一種氰化物高效降解菌的高通量篩選方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及一種氯化物高效降解菌的高通量篩選方法。
【背景技術】
[0002] 含氯廢水泛指含有各種氯化物的廢水。水體中的氯化物主要來源于氯化電鍛、礦 物的開采和提煉、熱處理、煉焦、攝影沖印、制藥、合成纖維、電爐、煤氣化、染料、制革、塑料、 鋼錠的表面澤火W及工業(yè)氣體洗涂等。當廢水中氯處于合適的酸性范圍內(nèi)，會產(chǎn)生劇毒的 氨氯酸，因而含氯廢水必須經(jīng)過除氯處理才能排放。
[0003] 氯化物雖屬劇毒物質(zhì)，但某些微生物可W從氯化物中取得碳、氮養(yǎng)料，有的微生物 甚至W其作為唯一的碳源和氮源，在其代謝過程中將氯化物轉(zhuǎn)化為二氧化碳、氨或甲酸、甲 酷胺等，從而使含氯化物廢水具有可生物降解性。研究表明，生物法能夠克服對金屬氯絡合 物脫除不徹底、處理費用高、產(chǎn)生余氯等缺點，因此，近年來利用生物法處理含氯廢水取得 了較大的發(fā)展。
[0004] 由于可降解氯化物的菌株數(shù)量眾多，所W通過定量測定氯化物降解菌的降解活性 來篩選高活性氯化物降解菌的菌株工作量巨大。目前，已有的幾種主要能定性分析或鑒 定氨氮的顯色技術，然后在此基礎上進行定量分析，就會大大減少工作量，提高篩選效率。 普遍采用的初篩方法主要有W下幾種：（1)《水質(zhì)氨氮的測定納氏試劑分光光度法》（町 535-2009) ; (2)《水質(zhì)氨氮的測定水楊酸分光光度法》（町536-2009) ; (3)《水質(zhì)氨氮的測 定蒸饋-中和滴定法》（町537-2009) ; (4)《水質(zhì)氨氮的測定氣相分子吸收光譜法》（町T 195-2005) ; (5)《水質(zhì)氨氮的測定連續(xù)流動-水楊酸分光光度法》（町665-2013) ; (6)《水 質(zhì)氨氮的測定流動注射-水楊酸分光光度法》（町666-2013)等方法。上述前S種方法耗 時長，不適合大量菌株的篩選工作，后兩種測定方法需要購買昂貴的儀器設備，受到資金方 面的制約，所W，需要開發(fā)高效、簡便、精準、快速的高通量篩選技術提高工作效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決上述【背景技術】中的不足之處，本發(fā)明提供了一種氯化物高效降解菌的高 通量篩選方法，包括步驟：S1、配制培養(yǎng)液；S2、將目標菌株接種于96孔板中；S3、往96孔板 中添加Sl中所配制的培養(yǎng)液；S4、往96孔板中添加顯色劑。其中，步驟S2和S3無順序先 后之分。
[0006] 本發(fā)明提供的氯化物高效降解菌的高通量篩選方法，其根據(jù)氯化物生物降解形成 游離態(tài)的氨或錠離子，可與納氏試劑反應生成淡紅棟色絡合物來辨別氯化物的生物轉(zhuǎn)化程 度，結合96孔板顯色技術能對大量氯化物降解菌進行高通量快速的篩選，同時根據(jù)顏色深 淺能靈敏精確判斷氯化物降解菌降解活性的高低，并可同時可定量判斷菌株對氯化物的降 解量。氯化物被菌降解形成游離態(tài)的氨或錠離子，氨或錠離子可與納氏試劑反應生成淡紅 棟色絡合物，紅棟色的顏色越深，說明氨或錠離子的濃度越大，也就是說，同樣的氯化物底 物，研究不同菌株對它的降解效果，氯化物降解菌對氯化物的降解效果越好，降解形成的游 離態(tài)的氨或錠離子越多，與納氏試劑反應生成絡合物的顏色也就越深。
[0007] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點和效果如下：
[0008] 1.本發(fā)明利用96孔板對比顏色深淺來定性判斷氯化物降解菌株降解性能的高 低，并可同時定量菌株對氯化物的降解量，對篩選氯化物降解菌較為靈敏和準確。
[0009] 2.《水質(zhì)氨氮的測定納氏試劑分光光度法》（町535-2009)中，當水樣體積為 50ml，使用20mm比色皿時，方法的檢出限為0. 025mg/L，測定下限為0.lOmg/l，測定上限為 2.Omg/L(均WN計）。而根據(jù)本發(fā)明所提供的方法，當水樣體積為100y1，方法的檢出限 為0. 002mg/L，測定下限為0. 05mg/l，測定上限為10.Omg/L(均WN計）。本方法的檢出限 為町535-2009的十分之一，測定上限為的町535-2009的10倍，且一次可測定96個樣品， 提高實驗效率。
【具體實施方式】
[0010] 本發(fā)明提供了一種氯化物高效降解菌的高通量篩選方法，包括步驟：S1、配制培養(yǎng) 液；S2、將目標菌株接種于96孔板中；S3、往96孔板中添加Sl中所配制的培養(yǎng)液；S4、往96 孔板中添加顯色劑和酒石酸鐘鋼溶液。其中，步驟S2和S3無順序先后之分，顯色劑和酒石 酸鐘鋼添加的順序無先后之分。酒石酸鐘鋼在本發(fā)明中作為掩蔽劑，用于消除巧儀等金屬 離子干擾。
[0011] 在一些實施例中，所述目標菌株為氯化物降解菌株。
[0012] 在一些實施例中，所述步驟S4還包括：往96孔板的各孔中添加酒石酸鐘鋼，在96 孔板的各孔中加入的酒石酸鐘鋼的含量為0-100yL。
[0013] 在一些實施例中，往96孔板的各孔中添加Sl中所配制的培養(yǎng)液，將目標菌株接種 于96孔板，并于15-38°C下，在所述培養(yǎng)液中培養(yǎng)24-4化。
[0014] 在一些實施例中，本發(fā)明所述培養(yǎng)液的PH為6. 5-8,優(yōu)選地，每1000血本發(fā)明所述 的培養(yǎng)液中可含有濃硫酸4. 5-6mU在上述Kl值范圍下更有利于本發(fā)明氯化物降解菌株的 生長。
[0015] 在一些實施例中，所述培養(yǎng)液按如下組成配制：巧樣酸鋼，1. 5-2. 5g;皿2口〇4， 0. 9g;胞2冊〇4 ? 12&0,6.Sg;(畑4)25〇4,〇. 3-0.Sg;M拆〇4 ? 7&0,0. 15-0. 25g;微量元素溶液， 0. 5-1. 5血；添加蒸饋水至1000血。進一步優(yōu)選地，所述培養(yǎng)液可按如下組成配制：巧樣酸 鋼，2g;皿2口〇4,〇. 9g;胞2冊〇4 ? 12&0,6. 5g; (NH4)2S04,0. 4g;M拆〇4 ? 7&0,0. 2g;微量元素溶 液，1血；氯化物20-200mg;補足蒸饋水至1000血。
[0016] 在一些實施例中，所述氯化物選自絡合氯、有機氯或者是無機氯中的一種或多種， 例如氯化鐘或氯化鋼。
[0017] 在一些實施例中，本發(fā)明所使用的微量元素溶液可使用市購產(chǎn)品，也可自制，例 如，所述微量元素溶液按如下組成配制：1血微量元素中含有化S〇4? 7&0,Ig;MnS〇4? &0， Ig;Na2Mo〇4 ?細2〇,〇- 25g;馬8〇4,0.Ig;CuCl2 ?細2〇,〇- 25g;ZnCl2,〇. 25g;順4 ?V〇3,0.Ig; Co(N〇3)2 ? 6馬0,0. 25g;NiS〇4 ? 6馬0,0.Ig。
[0018] 在一些實施例中，在96孔板的各孔中，加入的培養(yǎng)液的添加量為100-300yL目 標菌株的添加量為5-50yL顯色劑的添加量為100-200yL。
[0019] 在一些實施例中，本發(fā)明所使用的顯色劑可使用市購產(chǎn)品，也可按如下組成配制： l-20g氨氧化鋼，0.Ol-IOg艦化鐘，0.Ol-IOg艦化隸，5-lOOg酒石酸鐘。進一步優(yōu)選地，每 100血顯色劑中包含：5-15g氨氧化鋼，0. 5-5g艦化鐘，0. 5-5g艦化隸，IO-SOg酒石酸鐘。
[0020] 在一些實施例中，所述步驟S4顯色時間為5-120min。
[0021] 在一些實施例中，本發(fā)明所提供的氯化物高效降解菌的高通量篩選方法還包括步 驟S5:在420nm波長處進行酶標儀的紫外吸收測定，OD(opticaldensity，光密度）值相對 高的孔對應的菌株即為篩選出的氯化物降解率高的菌株。
[0022] 數(shù)據(jù)處理、分析方法：稱取3.819g氯化錠（NH4CI，優(yōu)級純，在100~105°C干 燥化)，溶于水中，移入1000 ml容量瓶中，稀釋至標線，得到氨氮標準膽備溶液（PW= 1000yg/ml)。吸取5.OOml氨氮標準膽備溶液于500ml容量瓶中，稀釋至刻度，得氨氮標準 工作溶液（PN=10g/mU(可在2~5°C保存1個月）。
[0023] 標準曲線的繪制：根據(jù)標準曲線計算氨氮含量及氯化物降解率?？砂碬下方法得 標準曲線：使用上述氨氮標準工作溶液，分別配制濃度PW為〇、〇. 05yg/ml、0. 1yg/ml、 0. 2yg/ml、0. 5yg/ml、0.8yg/ml、I. 0yg/ml、2. 0yg/ml、5. 0yg/ml、10yg/ml的氨氮標 準溶液，依次取上述氨氮標準溶液100y1、對應實施例中的顯色劑50 ^^對應實施例中的 酒石酸鐘鋼溶液50yL于96孔板中，每樣樣品做3個平行實驗，記錄好各氨氮標準溶液與 96孔板相對應的編號。顯色后，在最大吸收波長420nm處使用酶標儀測量吸光度。W濃度 P w(單位為yg/ml)為橫坐標，吸光度（A)為縱坐標，繪制標準曲線。
[0024] 本發(fā)明提供的氯化物高效降解菌的高通量篩選方法，其根據(jù)氯化物生物降解形成 游離態(tài)的氨或錠離子，可與納氏試劑反應生成淡紅棟色絡合物來辨別氯化物的生物轉(zhuǎn)化程 度，結合96孔板顯色技術能對大量氯化物降解菌進行高通量快速的篩選，同時根據(jù)顏色深 淺能靈敏精確判斷氯化物降解菌降解活性的高低，并可同時可定量判斷菌株對氯化物的降 解量。
[0025] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點和效果如下：
[0026] 1.本發(fā)明利用96孔板對比顏色深淺來定性判斷氯化物降解菌株降解性能的高 低，并可同時定量菌株對氯化物的降解量，對篩選氯化物降解菌較為靈敏和準確。
[0027] 2.《水質(zhì)氨氮的測定納氏試劑分光光度法》（町535-2009)中，當水樣體積為 50ml，使用20mm比色皿時，方法的檢出限為0. 025mg/L，測定下限為0.IOmgA,測定上限為 2.Omg/L(均WN計）。而根據(jù)本發(fā)明所提供的方法，當水樣體積為100y1，方法的檢出限 為0. 002mg/L，測定下限為0. 05mgA，測定上限為10.Omg/L(均WN計）。本方法的檢出限 為町535-2009的十分之一，測定上限為的町535-2009的10倍，且一次可測定96個樣品， 提局實驗效率。
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