脫氣后，注射入制備色譜系統(tǒng)，進(jìn)樣量lmL，采用SinochromODS-BP色譜柱分離，洗脫相A為乙腈，洗脫相B為含0.05%三氟乙酸的超純水，梯度洗脫程序：0~10分鐘，20%乙腈；10~30分鐘，20%~40%乙腈；30~40分鐘，40%~70%乙腈；流速12mL/分鐘；收集8.52~9.14分鐘和14.87~15.26分鐘流出的兩種成分，冷凍干燥，得到氨基酸序列為Met-His-Thr-Asp-Asp和Gln-His-Thr-Asp-Asp的扁杏仁肽。[0016]本發(fā)明的扁杏仁蛋白可根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)公開的任意一種提取方法提取。[0017]本發(fā)明以扁杏仁為原料，先提取扁杏仁蛋白，再將扁杏仁蛋白酶解后得到的扁杏仁總肽經(jīng)葡聚糖凝膠層析、反相制備色譜分離得到兩種扁杏仁肽。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所制備的兩種扁杏仁肽具有較高的ACE抑制活性，其中氨基酸序列為Met-His-Thr-Asp-Asp的扁杏仁肽對(duì)ACE抑制活性的IC5。值為67.52±0.05yg/mL，氨基酸序列為Gln-His-Thr-Asp-Asp的扁杏仁肽對(duì)ACE抑制活性的IC5。值為43.18±0.07yg/mL，且細(xì)胞毒性較低，因而可以作為降壓藥物?！揪唧w實(shí)施方式】[0018]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅限于這些實(shí)施例。[0019]實(shí)施例1[0020]1、提取扁杏仁蛋白[0021]根據(jù)公布號(hào)為CN102845585A、發(fā)明名稱為"聚乙二醇-微波輔助提取杏仁蛋白的方法"中實(shí)施例1公開的方法提取扁杏仁蛋白。[0022]2、蛋白酶解[0023]將扁杏仁蛋白與蒸餾水按質(zhì)量體積比為40g:1L混合，在溫度為42°C水浴中先用Protamex復(fù)合蛋白酶在pH值為6.5下水解100分鐘，加酶量為53140U/g蛋白，水解完后在沸水浴中滅酶20分鐘，然后在溫度為53°C的環(huán)境中用Alcalase堿性蛋白酶在pH值為7.6下酶解90分鐘，加酶量為1130U/g蛋白，酶解完后在沸水浴中滅酶20分鐘，酶解過程用0.5mol/LNaOH水溶液調(diào)節(jié)pH值；10000轉(zhuǎn)/分鐘離心分離20分鐘，所得上清液在-40°C冷凍干燥24小時(shí)，得到扁杏仁總肽。[0024]3、葡聚糖凝膠層析[0025]將2.06g扁杏仁總肽與超純水按質(zhì)量體積比為40g:1L混合，脫氣、超濾膜過濾后加入SephadexG-15填充柱中，以超純水為流動(dòng)相，采用自動(dòng)液相色譜分離層析儀（上海滬西分析儀器廠提供）在檢測波長為280nm、進(jìn)樣量為2mL、流速為3mL/分鐘下進(jìn)行分離，收集19~40分鐘所有流出成分，如此反復(fù)試驗(yàn)，合并流出組分，在-40°C冷凍干燥24小時(shí)，得到產(chǎn)品共0.76g。[0026]4、反相制備色譜分離[0027]將步驟3葡聚糖凝膠層析中得到的0.76g產(chǎn)品與超純水按質(zhì)量體積比為50g:1L混合，用超濾膜過濾，超聲脫氣20分鐘后，注射入島津LC-10A制備色譜系統(tǒng)，色譜柱為大連伊利特Sinochrom0DS-BP，檢測波長220nm，進(jìn)樣量lmL，流速12mL/min，洗脫相A為乙腈，洗脫相B為超純水（含0.05wt.%三氟乙酸），梯度洗脫程序：0~10分鐘，20%(體積濃度）乙腈；10~3〇分鐘，2〇%~40%(體積濃度）乙腈；3〇~40分鐘，40%~7〇%(體積濃度）乙腈；收集8.52~9.14分鐘和14.87~15.26分鐘流出的兩種成分，在-40°C冷凍干燥24小時(shí)，得到114mg肽A和12mg肽B，經(jīng)HPLC檢測證明兩種肽均為純品，經(jīng)PPSQ-31A蛋白質(zhì)自動(dòng)檢測儀檢測，肽A的氨基酸序列為Met-His-Thr-Asp-Asp，肽B的氨基酸序列為Gln-His-Thr-Asp-Asp〇[0028]發(fā)明人對(duì)實(shí)施例1得到的肽A和肽B分別進(jìn)行體外和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，具體實(shí)驗(yàn)情況如下：[0029]1、體外ACE抑制活性[0030]在37°C下，ACE可以與馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（HHL)相互作用，將其降解為馬尿酸（HA)，即同等條件下，一個(gè)物質(zhì)如果使得ACE-HHL體系中轉(zhuǎn)化出的HA越少，其ACE抑制性越強(qiáng)，即HA峰面積越小，物質(zhì)的ACE抑制性越強(qiáng)。[0031]將肽A和肽B分別用pH值為8.3的硼酸緩沖液配制成5yg/mL、10yg/mL、50yg/mL、100iig/mL、150iig/mL5個(gè)濃度，作為樣品溶液。向2mL離心管中加入120iiL5mmol/LHHL和40yL樣品溶液，于37°C水浴恒溫6min，加入100yL0.lU/mL的ACE溶液（用pH值為8.3的硼酸緩沖液配制），于恒溫磁力攪拌器中37°C恒溫4000r/min攪拌反應(yīng)60min，加入160yL1.Omol/LHC1水溶液反應(yīng)lOmin，終止反應(yīng)后用超濾膜過濾，濾液用Watersl525高效液相色譜儀測定HA，色譜條件：WatersPDA2996二極管陣列檢測器；美國安捷倫Agilent300Stable_bondC18大孔色譜柱；進(jìn)樣量20yL;流速lmL/min;檢測波長228nm;流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為超純水，兩者均含0.05%TFA;梯度洗脫程序：0~40min，10%~45%乙腈。同時(shí)pH值為8.3的硼酸緩沖液做空白對(duì)照試驗(yàn)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)平行測定3次取平均值。用SPSSStatistics進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分別擬當(dāng)前第1頁1 2