一種柳枝稷遺傳轉(zhuǎn)化的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地設(shè)及一種植物遺傳轉(zhuǎn)化的方法，特別 是設(shè)及一種柳枝稷遺傳轉(zhuǎn)化的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 纖維生物質(zhì)資源是地球上最豐富的原料，但由于一些關(guān)鍵技術(shù)的缺乏，當(dāng)前能夠 用作能源生產(chǎn)的纖維生物質(zhì)資源不到1 %?；蚬こ逃N能夠快速克服物種間的基因壁壘， 從而在短時(shí)間內(nèi)培育出高產(chǎn)抗逆且可高效轉(zhuǎn)化的新型能源草資源。因此采用基因工程的策 略，挖掘和鑒定能夠決定能源草生物量、品質(zhì)和抗逆性的關(guān)鍵基因資源，并獲得相應(yīng)的遺傳 改良植物，有助于解決纖維生物質(zhì)開發(fā)與利用過程中存在的資源不穩(wěn)和品質(zhì)不佳的瓶頸問 題。
[0003] 柳枝稷Ki巧?別歴L)是C4多年生（10-12年）高大草本植物，主要用作 牧草和能源草，是重要的纖維生物質(zhì)資源。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，柳枝稷的全基因組 已經(jīng)完成測序。然而面對(duì)海量的序列信息，如何通過高通量的遺傳轉(zhuǎn)化體系篩選獲得具有 潛在應(yīng)用價(jià)值的基因資源，仍然是當(dāng)前所面臨的一個(gè)巨大挑戰(zhàn)，因此柳枝稷的遺傳改良研 究受到了世界各國科研工作者的廣泛關(guān)注。像大多數(shù)單子植物一樣，柳枝稷難于通過農(nóng)桿 菌介導(dǎo)的方法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。目前報(bào)道的大部分柳枝稷遺傳轉(zhuǎn)化體系的效率低于10%。另 夕F，先前報(bào)道的轉(zhuǎn)基因柳枝稷植物大部分使用潮霉素篩選獲得，少數(shù)通過雙丙氨麟篩選產(chǎn) 生，但使用卡那霉素進(jìn)行篩選的柳枝稷遺傳轉(zhuǎn)化體系尚未建立。
[0004] 像大多數(shù)轉(zhuǎn)基因植物商業(yè)化生產(chǎn)一樣，優(yōu)良轉(zhuǎn)基因柳枝稷植株的獲得需要從成千 上萬棵獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因植物群體中進(jìn)行千里挑一或萬里挑一的篩選工作。因此建立高效且低 成本的柳枝稷遺傳轉(zhuǎn)體系是轉(zhuǎn)基因能源植物的商業(yè)化研發(fā)的首要目標(biāo)和核屯、內(nèi)容，也是柳 枝稷重要農(nóng)藝性狀遺傳改良和分子設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)。卡那霉素價(jià)格低廉，市售價(jià)格在2-3元/g, 而潮霉素和雙丙氨麟的平均市售價(jià)格分別為1500元/g和18000元/g,因此如果能夠建立 禾本科牧草和能源草的卡那霉素抗性篩選體系，將會(huì)極大降低柳枝稷轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)的成 本，具有巨大的商業(yè)化應(yīng)用潛力和廣闊的市場前景。而該體系的建立有助于加速專用纖維 生物質(zhì)資源新品種的定向培育，為纖維生物質(zhì)液體燃料生產(chǎn)提供充足穩(wěn)定且可高效轉(zhuǎn)化的 優(yōu)質(zhì)低成本生產(chǎn)原料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供提供一種柳枝稷高效低成本的遺傳轉(zhuǎn)化體系，用于禾本科牧 草和能源植物重要經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳改良和分子設(shè)計(jì)。
[0006] 本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的： 一種柳枝稷遺傳轉(zhuǎn)化的方法，它的內(nèi)容包括： 使用含有雙元載體的農(nóng)桿菌侵染柳枝稷typeII型高質(zhì)量胚性愈傷組織，并通過卡那 霉素抗性篩選體系獲得陽性轉(zhuǎn)基因柳枝稷植株。
[0007] 進(jìn)一步，所述的柳枝稷type II型高質(zhì)量胚性愈傷組織誘導(dǎo)自柳枝稷成熟的種子， 該愈傷組織的外部特征為淡黃色、結(jié)構(gòu)疏松且具有溫潤的光澤，其建立的方法包括：柳枝稷 成熟種子的消毒，愈傷組織的誘導(dǎo)、type II型高質(zhì)量胚性愈傷組織的獲得和擴(kuò)繁。
[000引在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述的農(nóng)桿菌菌株為公倒W頌^齡ZA
[0009] 進(jìn)一步，所述的用于柳枝稷遺傳轉(zhuǎn)化的雙元載體含有卡那霉素抗性基因（^^ //)，除了含有上述篩選標(biāo)記基因外，適合本發(fā)明使用的質(zhì)粒還含有一個(gè)或一個(gè)W上的不同 目的基因。
[0010] 本發(fā)明可用于在植物中過表達(dá)或RNAi抑制任何基因。目的基因可W是逆境抗性 基因、耐除草劑基因、細(xì)胞壁調(diào)控基因和生物量大小決定基因等。
[0011] 本發(fā)明中所述的柳枝稷的生態(tài)型為低地型和高地型。
[0012] 本發(fā)明中所述的抗性篩選試劑為卡那霉素。
[0013] 一種柳枝稷遺傳轉(zhuǎn)化的方法，它具體包括柳枝稷成熟種子的消毒，type II型高質(zhì) 量胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和擴(kuò)繁、卡那霉素篩選獲得農(nóng)桿菌侵染后的抗性愈傷W及抗性愈傷 再生和生根并最終獲得陽性轉(zhuǎn)基因柳枝稷植株步驟。
[0014] 所述的柳枝稷成熟種子消毒，將柳枝稷的成熟種子用3% (W/V)次氯酸巧消毒2小 時(shí)后，使用無菌蒸饋水清洗3次(每次5分鐘)，然后置于4°C冰箱過夜，次日繼續(xù)使用5%(W/ V)次氯酸巧消毒1. 5小時(shí)，然后使用無菌蒸饋水清洗3次(每次5分鐘）。
[0015] 所述的type II型高質(zhì)量胚性愈傷組織的獲得，把消毒清洗后的柳枝稷成熟種子 接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MSD5)上，培養(yǎng)箱溫度25 ± 2 °C，暗培養(yǎng)6-7周，獲得愈傷組織。 把所獲得的愈傷組織采用目視法進(jìn)行篩選，選擇其中淡黃色、結(jié)構(gòu)疏松且具有溫潤的光澤 的胚性愈傷組織即為type II型高質(zhì)量胚性愈傷組織，將獲得的type II胚性愈傷組織進(jìn) 行繼代擴(kuò)繁，培養(yǎng)箱溫度25 ± 2 °C，暗培養(yǎng)，每3-4周繼代一次。
[0016] 所述的愈傷組織的農(nóng)桿菌侵染，把所述的擴(kuò)繁的typeII型高質(zhì)量胚性愈傷組織 分成小塊，然后置于=通干燥皿中抽真空，使用含有攜帶卡那霉素抗性基因（畔^ //)的雙 元載體的農(nóng)桿菌菌液對(duì)所述的柳枝稷typeII型高質(zhì)量胚性愈傷組織進(jìn)行共解育，然后去 除殘留的農(nóng)桿菌菌液，25±2°C，黑暗中共培養(yǎng)3天，將共培養(yǎng)后的愈傷組織轉(zhuǎn)接于抗性愈 傷組織篩選培養(yǎng)基MSD3K進(jìn)行篩選，培養(yǎng)箱溫度25 ± 2°C，暗培養(yǎng)，每3個(gè)周轉(zhuǎn)接一次，直到 抗性愈傷組織長出，將獲得的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)接到抗性愈傷組織篩選培養(yǎng)基MSK2K上，組 培室溫度25 +2°C，光照時(shí)間每天1化光/化暗，每4個(gè)周轉(zhuǎn)接一次，直到抗性芽長出；獲得 的抗性再生芽轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基MSR上，組培室溫度25±2°C，光照時(shí)間每天1化光/化暗； 獲得的再生苗按照常規(guī)方法移栽到±中，2周后再生苗成活。
[0017] 進(jìn)一步，所述的抗性愈傷組織篩選培養(yǎng)基MS3DK(pH=5. 8)為MS基本培養(yǎng)基添加 30g/L薦糖、3mg/L2, 4-D、150mg/L卡那霉素、400mg/L頭抱塞朽鋼和7. 5g/L瓊脂，高壓滅菌 15min。
[0018] 進(jìn)一步，所述的抗性芽再生培養(yǎng)基MSK2K(pH=5.8)為MS基本培養(yǎng)基添加30g/L薦 糖、2mg/L激動(dòng)素、50mg/L卡那霉素、400mg/L頭抱塞朽鋼和7.5g/L瓊脂，高壓滅菌15min。
[0019] 進(jìn)一步，所述的抗性芽生根培養(yǎng)基MSR(pH=5. 8)為1/2MS基本培養(yǎng)基添加15g/L 薦糖、400mg/L頭抱塞朽鋼和7. 5g/L瓊脂，高壓滅菌15min。
[0020]本發(fā)明中所述的農(nóng)桿菌侵染率愈傷系的平均遺傳轉(zhuǎn)化效率為60%，從農(nóng)桿菌侵染 柳枝稷愈傷組織到轉(zhuǎn)基因植物溫室移栽的周期為4-5個(gè)月，每人每年能夠轉(zhuǎn)化至少100個(gè) 基因，產(chǎn)生大于2000棵獨(dú)立的陽性轉(zhuǎn)基因植株。
[0021] 本發(fā)明中的基因克隆、載體構(gòu)建和農(nóng)桿菌侵染均可使用標(biāo)準(zhǔn)方法實(shí)現(xiàn)。
[0022] 本發(fā)明的核屯、特點(diǎn)在于柳枝稷遺傳轉(zhuǎn)化體系兼具高效和低成本兩大優(yōu)勢，且首次 在柳枝稷中成功建立卡那霉素抗性篩選體系，從而確保獲得足夠數(shù)量的陽性轉(zhuǎn)基因植物用 于牧草和能源草的商業(yè)化生產(chǎn)。
[0023] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果： 1)轉(zhuǎn)化效率高：本發(fā)明產(chǎn)生陽性轉(zhuǎn)基因柳枝稷植物的遺傳轉(zhuǎn)化效率高達(dá)60%，從愈傷 組織的農(nóng)桿菌侵染到轉(zhuǎn)基因植物溫室移栽僅需要4-5個(gè)月，從而能夠?qū)崿F(xiàn)每人每年轉(zhuǎn)化至 少100個(gè)基因載體，產(chǎn)生大于2000棵獨(dú)立的陽性轉(zhuǎn)基因植株的工作效率。
[0024] 2)成本低廉：植物抗性篩選劑是決定轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)成本的一個(gè)重要因素，本發(fā) 明的方法首次使用價(jià)格低廉的卡那霉素作為轉(zhuǎn)基因柳枝稷植物的抗性篩選試劑，是當(dāng)前柳 枝稷遺傳轉(zhuǎn)化中普遍使用的潮霉素和雙丙氨麟使用成本的1/100,從而極大降低了轉(zhuǎn)基因 植物商業(yè)化生產(chǎn)的成本。
[00巧]3)限制性?。罕景l(fā)明中高質(zhì)量胚性愈傷組織誘導(dǎo)于植物成熟種子，其來源豐富，能 夠提供足夠數(shù)量的typeII型高質(zhì)量胚性愈傷組織，且獲得的高質(zhì)量胚性愈傷組織可通過 繼代擴(kuò)繁持續(xù)保存，不受植物發(fā)育時(shí)期的限制，能夠保證用于遺傳轉(zhuǎn)化的外植體材料的持 續(xù)充足供應(yīng)。
[0026] 表1巧啦稷遺傳轉(zhuǎn)化中不同植物抗性篩選劑的使用成本比較

【附圖說明】
[0027] 圖1 :實(shí)施例1中柳枝稷成熟種子誘導(dǎo)的typeII型高質(zhì)量胚性愈傷組織。
[0028] 圖2 :實(shí)施例2中農(nóng)桿菌介導(dǎo)的柳枝稷遺傳轉(zhuǎn)化流程。A.實(shí)施例2中用于柳枝稷 遺傳轉(zhuǎn)化的雙元載體T-DNA簡圖。pMDC100雙元載體含有卡那霉素抗性基因（Wt//)，可 用于柳枝稷遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立；B.農(nóng)桿菌侵染后的愈傷組織共培養(yǎng)；C.卡那霉素篩選的 抗性愈傷組織；D.卡那霉素篩選的抗性芽化生根的抗性芽(抗性苗）；F.溫室生長的轉(zhuǎn)基 因柳枝稷植物。
[002引圖3 :實(shí)施例3中轉(zhuǎn)基因柳枝稷植物的PCR鑒定。M:DNAMarker; 1-13 :轉(zhuǎn)化的柳 枝稷植株；Ck- :PCR系統(tǒng)的陰性對(duì)照(無DNA模板);WT:未轉(zhuǎn)基因的野生型柳枝稷植物；CK+ : pMDClOO雙元載體質(zhì)粒。
[0030]
【具體實(shí)施方式】： 下面W低地型柳枝稷遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立為實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述， 所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑、 雙元載體和農(nóng)桿菌等，如無特殊說明，均可從公司通過商業(yè)途徑購到，所述的MS基本培養(yǎng) 基購自PhytoTechnologyL油oratories(貨號(hào)：M519)。
[0031] 實(shí)施例1:柳枝稷typeII型高質(zhì)量胚性愈傷組織的獲得和擴(kuò)繁，其包括W下步 驟： 1)將柳枝稷的成熟種子用3% (W/V)次氯酸巧消毒2小時(shí)后，使用無菌蒸饋水清洗3次 (每次5分鐘)，然后置于4°C冰箱過夜，次日繼續(xù)使用5% (W/V)次氯酸巧消毒1. 5小時(shí)，然 后使用無菌蒸饋水清洗3次(每次5分鐘)，接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MSD5)上，并對(duì)每 一顆種子進(jìn)行編號(hào)，培養(yǎng)箱溫度25 ± 2 °C，暗培養(yǎng)6-7周，獲得愈傷組織。
[0032] 2)將步驟（1)所獲得的愈傷組織采用目視法挑選其中淡黃色、結(jié)構(gòu)疏松且具有溫 潤的光澤的typeII型高質(zhì)量胚性愈傷組織（圖1)，接種于MSD5培養(yǎng)基上，進(jìn)行保存和擴(kuò) 繁，培養(yǎng)箱溫度25 + 2 °C，暗培養(yǎng)，每3-4周繼代一次。
[0033] 所述的柳枝稷成熟種子為低地型柳枝稷品種Al