專利名稱：氟核磁共振用于高通量篩選的用途的制作方法
本申請(qǐng)要求享有于2003年3月14日提交的美國(guó)專利臨時(shí)申請(qǐng)No.60/454,766的優(yōu)先權(quán)，該申請(qǐng)通過(guò)引用的方式被全文包括在本申請(qǐng)中。
背景技術(shù)：
當(dāng)前許多市場(chǎng)上所銷售的藥物都是通過(guò)高通量篩選(HTS)由先導(dǎo)化合物所發(fā)展而來(lái)的。在HTS中所使用的用于治療的標(biāo)靶通常是從可由不同方式表達(dá)的克隆基因所產(chǎn)生的重組蛋白。大的化合物集一般是對(duì)照用于識(shí)別抑制劑的蛋白質(zhì)來(lái)進(jìn)行篩選的。
在過(guò)去十年間，由于在各項(xiàng)目中有系統(tǒng)地應(yīng)用組合化學(xué)，其結(jié)果導(dǎo)致專有化合物集的規(guī)模成指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)?，F(xiàn)今，通過(guò)組合化學(xué)方法得到巨大的化合物庫(kù)，并與從傳統(tǒng)藥物化學(xué)和天然來(lái)源的化合物庫(kù)互為補(bǔ)充。機(jī)器人和自動(dòng)控制的發(fā)展和應(yīng)用使得能夠在短時(shí)間內(nèi)對(duì)大量的化合物進(jìn)行測(cè)試。若干新的檢測(cè)系統(tǒng)也被用于潛在先導(dǎo)分子的識(shí)別。
最近，核磁共振(NMR)已經(jīng)成為一種用于探測(cè)與藥物標(biāo)靶相互作用的小分子的強(qiáng)有力的方法。盡管核磁共振并非一項(xiàng)靈敏的技術(shù)，但是它的優(yōu)點(diǎn)在于較少受到在其他的檢測(cè)系統(tǒng)中所觀測(cè)到的人為現(xiàn)象的影響。最近在低溫核磁共振探針技術(shù)方面的發(fā)展已經(jīng)減少了篩選所需的時(shí)間和所需的蛋白質(zhì)的量。
核磁共振方法已被用于對(duì)照同位素標(biāo)記的蛋白質(zhì)篩選大的化合物集。在化合物混合物的存在下，對(duì)15N-1H HSQC光譜中的交叉峰的化學(xué)位移變化進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)混合物進(jìn)行去褶合從而能夠識(shí)別與蛋白質(zhì)相互影響的分子(即，產(chǎn)生化學(xué)位移的化合物)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的三維結(jié)構(gòu)是已知的且已經(jīng)獲得了蛋白質(zhì)骨架共振的具體的NMR譜帶歸屬序列時(shí)，該方法就提供了關(guān)于配體結(jié)合位點(diǎn)和配體結(jié)合方式的重要的結(jié)構(gòu)信息。
另一種進(jìn)行NMR篩選的方法是基于配體共振的檢測(cè)。在文獻(xiàn)中已經(jīng)給出了若干NMR參數(shù)以作為配體識(shí)別的工具。這些方法允許對(duì)篩選的化合物進(jìn)行快速的去褶合，并且特別適合于低親和性配體介質(zhì)的識(shí)別。
然而，這些技術(shù)還存在一些缺陷。首先，不能直接獲得關(guān)于結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)信息。其次，由于在這些試驗(yàn)中，通常使用相對(duì)于蛋白質(zhì)極大過(guò)量的測(cè)試化合物，因此不能檢測(cè)到高親和性配體和能夠與受體共價(jià)結(jié)合的分子。也就是說(shuō)，將不能檢測(cè)到與蛋白質(zhì)結(jié)合更緊密的化合物或者動(dòng)力學(xué)較慢的化合物，因?yàn)檫@些化合物在蛋白質(zhì)內(nèi)部的殘留時(shí)間比在NMR試驗(yàn)中所使用的混合時(shí)間范圍(例如，1至2秒)更長(zhǎng)。第三，溶解性差的可作為潛在配體的化合物難以被檢測(cè)到，因?yàn)樵摲椒ㄐ枰^測(cè)配體的信號(hào)。
因此，所需要的是另外的可用于探測(cè)靶分子例如蛋白質(zhì)的配體的NMR方法，該方法不存在與常規(guī)的配體觀測(cè)篩選試驗(yàn)有關(guān)的缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及合理的藥物設(shè)計(jì)。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明提供篩選與靶分子(例如，通常為蛋白質(zhì))相互作用的化合物的核磁共振(NMR)方法。該方法包括使用19F核磁共振，特別是19F核磁共振競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)，以檢測(cè)結(jié)合相互作用。
競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)包括在競(jìng)爭(zhēng)分子的存在下置換參考化合物。優(yōu)選，參考化合物結(jié)合到靶分子的結(jié)合親和性在微摩爾范圍內(nèi)。盡管也可以使用本發(fā)明的方法評(píng)價(jià)比1微摩爾更弱(即，超過(guò))的結(jié)合親和性的分子結(jié)合，但優(yōu)選與靶分子相互作用的測(cè)試化合物的結(jié)合親和性比1微摩爾更強(qiáng)(例如，在納摩爾范圍內(nèi))。
本發(fā)明的方法，特別是使用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)時(shí)，可被用于基于適當(dāng)安排的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)進(jìn)行有效的高通量篩選(HTS)，且不具有與常規(guī)配體觀測(cè)篩選試驗(yàn)相關(guān)的缺點(diǎn)。另外，該方法能夠使用單點(diǎn)測(cè)量來(lái)測(cè)定識(shí)別配體的KD值。使用該方法，可以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)例如蛋白質(zhì)或DNA和RNA片段篩選數(shù)以千計(jì)的化合物。
還發(fā)現(xiàn)本發(fā)明可被用于化學(xué)混合物(即，兩種或多種測(cè)試化合物)例如植物和真菌提取物的快速篩選?？焖俸Y選技術(shù)一般包括提供多個(gè)測(cè)試樣品，每一測(cè)試樣品包含兩種或多種測(cè)試化合物的混合物。
本發(fā)明的方法包括使用至少如下步驟識(shí)別靶分子的配體提供與靶分子相互作用的19F-標(biāo)記參考化合物；在靶分子的存在下采集19F-標(biāo)記參考化合物的1D19F核磁共振波譜；提供包含至少一種測(cè)試化合物的測(cè)試樣品(優(yōu)選多個(gè)測(cè)試樣品)；在各測(cè)試樣品與靶分子的存在下采集19F-標(biāo)記參考化合物的1D19F核磁共振波譜；比較在靶分子的存在下19F-標(biāo)記參考化合物的波譜與在各測(cè)試樣品和靶分子的存在下19F-標(biāo)記參考化合物的波譜，以測(cè)定一個(gè)或多個(gè)19F-標(biāo)記參考化合物的共振的變化；以及識(shí)別至少一種與靶分子相互作用的測(cè)試化合物，其中該測(cè)試化合物置換19F-標(biāo)記參考化合物。如果測(cè)試化合物(即，潛在的配體)將參考化合物從靶分子上置換下來(lái)，它就是一種配體。
優(yōu)選，本發(fā)明的方法包括識(shí)別參考化合物的步驟，該步驟包括在不存在靶分子的情況下采集潛在參考化合物的WaterLOGSY核磁共振波譜；在靶分子的存在下采集潛在參考化合物的WaterLOGSY核磁共振波譜；以及比較該WaterLOGSY波譜以鑒別該潛在化合物與靶分子有無(wú)相互作用。
對(duì)于本發(fā)明方法的某些具體實(shí)施方案，該參考化合物是與具有限定的行距、振幅和頻率的ERETIC信號(hào)所一起提供的。對(duì)于這些方法，在靶分子的存在下采集19F-標(biāo)記參考化合物的1D19F核磁共振波譜包括在靶分子的存在下使用ERETIC信號(hào)采集19F-標(biāo)記參考化合物的波譜；以及在各測(cè)試樣品和靶分子的存在下采集19F-標(biāo)記參考化合物的1D19F核磁共振波譜包括在各測(cè)試樣品和靶分子的存在下采集19F-標(biāo)記參考化合物的波譜。
對(duì)于本發(fā)明的某些具體實(shí)施方案，該19F-標(biāo)記參考化合物是和一種19F-標(biāo)記的非相互作用的化合物一起提供的。對(duì)于這些方法，在靶分子的存在下采集19F-標(biāo)記參考化合物的1D19F核磁共振波譜包括在的靶分子存在下采集19F-標(biāo)記參考化合物與19F-標(biāo)記的無(wú)相互作用的化合物的波譜；以及在各測(cè)試樣品與靶分子的存在下采集19F-標(biāo)記參考化合物的1D19F核磁共振波譜包括在各測(cè)試樣品以及靶分子的存在下采集19F-標(biāo)記參考化合物與19F-標(biāo)記的無(wú)相互作用的化合物的波譜。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案，本發(fā)明提供一種篩選化合物以識(shí)別靶分子的配體的方法。該方法包括采集至少一種測(cè)試化合物的第一1D19F核磁共振波譜；將該至少一種測(cè)試化合物暴露于靶分子；采集已經(jīng)暴露于靶分子的至少一種測(cè)試化合物的第二1D19F核磁共振波譜；比較第一與第二波譜以測(cè)定一個(gè)或多個(gè)共振的變化并識(shí)別至少一種與靶分子相互作用的測(cè)試化合物。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1.由于在溶液中游離的小分子的19F信號(hào)的CSA相互作用以及當(dāng)被結(jié)合到一種大高分子時(shí)隨19F的拉莫爾頻率變化所導(dǎo)致的線寬的不同。使用方程1的最后項(xiàng)進(jìn)行模擬，其假設(shè)條件為當(dāng)游離于溶液中時(shí)，對(duì)于小分子，CSA磁張量與100ppm的19F-CSA軸對(duì)稱并且相關(guān)時(shí)間τc為200ps。高分子的不同相關(guān)時(shí)間被認(rèn)為對(duì)應(yīng)于不同尺寸的高分子(曲線所表示的值)。該虛垂線表示一些市售的波譜儀。與這些波譜儀的1H拉莫爾頻率對(duì)應(yīng)的值如該垂直線所示。
圖2.使用50μM的p21活化激酶的弱親和配體化合物A(KD＝10μM)進(jìn)行的NMR篩選和去褶合。參考分子包含連接在六員芳環(huán)的CF3基團(tuán)?；瘜W(xué)位移是以TFA為參照進(jìn)行校正的。所記錄的兩個(gè)波譜中左圖是在不帶有τ＝0.1s的自旋回波圖的條件下記錄的，右圖是在帶有τ＝0.1s的條件下記錄的。圖譜(a)是僅以1.5μM的蛋白質(zhì)作為間諜分子的情形下獲得的；圖譜(b)是在20μM的七種化合物的混合物的條件下采集的，該混合物包含分子SPECS AB-323/25048456(荷蘭，Rijswijk，SPECS公司生產(chǎn))2-喹喔啉羧酸乙酯、異喹啉-3-羧酸甲酯、7-苯基-4-蝶啶醇、2-氨基-6-甲基喹喔啉-4-醇、5-甲基苯并咪唑和化合物B；圖譜(c)是在不含化合物B的混合物的存在下采集的；圖譜(d)是在僅有化合物B存在的情況下采集的。圖譜(e)所顯示的是在不含蛋白質(zhì)時(shí)將參考化合物溶于PBS中所采集的。每次試驗(yàn)采集共計(jì)進(jìn)行128次掃描并且每次掃描的重復(fù)時(shí)間為3.1s。
圖3.在用于p21活化激酶的弱親和配體化合物A以及無(wú)相互作用的三氟乙酸(TFA)分子的存在下記錄的一維19F波譜?；瘜W(xué)位移是以TFA為參照進(jìn)行校正的。每次試驗(yàn)采集共計(jì)進(jìn)行128次掃描并且每次掃描的重復(fù)時(shí)間為3.1s?；衔顰和TFA的濃度分別為50以及15μM。圖譜(a)是在不存在蛋白質(zhì)的條件下記錄的，而圖譜(b)是在1.5μM的蛋白質(zhì)的存在下記錄的。圖譜(c)對(duì)應(yīng)于圖譜(a)和(b)之間的差別。示差光譜中所存在的僅有的信號(hào)是由間諜分子所產(chǎn)生的。
圖4.通過(guò)在用于p21活化激酶的弱親和配體化合物A以及無(wú)相互作用的三氟乙酸(TFA)分子的存在下記錄的一維19F波譜進(jìn)行的HTS和去褶合。化學(xué)位移是以TFA為參照進(jìn)行校正的。圖譜(a-d)是使用50μM化合物A和15μM的TFA進(jìn)行的NMR篩選和去褶合。圖譜(a)是在不存在蛋白質(zhì)的情況下記錄的，圖譜(b-d)是在1.5μM的蛋白質(zhì)的存在下記錄的。圖譜(b)是在不存在混合物的情況下記錄的，圖譜(c)是在20μM的包含六種化合物的混合物的存在下記錄的，該混合物包含分子SPECS AB-323/25048456、2-喹喔啉羧酸乙酯、異喹啉-3-羧酸甲酯、7-苯基-4-蝶啶醇、2-氨基-6-甲基喹喔啉-4-醇、5-甲基苯并咪唑，圖譜(d)是在加入了20μM化合物B的相同化學(xué)混合物的存在下記錄的。競(jìng)爭(zhēng)分子化合物B的存在幾乎完全將參考化合物從蛋白質(zhì)(d)上取代下來(lái)，并且其波譜與溶于PBS的兩種分子的波譜(a)相似。
圖5.MDDR庫(kù)中包含一個(gè)氟原子的分子的百分比。該調(diào)查是從1981年至2000年間進(jìn)行的，時(shí)間間隔為5年。各間隔的百分比標(biāo)注在各條塊上方。
圖6.記錄的是隨HSA濃度變化的19F自旋回波波譜。對(duì)照分子(2)的CF3的共振位于+15.46ppm而間諜分子(1)的CF3共振位于+14.62ppm。該波譜是在320ms的總的自旋回波周期以及180個(gè)40ms之間的脈沖(2τ)的間隔條件下采集的。每次試驗(yàn)采集共計(jì)進(jìn)行96次掃描并且每次掃描的重復(fù)時(shí)間為3.5秒并且譜寬為25ppm。在傅里葉變換之前該數(shù)據(jù)被乘以一個(gè)1Hz指數(shù)函數(shù)。兩種分子的濃度為25μM而HSA的濃度由高到低為0、300、500、700和900nM。I(1)/I(2)的信號(hào)強(qiáng)度比由高到低為0.86、0.66、0.38、0.21和0.07。
圖7.記錄的是隨HSA濃度變化的19F自旋回波波譜。對(duì)照分子(3)的CF共振位于-64.06(下面的圖譜)以及對(duì)照分子(2)的CF3共振位于+15.46ppm(上面的圖譜)。該波譜是在80ms的總的自旋回波周期以及180個(gè)40ms的脈沖(2τ)之間的間隔條件下采集的。對(duì)于下面的圖譜總共掃描96次，而對(duì)于上面的圖譜總共掃描64次，重復(fù)時(shí)間3.5s，譜寬25ppm。在傅里葉變換之前該數(shù)據(jù)被乘以一個(gè)1Hz的指數(shù)函數(shù)。(3)和(2)的濃度分別為50和25μM，而HSA的濃度從左至右為0、150、300、450、600nM。在繪制比例強(qiáng)度下的I(3)/I(2)的信號(hào)強(qiáng)度比從左至右為0.94、0.69、0.53、0.36和0.25。
圖8.隨結(jié)合的對(duì)照分子([EL]/[LToT])(Y軸)變化的圖7的兩個(gè)19F信號(hào)的信號(hào)強(qiáng)度比(X軸)的曲線圖。右面的最后一個(gè)點(diǎn)對(duì)應(yīng)于不存在蛋白質(zhì)時(shí)的值。如前所示，兩個(gè)比例([EL]/[LTOT])是使用對(duì)于(3)的41±3.3μM的ITC-派生的KD值的約束進(jìn)行計(jì)算的。圓圈所表示的值是使用44.3μM的KD值計(jì)算的，方塊所表示的值是使用37.7μM的KD值表示的。曲線表示這些試驗(yàn)點(diǎn)的最佳擬合。
圖9.使用對(duì)照分子(2)進(jìn)行的19F-NMR篩選(上部)和使用檢測(cè)分子(3)進(jìn)行的19F-NMR篩選(底部)。該波譜是在160ms的總的自旋回波周期以及180個(gè)40ms的脈沖(2τ)之間的間隔條件下采集的。對(duì)于上面的圖譜總共掃描96次，重復(fù)時(shí)間3.5s，譜寬25ppm。在傅里葉變換之前該數(shù)據(jù)被乘以一個(gè)1Hz的指數(shù)函數(shù)。(3)和(2)的濃度分別為50和25μM。左邊的譜圖是在不存在蛋白質(zhì)的情況下記錄的，而全部其他的譜圖是在600nM HSA的存在下記錄的。左起第2圖是在不存在化學(xué)混合物的條件下記錄的，左起第3圖是在50μM的5-CH3D，L色氨酸和蔗糖的存在下記錄的，右圖是在50μM的5-CH3D，L色氨酸和蔗糖和25μM的(4)的存在下記錄的。
圖10.19F-NMR篩選的探測(cè)范圍使用對(duì)照分子(2)進(jìn)行的19F-NMR試驗(yàn)(上部)和使用間諜分子(3)進(jìn)行的試驗(yàn)。該波譜是在320ms的總的自旋回波周期(上部)以及1.2s的總的自旋回波周期在180個(gè)40ms的脈沖(2τ)之間的間隔條件下采集的。共進(jìn)行了64次(上部圖譜)和128次(下部圖譜)掃描，重復(fù)時(shí)間3.5s，譜寬25ppm。在傅里葉變換之前該數(shù)據(jù)被乘以一個(gè)1Hz的指數(shù)函數(shù)。(3)和(2)的濃度分別為50和25μM。左邊的譜圖是在不存在蛋白質(zhì)的情況下記錄的，而全部其他的譜圖是在僅有150nM HSA的存在下記錄的。左起第二個(gè)圖譜是在不存在化學(xué)混合物的條件下記錄的、右圖是在包含25μM的(4)的混合物的存在下記錄的。
圖11.在非氘化緩沖劑和洗滌劑的存在下進(jìn)行的19F-NMR篩選。上圖是在50μM的間諜分子(3)和25μM的對(duì)照分子(2)的存在下，溶于100mM HEPES和1甘油的600nM的HSA溶液的質(zhì)子波譜。在用水屏蔽后，唯一可見(jiàn)的信號(hào)是緩沖劑和甘油的信號(hào)。以2.7s的重復(fù)時(shí)間記錄總共128次掃描。下部左起第1和第3圖譜是在不存在混合物的溶液中記錄的19F波譜，而左起第2和第4譜圖是在包含25μM(4)的混合物的存在下的相同溶液中記錄的。該波譜是在160ms的總的自旋回波周期以及180個(gè)40ms的脈沖(2τ)的間隔條件下采集的?？偣灿涗?4次(左圖)和128次(掃描)，重復(fù)時(shí)間為3.5s，譜寬25ppm。在傅里葉變換之前該數(shù)據(jù)被乘以一個(gè)1Hz的指數(shù)函數(shù)。
圖12.化合物1-4的結(jié)構(gòu)。
發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明涉及19F-NMR，特別是19F-NMR競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)的用途。即，本發(fā)明涉及使用19F試驗(yàn)的基于配體的篩選(優(yōu)選，競(jìng)爭(zhēng)篩選)。在這些試驗(yàn)中氟-19檢測(cè)相對(duì)于質(zhì)子檢測(cè)具有許多優(yōu)點(diǎn)。
在這些試驗(yàn)中氟能作為一個(gè)優(yōu)選的核是因?yàn)楫?dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，其顯著的化學(xué)位移各向異性(CSA)有助于配體信號(hào)的19F自旋-自旋弛豫。也就是說(shuō)，CSA對(duì)19F自旋-自旋弛豫貢獻(xiàn)使得氟信號(hào)對(duì)于與標(biāo)靶的配合形成的效果尤其敏感?？梢允褂冒陀H和性至中等親和性的配體作為參考分子用于新配體的檢測(cè)和表征。此外，由于大多數(shù)化合物中不含氟，因此氟的檢測(cè)顯著地減少或甚至消除了譜線的重疊，而這種譜線的重疊常在質(zhì)子(1H)NMR中出現(xiàn)。像質(zhì)子NMR那樣，19F-NMR也是高度靈敏的并能夠快速采集數(shù)據(jù)，從而使得能夠高通量地篩選巨大的化合物庫(kù)。氟常被用于藥物涉及中以提高生物活性化合物的藥物(代謝)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。由于大約12％的包含有效化學(xué)目錄篩選化合物(Available Chemical Directory Screening Compounds(ACD-SC))的分子都包含一個(gè)氟原子，一般可以不借助于化學(xué)合成就能獲得用于競(jìng)爭(zhēng)篩選的參考化合物。實(shí)際上，發(fā)現(xiàn)分別在大約150,000和40,000個(gè)分子中，分別含有氟代苯和三氟甲基苯基殘基。
競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)包括在競(jìng)爭(zhēng)分子的存在下置換一種參考化合物。優(yōu)選，該參考化合物在微摩爾范圍內(nèi)的結(jié)合親和力下與靶分子結(jié)合。盡管也可使用本發(fā)明的方法評(píng)價(jià)以弱于(即，超過(guò))1微摩爾的親和力結(jié)合的化合物，但優(yōu)選測(cè)試化合物以強(qiáng)于(即，小于)1微摩爾(例如，該納摩爾范圍內(nèi))的結(jié)合親和力與靶分子結(jié)合。
盡管此處所述的方法特別用于識(shí)別與靶分子相對(duì)強(qiáng)的結(jié)合劑的配體，該方法也可被用于識(shí)別較寬范圍內(nèi)的結(jié)合親和力的配體。相對(duì)強(qiáng)的結(jié)合劑通常被定義為解離結(jié)合常數(shù)KD小于大約1微摩爾，優(yōu)選小于大約500nM，更優(yōu)選小于大約100nM的那些。
競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)不局限于篩選高度可溶于緩沖水溶液的化合物庫(kù)。一般地，僅有參考化合物是可溶于水的，并且仍可通過(guò)它們對(duì)參考化合物的信號(hào)的間接作用檢測(cè)有限溶解度的化合物。為了避免對(duì)照分子與受體以及與用于篩選的混合物的分子的非特異性的相互作用所引起的干擾，對(duì)照分子(即，從起角色來(lái)看，被稱為間諜分子)通常是水溶性的。使用對(duì)照分子的滴定NMR試驗(yàn)通常是首先在不同的配體濃度以及固定的蛋白質(zhì)濃度、或者不同的蛋白質(zhì)濃度以及固定的配體濃度下進(jìn)行的(C.Dalvit等，J.Am.Chem.Soc.，124，7702-7709(2002))。這些試驗(yàn)被用于篩選體系條件的優(yōu)化以及用于從單點(diǎn)測(cè)量中所識(shí)別出來(lái)的NMR采樣的結(jié)合常數(shù)。由于強(qiáng)配體對(duì)間諜分子具有巨大的影響，因此可以被容易地識(shí)別出來(lái)。然而，目前的1H-NMR競(jìng)爭(zhēng)篩選法的代表性局限在于參考化合物與測(cè)試化合物之間的譜線重疊，特別是在篩選巨大的化學(xué)混合物時(shí)。通過(guò)利用其他的核(例如，19F)的NMR探測(cè)顯著地減少了這些問(wèn)題。
本發(fā)明提供了使用與靶分子相互作用的配體的各種方法。
在某些具體實(shí)施方案中，該方法包括篩選化合物以識(shí)別靶分子的配體。該方法包括采集至少一種測(cè)試化合物的第一1D19F核磁共振波譜；將該至少一種測(cè)試化合物暴露于靶分子下；采集至少一種已經(jīng)暴露于靶分子的測(cè)試化合物的第二1D19F核磁共振波譜；比較第一和第二波譜以測(cè)定一個(gè)或多個(gè)共振的變化，并識(shí)別至少一種與靶分子相互作用的測(cè)試化合物。
在某些具體實(shí)施方案中，使用如下步驟提供與靶分子相互作用的19F-標(biāo)記參考化合物；在靶分子的存在下采集該19F-標(biāo)記參考化合物的1D19F核磁共振波譜；提供至少一個(gè)測(cè)試樣品(優(yōu)選多個(gè)測(cè)試樣品)，各測(cè)試樣品包含至少一種測(cè)試化合物；在各測(cè)試樣品和靶分子的存在下采集該19F-標(biāo)記參考化合物的1D19F核磁共振波譜；比較在靶分子的存在下該19F-標(biāo)記參考化合物的波譜與在各測(cè)試樣品和靶分子的存在下該19F-標(biāo)記參考化合物的波譜，以測(cè)定一個(gè)或多個(gè)該19F-標(biāo)記參考化合物共振中的變化；并識(shí)別其中至少一種與靶分子相互作用的測(cè)試化合物，其中測(cè)試化合物置換該19F-標(biāo)記參考化合物(一般地，這時(shí)因?yàn)闇y(cè)試化合物具有至少與參考化合物一樣緊密的結(jié)合親和力的結(jié)果)。
一般地，一個(gè)或多個(gè)該19F-標(biāo)記參考化合物共振的變化包括至少一個(gè)參考共振的信號(hào)強(qiáng)度的增加。優(yōu)選，一個(gè)或多個(gè)19F標(biāo)記參考化合物共振的變化包括至少一個(gè)參考共振的銳化。
如果需要，在采集19F波譜之前，可以施加自旋回波型過(guò)濾器，如可以如實(shí)施例部分所述測(cè)定此處所述的任何方法最佳試驗(yàn)條件。具體地說(shuō)，這通常包括在用于比較步驟的在靶分子的存在下采集該19F-標(biāo)記參考化合物的1D19F核磁共振波譜之前進(jìn)行如下步驟在不同濃度的靶分子或不同濃度的19F-標(biāo)記參考化合物的存在下，采集該19F-標(biāo)記參考化合物的1D19F核磁共振波譜。所采集的信息用于測(cè)定識(shí)別至少一種與靶分子相互作用的測(cè)試化合物的最佳試驗(yàn)條件。
當(dāng)在各測(cè)試樣品和靶分子的存在下采集該19F-標(biāo)記參考化合物1D19F核磁共振波譜時(shí)，可以使用各種脈沖序列。為有效比較波譜，需要具有相同的試驗(yàn)條件；然而，只要在篩選之前已經(jīng)產(chǎn)生了滴定試驗(yàn)的圖形，靶化合物和19F-標(biāo)記對(duì)照分子的濃度就可以改變。通常，溫度和緩沖條件是相同的，因?yàn)檫@些試驗(yàn)條件的改變可以影響參考化合物的結(jié)合常數(shù)。
在上述用于兩種或多種測(cè)試化合物的混合物的一般化方法中，識(shí)別至少一種測(cè)試化合物可以優(yōu)選包括在各靶分子的存在下分別記錄該19F-標(biāo)記參考化合物的1D19F核磁共振波譜。隨后比較在靶分子的存在下19F-標(biāo)記參考化合物的波譜與在各測(cè)試化合物和靶分子的存在下19F-標(biāo)記參考化合物的波譜，以測(cè)定所選擇的19F-標(biāo)記參考化合物共振的變化。這些試驗(yàn)的脈沖序列通常是相同的。這種通常被本領(lǐng)域技術(shù)人員稱為去褶合試驗(yàn)。
若需要，可以使用NMR技術(shù)測(cè)定測(cè)試化合物和/或參考化合物的解離常數(shù)(即，結(jié)合親和力)，盡管也可使用其他的已知的技術(shù)(例如，等溫滴定量熱法)。優(yōu)選使用等溫滴定量熱法或熒光光譜法測(cè)定參考化合物的結(jié)合親和力，其具體細(xì)節(jié)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所屬性的并且如實(shí)施例部分所述。
例如，在一種NMR方法中，除了上述一般化方法的步驟外，可以采集在不同濃度的19F-標(biāo)記參考化合物條件下在靶分子的存在下19F-標(biāo)記參考化合物的1D19F的核磁共振波譜。做為選擇或另外可以采集在不同濃度的靶分子的存在下19F-標(biāo)記參考化合物的1D19F核磁共振波譜。如實(shí)施例所述，該信息可被用于測(cè)定測(cè)試化合物的解離常數(shù)。
可以使用各種技術(shù)以提高本發(fā)明方法的精度。一般地，可以使用內(nèi)標(biāo)，該內(nèi)標(biāo)可以是一個(gè)無(wú)相互作用的化合物。
作為使用無(wú)相互作用的分子的一個(gè)替代方案是使用ERETIC方法(S.Akoka等，Anal.Chem.，71，2554-2557(1999)；和V.Silvestre等，S.Anal.Chem.，73，1862-1868(2001)。該技術(shù)依靠電子產(chǎn)生一個(gè)規(guī)定頻率、線寬和振幅的信號(hào)。使用源于樣品的FID采集一個(gè)假FID。調(diào)整該仿真信號(hào)的振幅，以形成一個(gè)與不存在蛋白質(zhì)時(shí)所記錄的參考化合物的信號(hào)相當(dāng)?shù)膹?qiáng)度。該幅值然后被用于滴定和NMR篩選試驗(yàn)并測(cè)量真實(shí)和仿真信號(hào)的信號(hào)強(qiáng)度比。加入一個(gè)ERETIC信號(hào)類似于給正?；男盘?hào)增加一個(gè)偽信號(hào)。
對(duì)于本發(fā)明的某些具體實(shí)施方案，參考化合物是和具有規(guī)定線寬、振幅和頻率的ERETIC信號(hào)一起提供的。對(duì)于這些方法，在靶分子的存在下采集19F-標(biāo)記參考化合物的1D19F核磁共振波譜包括在靶分子的存在下采集帶有ERETIC信號(hào)的19F-標(biāo)記參考化合物的波譜；以及在各測(cè)試樣品和靶分子的存在下采集19F-標(biāo)記參考化合物的1D19F核磁共振波譜包括在各測(cè)試樣品和靶分子的存在下采集具有ERETIC信號(hào)的19F-標(biāo)記參考化合物的波譜。
對(duì)于本發(fā)明的某些具體實(shí)施方案，19F-標(biāo)記參考化合物是與19F-標(biāo)記無(wú)相互作用的化合物一起提供的。對(duì)于這些方法，在靶分子的存在下采集19F-標(biāo)記參考化合物的1D19F核磁共振波譜包括在靶分子的存在下采集19F-標(biāo)記參考化合物和19F-標(biāo)記無(wú)相互作用的化合物的波譜；以及在各測(cè)試樣品和靶分子的存在下采集19F-標(biāo)記參考化合物的1D19F核磁共振波譜包括在各測(cè)試樣品和靶分子的存在下采集19F-標(biāo)記參考化合物和19F-標(biāo)記無(wú)相互作用的化合物的波譜。由于這種無(wú)相互作用的化合物在測(cè)試濃度下不與靶分子結(jié)合，它們被用作對(duì)照物。
結(jié)合本發(fā)明的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)，可以使用WaterLOGSY方法以及本領(lǐng)域所公知的其他方法例如光譜或生物化學(xué)使用，以識(shí)別參考化合物。優(yōu)選通過(guò)下列步驟識(shí)別參考化合物在不存在靶分子的條件下采集一個(gè)潛在參考化合物的WaterLOGSY核磁共振波譜；在靶分子的存在下采集潛在參考化合物的WaterLOGSY核磁共振波譜；以及比較WaterLOGSY波譜以識(shí)別是否為與靶分子相互作用的潛在參考化合物。
該WaterLOGSY方法(亦被稱為經(jīng)由梯度波譜Y觀測(cè)的水-配體)(Water-Ligand Observed via Gradient Spectroscopy Y)是以從大量水的質(zhì)子向與靶分子(例如，蛋白質(zhì))相互作用的化合物的氫核的磁化傳遞為基礎(chǔ)的。使用WaterLOGSY技術(shù)，通過(guò)它們的水-配體核歐沃豪斯效應(yīng)(NOE)的反信號(hào)將結(jié)合化合物與非結(jié)合劑區(qū)分開(kāi)來(lái)。該WaterLOGSY方法在下列文獻(xiàn)中有更具體的描述國(guó)際專利申請(qǐng)WO01/23330(2001年4月5日出版)、C.Dalvit等，J.Biomol.NMR，18，65-68(2000)、以及申請(qǐng)人于2002年6月5日提交的共同未決美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)No.60/386,896(代理編號(hào)No.01168.PRO1)。
可被用于本發(fā)明的方法的靶分子包括各種分子，特別是大分子，例如多肽(優(yōu)選，蛋白質(zhì))、多核苷酸、有機(jī)聚合物等等。這些化合物可以在活細(xì)胞或溶菌產(chǎn)物中。
在此處所使用的“多核苷酸”是指任意長(zhǎng)度的聚合形式的核苷酸，或者核糖核苷酸或脫氧核苷酸(deoxynucleotide)，并且包括雙鏈或單鏈DNA以及RNA。多核苷酸可以包括編碼和非編碼區(qū)，并且可以直接由天然來(lái)源(例如，微生物)獲取，或者可以借助于重組體、酶或化學(xué)技術(shù)制備。多核苷酸的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可以是線性的或者環(huán)形的。多核苷酸可以是例如媒介物，例如表達(dá)或克隆媒介物，或者是一個(gè)片段。
此處所使用的“多肽”是指氨基酸的聚合物并且不是指具有規(guī)定長(zhǎng)度的氨基酸的聚合物。因此，例如，術(shù)語(yǔ)肽、低聚肽、蛋白質(zhì)和酶被包括在多肽的定義中。該術(shù)語(yǔ)還包括多肽的后表達(dá)修飾，例如糖基化、乙?；?、磷酸化等等。
參考化合物是一個(gè)與選定靶分子以非常淺的結(jié)合親和力相互作用的化合物。相對(duì)弱的相互作用參考化合物一般被定義為解離結(jié)合常數(shù)KD為至少10微摩爾的化合物。
可用來(lái)評(píng)價(jià)的測(cè)試化合物可以是任何重量的化合物，其與標(biāo)靶潛在地具有各種結(jié)合親和力。值得注目的是，本發(fā)明的方法具有能夠檢測(cè)為相對(duì)強(qiáng)的結(jié)合劑的化合物。相對(duì)強(qiáng)結(jié)合劑一般被定義為解離結(jié)合常數(shù)KD為小于大約1微摩爾的化合物。以使用本發(fā)明的方法篩選的化合物包括，例如，植物提取物、真菌提取物、其他天然產(chǎn)品和小有機(jī)分子庫(kù)。
本發(fā)明可以從具有大范圍的化合物庫(kù)中篩選配體(該方法特別適用于具有極低溶解性的化合物)。值得注目地和有利地，對(duì)于某些具體實(shí)施方案，本發(fā)明優(yōu)選包括在相對(duì)低的標(biāo)靶(即，靶分子)濃度下進(jìn)行結(jié)合試驗(yàn)。因此，本發(fā)明的優(yōu)選的具體實(shí)施方案允許檢測(cè)僅能邊緣溶解的化合物。一般地這些化合物在水中的溶解度不大于10μM。
盡管如果需要可使用更高的濃度，優(yōu)選各樣品中各測(cè)試化合物的濃度不大于大約100μM。然而，本發(fā)明的方法的顯著優(yōu)點(diǎn)在于可以使用極低的配體濃度(例如，不大于大約10μM)。
所使用的提取物濃度以及測(cè)試化合物對(duì)靶分子的比例可以隨靶分子的尺寸、有效靶分子的量、所需要的結(jié)合親和力檢出限和所需要的數(shù)據(jù)采集的速度的改變而改變。優(yōu)選靶分子的濃度約為100nM至大約10μM。
用于測(cè)試混合物的溶劑可以是各種溶劑，只要這些溶劑不是標(biāo)靶降解(例如使變性)。一般地使用水和DMSO。可以使用質(zhì)子化的溶劑和洗滌劑。
對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，已知，在需要時(shí)可以向該測(cè)試化合物中加入其他的組分(例如，緩沖劑)以獲得某些優(yōu)點(diǎn)。
還可發(fā)現(xiàn)本發(fā)明可用于化學(xué)混合物(即兩種或多種測(cè)試化合物的混合物)的快速篩選。
快速篩選技術(shù)一般地包括提供多個(gè)測(cè)試樣品，各測(cè)試樣品包含兩種或多種測(cè)試化合物的混合物。
一旦配體(優(yōu)選高親和性配體)已被識(shí)別和確認(rèn)，其結(jié)構(gòu)就被用于具有類似結(jié)構(gòu)的用于測(cè)試活性或親和性的有效化合物，或用于控制用來(lái)測(cè)試活性或親和性的結(jié)構(gòu)相關(guān)化合物。然后從市場(chǎng)購(gòu)得這些化合物或者合成這些化合物。最常見(jiàn)的情形是，然后使用酶試驗(yàn)評(píng)價(jià)它們的活性。在分子標(biāo)靶不是酶或者不能進(jìn)行酶試驗(yàn)時(shí)，可以使用類似于上面的描述的使用NMR技術(shù)、或其他的物理方法例如等溫變性量熱法測(cè)試其親和性。在該步驟中所識(shí)別的與分子標(biāo)靶的親和性為大約1.0×10-6M或更大的化合物通常被當(dāng)作先導(dǎo)化學(xué)模板。
在有些情況下，使用更復(fù)雜的NMR試驗(yàn)或其他的物理方法例如量熱法或X-射線晶體衍射法研究配體結(jié)合。
用于優(yōu)化1H和19F檢測(cè)的冷凍探針技術(shù)可以進(jìn)一步提高這些篩選方法的處理能力。在這種情況下，限制因素將是樣品變化所需的時(shí)間、平衡樣品溫度和樣品。
實(shí)施例通過(guò)下面的實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的目的及優(yōu)點(diǎn)，但是這些具體實(shí)施例中所述的具體材料及其使用的量，以及其他的條件和具體情況，不應(yīng)被過(guò)度地解釋為對(duì)本發(fā)明的限制。
材料和方法對(duì)于本實(shí)施例(I)的第一組試驗(yàn)，絲氨酸/蘇氨酸p21活化激酶的激酶域(MW大約34000)被表達(dá)為一個(gè)大腸桿菌中的GST融合蛋白質(zhì)并在除去GST標(biāo)記后將其純化均勻。將NMR樣品溶于pH7.4的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，代碼P-3813，Lot 100K8211，Sigma公司生產(chǎn))。將D2O加入到溶液(8％最終濃度)中以進(jìn)行信號(hào)鎖定。在氘代DMSO的儲(chǔ)液中制備小分子并在253K溫度下保存。
對(duì)于實(shí)施例(II)的第二組試驗(yàn)，脂肪酸游離人血清白蛋白(A-3782)是從Sigma公司購(gòu)得并未經(jīng)進(jìn)一步純化而使用。在5μM EDTA的存在下，將NMR樣品溶于pH為7.4的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，代碼P-3813，Lot 100K8211，Sigma公司生產(chǎn))中。將D2O加入到溶液(8％最終濃度)中以進(jìn)行信號(hào)鎖定。在或者氘代DMSO或水的濃縮儲(chǔ)液中制備小分子并在253K溫度下存儲(chǔ)。
NMR對(duì)于實(shí)施例(I)的第一組試驗(yàn)，全部NMR波譜是在293K溫度下，使用配備有取樣管理系統(tǒng)(SMS)自動(dòng)進(jìn)樣器的Varian Inova 600MHz(對(duì)于19F為564MHz)核磁共振波譜儀記錄的。使用激動(dòng)造型序列(T.-L.Hwang，J.Magn.Reson.A，112，275-279(1995))在1H檢測(cè)試驗(yàn)中實(shí)現(xiàn)對(duì)水的抑制。該模式的兩個(gè)對(duì)水具有選擇性的180°二次脈沖和四脈沖場(chǎng)梯度地脈沖寬度分別為2.6和1毫秒(ms)。
對(duì)于實(shí)施例(II)的第二組試驗(yàn)，全部核磁共振波譜是在300K溫度下試驗(yàn)Bruker Avance 600核磁共振波譜儀在564MHz的19F拉莫爾頻率下操作所記錄的。所使用的雙線圈{19F}-{1H}探針中將內(nèi)層線圈調(diào)整到19F的頻率將外層線圈調(diào)整到1H的頻率。這些探針的氟背景不會(huì)對(duì)測(cè)量產(chǎn)生干擾。這些信號(hào)較寬并因此在使用自旋回波模式所記錄的參考分子和對(duì)照分子的波譜中并不明顯。在采樣期間，全部的波譜都是使用一個(gè)弱Waltz-16質(zhì)子去耦進(jìn)行記錄的。通常記錄4-8次空掃以平衡溫度。在采樣之前使用了不同長(zhǎng)度和2τ時(shí)間間隔的Carr-Purcell-Meibom-Gill模式，并且參照三氟乙酸對(duì)化學(xué)位移進(jìn)行校正。
熒光熒光測(cè)試是通過(guò)一個(gè)Jasco J-715分光偏振計(jì)使用垂直于該激發(fā)束的輔助光電倍增管來(lái)采集的。該激發(fā)波長(zhǎng)是310納米(頻帶寬度5納米)并使用一個(gè)385納米截止濾光片。使用與NMR試驗(yàn)中所使用的相同來(lái)源的脂肪酸游離HSA進(jìn)行親和性測(cè)試。在5μM EDTA的存在下在pH值為7.4的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，代碼P-3813，Lot 100K8211，Sigma公司生產(chǎn))中制備分析物和HSA溶液。在使用前通過(guò)一個(gè)0.2μM的濾波器過(guò)濾該緩沖液。通過(guò)將2.0mL的3μM的分析物溶液等分到一個(gè)通道長(zhǎng)度為1.0cm的小石英池中，并使用HSA(裝料濃度250μM)滴定該溶液。
ITC試驗(yàn)使用Microcal Inc.(Northampton，MA)制造的OMEGA滴定微量熱計(jì)進(jìn)行等溫滴定量熱試驗(yàn)。滴定微量熱計(jì)由容納在絕熱外殼中的樣品池和參比池組成。參比電池中裝滿PBS。在1.37mL的樣品池中放入23μM的溶于PBS+2％DMSO的HSA溶液。0.8mM的溶于相同緩沖劑的分析物被放在一個(gè)250μL的注射器中。在25℃溫度下，通過(guò)計(jì)算機(jī)控制的步進(jìn)電動(dòng)機(jī)向樣品池中注射三十次分析物(每次注射8μL，每次12秒)。注射器攪動(dòng)速度為400rpm。通過(guò)一個(gè)與Microcal毫微伏特放大器連接的熱電裝置測(cè)量各次注射吸收和釋放的熱。結(jié)合相互作用的滴定等溫線由每次注射的微分熱流組成。通過(guò)向PBS注入分析物的稀釋熱是微不足道的。結(jié)合等溫線與包括在該儀器中的使用迭代非線性最小平方算法的單一結(jié)合部位模型(T.Wiseman等，Anal.Biochem.，179，131-137(1989))一致。
實(shí)施例I結(jié)果和討論19F弛豫理論19F的縱向弛豫不是競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)的有用參數(shù)，因?yàn)樗狈ψR(shí)別與大分子相互作用的小分子所必需的直接τC相關(guān)性。然而，自旋-自旋弛豫速度R2卻是一個(gè)非常有效的參數(shù)，因?yàn)樗送ㄟ^(guò)如下方程描述的異核19F-1H偶極相互作用以及19F化學(xué)位移各向異性(CSA)相互作用在零頻率下計(jì)算的譜線密度(M.Goldman，Quantum Description ofHigh-Resolution NMR in Liquids，Clarendon Press，Oxford，(1988)) 215Δσ2B02γF2τc{23+12(1+ωF2τc2)}---(1)]]>Hi表示與氟原子空間上接近的參考化合物以及蛋白質(zhì)的全部質(zhì)子，Δσ為19F原子的CSA以及B0為磁場(chǎng)的強(qiáng)度，γH和γF分別為質(zhì)子和氟的旋磁比，ωH和ωF分別為質(zhì)子和氟的拉莫爾頻率，τc為相關(guān)時(shí)間，且rFHi為Hi質(zhì)子和氟原子之間的核間距。
由于19F的CSA非常大(多達(dá)數(shù)百ppm)(J.T.Gerig，Methods inEnzymol.，177，3-23(1989)；和J.T.Gerig，Prog.NMR Spectrosc.，26，293-370(1994))，它將顯著地增加結(jié)合配體部分自旋-自旋弛豫。CSA對(duì)弛豫的影響與磁場(chǎng)的平方成正比。因此，在更高磁場(chǎng)下的效果更為明顯。可以從圖1的模擬中理解這一點(diǎn)，其中由于游離于溶液的小分子的以及當(dāng)與不同大小的大分子結(jié)合時(shí)的19F線寬的差異是一個(gè)與拉莫爾頻率相關(guān)的曲線。對(duì)于有利于溶于中的小分子，模擬時(shí)使用Δσ為100ppm，τC為200ps。由圖1可知，由于CSA的強(qiáng)烈影響，現(xiàn)有的最強(qiáng)的磁場(chǎng)對(duì)于強(qiáng)結(jié)合配體和被19F選擇性標(biāo)記的蛋白質(zhì)的試驗(yàn)并不是最佳的。相反，強(qiáng)磁場(chǎng)特別適于使用弱親和性參考分子進(jìn)行的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合HTS試驗(yàn)。游離和結(jié)合狀態(tài)的參考分子之間的19F共振線寬的差異隨磁場(chǎng)的強(qiáng)度而增加。此外，在游離與結(jié)合狀態(tài)下的氟配體共振的化學(xué)位移差異(δ游離-δ結(jié)合)也變得更大。這些導(dǎo)致對(duì)交換術(shù)語(yǔ)R2，ex對(duì)參考化合物的線寬的產(chǎn)生顯著的影響(J.W.Peng，J.Magn.Reson.，153，32-47(2001))R2,ex=[EL][LTOT](1-[EL][LTOT])24π2(δfree-δbound)2K-1---(2)]]>[EL]/[LTOT]為結(jié)合配體的份數(shù)，1/K-1配體結(jié)合到蛋白質(zhì)上的殘留時(shí)間。
參考化合物以及篩選參數(shù)的選擇NMR篩選試驗(yàn)一般是相對(duì)于蛋白質(zhì)在10-100倍過(guò)量的配體(僅產(chǎn)生少部分的結(jié)合配體)的條件下進(jìn)行的，前述部分中的術(shù)語(yǔ)(Δσ，B0，δ游離-δ結(jié)合，1/K-1等)在參考化合物的選擇中非常重要。由于蛋白質(zhì)的影響所引起的移動(dòng)，當(dāng)與游離配體的化學(xué)位移相比時(shí)，與蛋白質(zhì)結(jié)合的參考化合物的19F信號(hào)的化學(xué)位移可以是非常不同的(J.T.Gerig，Prog.NMR Spectrosc.，26，293-370(1994)；和J.Feeney等，J.Am.Chem.Soc.，118，8700-8706(1996))。因此甚至具有μM范圍的中等結(jié)合親和力的分子也可以顯示出兩個(gè)清楚的共振，一個(gè)為結(jié)合形式，另一個(gè)為游離形式。這是由在與游離化合物和結(jié)合化合物之間的交換速度相比時(shí)，兩個(gè)共振化學(xué)位移的差異更大這一實(shí)事所導(dǎo)致的。在HTS中，僅監(jiān)測(cè)在游離配體頻率下的信號(hào)，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的濃度非常低(數(shù)百nM至1-5μM))，以允許觀測(cè)結(jié)合形式的很寬的共振。
為了評(píng)價(jià)任何用于競(jìng)爭(zhēng)篩選的給定氟化配體的適用性以及為了測(cè)定最佳試驗(yàn)參數(shù)，試驗(yàn)分子的滴定試驗(yàn)是通過(guò)采集1D19F R2過(guò)濾試驗(yàn)或簡(jiǎn)單的1D試驗(yàn)通過(guò)改變結(jié)合配體的份數(shù)(C.Dalvit等，J.Am.Chem.Soc.，124，7702-7709(2002))來(lái)進(jìn)行的。為了獲得更好的試驗(yàn)靈敏度，在采集周期期間使用1H去耦。測(cè)試測(cè)試化合物以及試驗(yàn)條件，以確定它們的靈敏度以及用于確定一個(gè)在與標(biāo)靶結(jié)合時(shí)顯示出顯著的微擾的單一氟共振的存在。
一旦識(shí)別了適宜的配體以及確定了試驗(yàn)條件，然后就可以通過(guò)如圖2所示監(jiān)測(cè)參考分子的19F信號(hào)的自旋-自旋弛豫的變化(或者經(jīng)由使用CPMG或自旋回波模式進(jìn)行的R2過(guò)濾試驗(yàn)或簡(jiǎn)單地通過(guò)分析線寬)進(jìn)行篩選。
在這種情況下，在1.5μM的PAK4的存在下使用50μM的中等親和性配體化合物A(KD＝10μM)作為參考化合物。在包含高親和配體的下化合物混合物的存在下，在自旋回波之后可以看到化合物的信號(hào)顯著增強(qiáng)(比較圖2a與2b)。這種信號(hào)的增加顯示由于與包含在混合物中的分子的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合使得參考分子化合物A的結(jié)合減小。簡(jiǎn)單去褶合試驗(yàn)(2c和2d)允許識(shí)別作為活性分子的化合物B。
當(dāng)使用自旋回波類型序列時(shí)，建議在硬180°脈沖之間使用足夠長(zhǎng)的延遲以便充分利用方程(2)的交換項(xiàng)。之所以能這樣做是因?yàn)椴淮嬖谕藰?biāo)量耦合并且異核標(biāo)量耦合下的逸出被重聚焦了。然而，延遲不應(yīng)過(guò)長(zhǎng)以避免靜磁場(chǎng)的非均勻性所產(chǎn)生的弛豫。
除了氟化參考化合物，包含一個(gè)不與受體相互作用的氟化小分子(對(duì)比化合物)是有利的。圖3顯示在存在與不存在蛋白質(zhì)的條件下所記錄的間諜分子和無(wú)相互作用分子的19F波譜中的這一原理。當(dāng)間諜分子的信號(hào)發(fā)生光譜變化時(shí)，小分子的信號(hào)不會(huì)發(fā)生變化。從圖3的示差光譜可以看出這一點(diǎn)。該無(wú)相互作用的分子的信號(hào)為一個(gè)內(nèi)標(biāo)，該內(nèi)標(biāo)可用于使用單一使用校正間諜分子的信號(hào)變化。應(yīng)當(dāng)指出的是，即使小分子與受體具有弱相互作用(mM范圍)，這也不會(huì)對(duì)測(cè)量產(chǎn)生干擾。當(dāng)與弱結(jié)合常數(shù)相比小分子的濃度(10-30μM)的數(shù)量級(jí)更小，因此與受體結(jié)合的化合物的份數(shù)是可以忽略不計(jì)的。為了證明這一點(diǎn)，選擇三氟乙酸(TFA)作為與受體無(wú)相互作用的小分子。應(yīng)當(dāng)指出的是在篩選中的一些化合物中可能含有痕量的TFA。因此，盡管它對(duì)于這里所提出的概念的證明是有效的，應(yīng)當(dāng)選擇其他的參考化合物以用于更普遍的應(yīng)用。同時(shí)使用間諜分子和參考化合物通過(guò)HTS和去褶合以識(shí)別先導(dǎo)化合物的應(yīng)用如圖4所示。該六化合物混合物的確不影響間諜分子共振的線寬(圖4c)并且參考化合物A的信號(hào)明顯不如TFA的信號(hào)強(qiáng)。然而，在七化合物混合物中存在一個(gè)強(qiáng)競(jìng)爭(zhēng)分子(化合物B)將導(dǎo)致間諜分子共振的銳化，并且這兩個(gè)信號(hào)具有相當(dāng)?shù)膹?qiáng)度。
如C.Dalvit等，J.Am.Chem.Soc.，124，7702-7709(2002)所述，可以從與結(jié)合配體份數(shù)成曲線關(guān)系的19F共振的信號(hào)強(qiáng)度比例以及測(cè)量在競(jìng)爭(zhēng)分子的存在下參考分子的信號(hào)強(qiáng)度的變化得到識(shí)別NMR采樣的結(jié)合常數(shù)。在該具體情形中，NMR-采樣化合物B的結(jié)合常數(shù)為200+/-100nM。當(dāng)將19F試驗(yàn)用于HTS時(shí)，同樣重要的是記錄1H波譜以測(cè)定包含該化學(xué)混合物的化合物的濃度，并由此得出一個(gè)NMR采樣的可靠的結(jié)合常數(shù)。
在采集期開(kāi)始之前，還可以在19F試驗(yàn)中施加一個(gè)1H至19F NOE步驟，以避免從質(zhì)子到氟原子自旋地磁化轉(zhuǎn)移?？梢酝ㄟ^(guò)不同的方式進(jìn)行該步驟。對(duì)于不與大受體相互作用的小分子，能觀察到19F信號(hào)的增強(qiáng)。對(duì)于與受體弱相互作用的分子，觀察到非常到非常弱的信號(hào)增加或者信號(hào)減弱，這取決于結(jié)合受體的份數(shù)、蛋白質(zhì)相關(guān)時(shí)間，以及，取決于NOE步驟是如何實(shí)施的。這些異核NOE的差異可被有效地用于競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合HTS試驗(yàn)。當(dāng)在競(jìng)爭(zhēng)分子的存在下，間諜分子被從受體上置換下來(lái)后，由于異核NOE使得線寬更小以及信號(hào)增強(qiáng)，其19F信號(hào)也變得更強(qiáng)。
實(shí)施例II結(jié)果與討論原理19F-NMR信號(hào)的靈敏度與(γF/γH)3成正比，其中γF和γH分別是氟和質(zhì)子的旋磁比。由于19F是唯一的穩(wěn)定的氟同位素并具有1/2自旋，其靈敏度很高，是質(zhì)子的0.83倍。在質(zhì)子去耦的條件下，氟信號(hào)表現(xiàn)為單共振峰，因此信號(hào)很強(qiáng)烈。
19F橫向弛豫是用于通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)進(jìn)行的監(jiān)視的非常有用的參數(shù)。位于一點(diǎn)距離上的氟和質(zhì)子之間的偶極相互作用(0.88倍)與相同距離的兩個(gè)單獨(dú)質(zhì)子之間的偶極相互作用在大小上非常接近。因此對(duì)于參考分子的氟原子和質(zhì)子的偶極作用是非常接近的。氟信號(hào)的橫向弛豫速度R2具有額外的影響，這種液相影響源于19F原子的大量的CSA相互作用并且可通過(guò)下式表示(D.Canet，Nuclear MagneticResonance Concepts and Methods，John Wiley & Sons，Chichester，(1996))R2CSA=215Δσ2(1+ηCSA23)B02γF2τc{23+12(1+ωF2τc2)}---(3)]]>其中Δσ為19F原子的CSA并可通過(guò)Δσ＝σzz-(σxx+σyy)/2得出。不同的σ是該組分的該化學(xué)位移磁張量。不對(duì)稱參數(shù)ηCSA＝(3/2)(σxx-σyy)/Δσ并且對(duì)于軸對(duì)稱的化學(xué)位移磁張量ηCSA＝0。B0為磁場(chǎng)強(qiáng)度，γF是氟旋磁比，ωF為氟拉莫爾頻率，τc為相關(guān)時(shí)間。
如上述第一組試驗(yàn)(I)的討論，所進(jìn)行的模擬假定一個(gè)軸對(duì)稱的CSA磁張量并且對(duì)于游離與結(jié)合態(tài)的配體假定其具有相同的CSA，如圖1所示，僅由于CSA作用單獨(dú)導(dǎo)致的游離合結(jié)合狀態(tài)之間的參考分子的19F信號(hào)的線寬的差異可以非常大(C.Dalvit等，Comb.Chem.HTS，5，605-611(2002)以及上述實(shí)施例(I))。這些差異隨受體的尺寸以及磁場(chǎng)強(qiáng)度的平方而增加。高磁場(chǎng)可以導(dǎo)致高分子(例如，19F選擇性標(biāo)記的蛋白質(zhì))或者強(qiáng)蛋白質(zhì)結(jié)合受體的氟信號(hào)具有非常寬的線寬(＞200Hz)。(W.E.Hull等，J.Mol.Biol.，98，121-153(1975)；J.T.Gerig，Methods in Enzymol.，177，3-23(1989)；和J.T.Gerig，Prog.NMR Spectrosc.，26，293-370(1994))。這樣的線寬使得高分子或高親和性配體的氟共振的直接檢測(cè)不能被用于篩選。相反，這樣的磁場(chǎng)強(qiáng)度非常適合于使用弱親和性參考分子的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)，其中可以控制和檢測(cè)的公開(kāi)由觀測(cè)的線寬得到的游離和結(jié)合狀態(tài)之間的平均值(C.Dalvit等，Comb.Chem.HTS，5，605-611(2002)和上述實(shí)施例(I))。
在采集期開(kāi)始前，脈沖序列一般采用Carr-Purcell Meibom Gill(CPMG)自旋回波模式(H.Y.Carr等，Phys.Rev.，94，630-638(1954)；和S.Meiboom等，Rev.Sci.Instrum.，29，688(1958))。在自旋回波模式末期，參考分子的信號(hào)強(qiáng)度I(n2τ)由如下方程得到(T.C.Farrar等，Pulse and Fourier Transform NMR，Introduction toTheory and Methods，Academic Press，New York，1971)I(n2τ)=I0e-γF2G2Dobs(n2τ)τ23e-n2τR2,obs---(4)]]>其中I0是首次90°脈沖之后的信號(hào)強(qiáng)度，2τ是180°脈沖的序列之間的時(shí)間間隔，G是靜態(tài)磁場(chǎng)的非均勻性，γF是氟的旋磁比，以及n是自旋回波模式的循環(huán)數(shù)。Dobs，所觀測(cè)到的弱親和性參考分子的遷移擴(kuò)散系數(shù)，并由如下方程得出Dobs=[EL][LTOT]Dbound+(1+[EL][LTOT])Dfree---(5)]]>其中，D結(jié)合與D游離分別是結(jié)合與游離態(tài)的參考分子的擴(kuò)散系數(shù)。[EL]/[LTOT]和(1-[EL]/[LTOT])分別是結(jié)合與游離配體的系數(shù)。
弱結(jié)合參考分子的橫向弛豫速度R2，obs由如下方程得出R2,obs=[EL][LTOT]R2,bound+(1-[EL][LTOT])R2,free+[EL][LTOT](1-[EL][LTOT])24π2(δfree-δbound)2K-1---(6)]]>其中R2，結(jié)合與R2，游離分別是游離與結(jié)合狀態(tài)的橫向弛豫時(shí)間。最后一項(xiàng)為交換項(xiàng)，其中δ結(jié)合與δ游離分別是游離與結(jié)合狀態(tài)的同位素化學(xué)位移，并且1/K-1是配體結(jié)合到蛋白質(zhì)上的殘留時(shí)間。僅當(dāng)該試驗(yàn)是使用長(zhǎng)為2τ(其中τ＞＞1/K-1)進(jìn)行時(shí)，方程(6)才是有效的。使用τ＜5/K-1進(jìn)行的試驗(yàn)使得交換項(xiàng)對(duì)于所觀測(cè)的橫向弛豫速度的影響降低(Z.Luz等，J.Chem.Phys.，39，366-370(1963)；和A.Allerhand等，H.S.J.Chem.Phys.，41，2115-2126(1964))。
因此，使用一個(gè)長(zhǎng)2τ期進(jìn)行篩選。之所以可以這樣做是因?yàn)楫惡?H-19F標(biāo)量耦合下的演化在該模式的末端被重聚焦了。然而，該2τ期不應(yīng)非常長(zhǎng)，以至于減少由參考分子的空間擴(kuò)散導(dǎo)致的信號(hào)衰減(即，方程(4)的第一指數(shù)項(xiàng))。
間諜分子以及對(duì)照分子的選擇表1給出了在三種不同商用化合物庫(kù)中含有氟原子的分子的頻率。該表中還包含在試驗(yàn)中所經(jīng)常試驗(yàn)的單氟代苯和三氟甲基苯這兩種子結(jié)構(gòu)的數(shù)目。大量包含氟原子的分子使得不需要依靠化學(xué)合成進(jìn)行間諜分子和對(duì)照分子的選擇。
表1中的一個(gè)有趣特征在于在MDDR庫(kù)中存在大量的含氟分子。如圖5所示，對(duì)該庫(kù)內(nèi)的按時(shí)間順序的調(diào)查顯示，在過(guò)去20年間，所開(kāi)發(fā)的包含至少一種氟原子的化合物的百分比增加了一倍?？梢杂^察到從1981-1985年間的10.9％穩(wěn)步增加到1996-2000年間的19.4％。氟原子已經(jīng)日益被用于先導(dǎo)化合物的優(yōu)化以改善其效力、物理化學(xué)性質(zhì)和對(duì)于酶作用的新陳代謝穩(wěn)定性的過(guò)程中。
在這兩種分子的選擇過(guò)程中應(yīng)特別注意其溶解性。氟原子的存在增加了化合物的親油性。不是非常容易溶于水溶液中的分子不適合用于篩選試驗(yàn)，因?yàn)樗鼈兛梢砸砸环N非專一的方式與受體結(jié)合。因此，對(duì)于潛在分子和對(duì)照分子的質(zhì)子和氟波譜以及質(zhì)子WaterLOGSY波譜實(shí)在不存在蛋白質(zhì)的條件下，一般在高于篩選過(guò)程所使用的濃度2至4倍(即，100至200μM)的濃度下測(cè)試的。僅有那些根據(jù)NMR波譜是可溶解的并且在該濃度下不集結(jié)的分子被認(rèn)為是用于篩選的參照和對(duì)照分子的潛在的化合物。
含有CF3基團(tuán)的化合物含有CF3基團(tuán)的參考化合物的優(yōu)點(diǎn)在于其具有較高的氟信號(hào)靈敏度。參考分子5-[1-甲基-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-5-基]-2-噻吩羧酸(1)和對(duì)照分子1-[5-(三氟甲基)-1，3，4-噻二唑-2-基]哌嗪(2)的典型的自旋回波19F波譜是在不同濃度的HAS的濃度下在采集期間試驗(yàn)質(zhì)子去耦所記錄的，如圖6所示。與NMR試驗(yàn)的結(jié)果一致的是，使用(2)進(jìn)行的ITC測(cè)試并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何與HAS結(jié)合的證據(jù)(將8μL、800μM的(2)注射到30μM HAS中僅觀測(cè)到擴(kuò)散熱)。NMR試驗(yàn)中所使用的兩種分子的濃度都僅為25μM。參考分子的低濃度避免了由于非特異性結(jié)合以及集聚所產(chǎn)生的問(wèn)題。這些分子的缺點(diǎn)在于即便在結(jié)合狀態(tài)下也可以觀測(cè)到氟原子圍繞著該基團(tuán)的C3軸的快速旋轉(zhuǎn)。這導(dǎo)致游離狀態(tài)和結(jié)合狀態(tài)的參考分子間的CF3信號(hào)的線寬的差異有限。
含有CF基團(tuán)的化合物含有CF基團(tuán)的化合物特別適合用于基于競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的篩選試驗(yàn)。19F-CSA可以非常大因此增加了方程(3)的參考分子的游離態(tài)與結(jié)合態(tài)的線寬的差異。例如芳族CF的CSA的范圍在單氟代苯的71ppm至六氟代苯的158ppm之間(H.Raber等，Chem.Phys.，26，123-130(1977))。此外，由于其“鄰位效應(yīng)”或氟原子直接參與了與蛋白質(zhì)的氫鍵，結(jié)合狀態(tài)的參考分子的19F-CSA可以增加。這兩個(gè)現(xiàn)象還將導(dǎo)致自由狀態(tài)和結(jié)合狀態(tài)的各向同性化學(xué)位移的巨大差別。對(duì)于弱親和性參考化合物，方程(6)的交換項(xiàng)可以在蛋白質(zhì)的存在下可以對(duì)參考化合物的線寬起到顯著的作用。氟信號(hào)通常與幾個(gè)質(zhì)子偶合而裂分，因此，為了改善其靈敏度，必需在采樣期間使用質(zhì)子去耦來(lái)記錄光譜。圖7顯示了使用質(zhì)子去耦的隨HSA濃度變化的參考分子2-羥基-3-氟苯甲酸(3)和對(duì)照分子(2)的代表性的自旋回波氟波譜。這些分子的一個(gè)缺點(diǎn)在于需要使用更高的濃度進(jìn)行該試驗(yàn)。圖7的波譜所使用的參考分子的濃度為50μM。
滴定和篩選試驗(yàn)在選定了參考分子和對(duì)照分子之后，進(jìn)行關(guān)于蛋白質(zhì)的滴定，其結(jié)果如圖6和圖7所示。兩個(gè)氟信號(hào)的強(qiáng)度比被繪制成關(guān)于蛋白質(zhì)結(jié)合參考分子的曲線，如圖8的實(shí)施例所述。使用通過(guò)其他技術(shù)(例如，ITC或熒光光譜學(xué))得到的解離結(jié)合常數(shù)計(jì)算結(jié)合化合物的份數(shù)，如C.Dalvit等，J.Am.Chem.Soc.，124，7702-7709(2002)；和C.Dalvit等，Comb.Chem.HTS，5，645-650(2002)所述。這些技術(shù)還提供了對(duì)照分子的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，該結(jié)合位點(diǎn)數(shù)是競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)中一個(gè)非常重要的參數(shù)。ITC測(cè)試提供了一個(gè)n值，該n值對(duì)于(1)而言接近4、對(duì)于(3)而言接近1。因此，盡管分子(1)可在對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的解析中受到一定限制的條件下被用于篩選試驗(yàn)，它不能被用于導(dǎo)出NMR采樣的結(jié)合參數(shù)。分子(3)代表了一種合適的參考分子，因?yàn)樗谶@些試驗(yàn)所使用的濃度下與HSA僅具有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)，一種阿司匹林類似物，其公認(rèn)的結(jié)合位點(diǎn)將是Sudlow位點(diǎn)I(位于子域IIA)(T.Peters，Jr.，All about Albumin Biochemistry，Genetics，andMedical Applications，Academic Press，San Diego，U.S.A.1996)所述。在圖8中，使用兩個(gè)通過(guò)實(shí)驗(yàn)誤差測(cè)定的KD極限值提取對(duì)于蛋白質(zhì)結(jié)合參考分子(3)的部分的兩個(gè)不同的值。在這種具體情形下，ITC所導(dǎo)出的(3)的KD值位41±3.3μM，因此這兩個(gè)KD的極限值分別為37.7和44.3。
應(yīng)當(dāng)指出的是還可以在僅存在參考分子的條件下進(jìn)行NMR試驗(yàn)(C.Dalvit等，Comb.Chem.HTS，5，605-611(2002)以及上述實(shí)施例(I))。然而，在這種情況下，所記錄的兩個(gè)試驗(yàn)必須是一個(gè)不帶CPMG序列(即2nτ＝0)以及另一個(gè)帶有長(zhǎng)為2nτ的CPMG序列。然后將從這兩個(gè)波譜中所得出的信號(hào)強(qiáng)度繪制成關(guān)于結(jié)合參考分子份數(shù)的曲線。
然后利用圖8來(lái)設(shè)定篩選所需的條件。圖9顯示了對(duì)照含有(3)作為參考分子的HSA進(jìn)行的篩選過(guò)程。對(duì)于篩選，所選擇的參考分子的總的自旋回波周期(2nτ)接近零。已知所存在的5-CH3的D，L色氨酸和蔗糖的混合物(左起第三個(gè)波譜)是非結(jié)合劑，不會(huì)改變間諜分子的波譜。相反，丙酮芐羥香豆素(warfarin)衍生物4-羥基-3-[1-(對(duì)碘苯基)-3-氧代丁基]香豆素(4)的存在(右邊的波譜)導(dǎo)致(3)的信號(hào)的再次出現(xiàn)。根據(jù)圖8的圖形，這是由于參考化合物從蛋白質(zhì)上被置換下來(lái)所導(dǎo)致的。用于計(jì)算NMR采樣的結(jié)合常數(shù)的置換程度如表2所示(C.Dalvit等，J.Am.Chem.Soc.，124，7702-7709(2002)；和C.Dalvit等，Comb.Chem.HTS，5，645-650(2002))。

全部濃度和結(jié)合常數(shù)的值都是以μM表示的。KD是由ITC所導(dǎo)出的(3)的結(jié)合常數(shù)，KIfluo是由熒光導(dǎo)出的(4)的結(jié)合常數(shù)。[I]，[LTOT]和[ETOT]分別是(4)，(3)和HSA的濃度KINMR是由NMR測(cè)試所導(dǎo)出的(4)的結(jié)合常數(shù)。
為了導(dǎo)出一個(gè)可靠的結(jié)合常數(shù)值，還必需測(cè)試其質(zhì)子波譜。這是通過(guò)簡(jiǎn)單比較參考分子信號(hào)的積分來(lái)計(jì)算NMR采樣的濃度所必需的，其中濃度可從NMR采樣的信號(hào)的積分得到。由NMR導(dǎo)出的KD值優(yōu)選與由完全滴定熒光測(cè)試所導(dǎo)出的值進(jìn)行比較。自從其首次被應(yīng)用以來(lái)(C.Dalvit等，J.Am.Chem.Soc.，124，7702-7709(2002)；和C.Dalvit等，Comb.Chem.HTS，5，645-650(2002))，就已經(jīng)使用這種方法計(jì)算了數(shù)百種化合物的結(jié)合常數(shù)。對(duì)于純粹競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合機(jī)制和單一結(jié)合部位而言，由單點(diǎn)NMR所導(dǎo)出的結(jié)合常數(shù)與由完全滴定熒光和ITC導(dǎo)出的結(jié)合常數(shù)之間完全吻合。該NMR方法還能夠測(cè)定高親和性結(jié)合常數(shù)，而該常數(shù)是不易由其它NMR方法得到的。
檢測(cè)限由于弱結(jié)合親和性參考分子的巨大的CSA以及巨大的交換作用，因此有可能顯著降低篩選需要蛋白質(zhì)的濃度。可以從圖10理解這一點(diǎn)，其中篩選是在濃度僅為150nM的HSA的存在下進(jìn)行的。盡管[LTOT]/[ETOT]的比值巨大(＝330)而[EL]/[LTOT]的比值小(＝0.00165，使用41μM的KD)，有可能觀察到小部分的結(jié)合配體的效果，并且在這種低蛋白濃度下進(jìn)行篩選。這可能是一個(gè)幸運(yùn)的情形。根據(jù)固態(tài)NMR試驗(yàn)，在氟原子鄰位的OH基團(tuán)會(huì)導(dǎo)致組分中垂直于芳環(huán)的19F化學(xué)位移張量的50ppm的位移，并導(dǎo)致巨大的19F-CSA(H.Raber等，Chem.Phys.，26，123-130(1977))。然而，使用其他的蛋白質(zhì)以及使用包含一個(gè)對(duì)氟苯甲基殘基的參考分子也可以觀測(cè)到類似的情形(數(shù)據(jù)未示出)。因此，交換項(xiàng)可能所觀測(cè)的自旋-自旋弛豫有顯著的影響。圖10所記錄的波譜使用了128次掃描且總的測(cè)量時(shí)間為10分鐘。用于優(yōu)化19F探測(cè)的冷凍探針技術(shù)的使用能夠進(jìn)一步地改善其探測(cè)范圍。然后可以使用濃度低至50至100nM的蛋白質(zhì)濃度。這將能夠?qū)φ漳切┎荒芤暂^高量表達(dá)的蛋白質(zhì)(例如，膜蛋白質(zhì))篩選大量的化學(xué)混合物。可以使用冷凍探針技術(shù)非?？焖俚赜涗浄ㄗV。一個(gè)保守估計(jì)的使用冷凍探針技術(shù)的雙倍靈敏度改善將使探測(cè)時(shí)間減少4倍。因此，僅在150s的時(shí)間內(nèi)記錄圖10的波譜，從而提高了篩選過(guò)程的處理量。應(yīng)當(dāng)指出的是在氟檢測(cè)試驗(yàn)中并不存在質(zhì)子檢測(cè)試驗(yàn)中所遇到的輻射衰減問(wèn)題，因?yàn)殚g諜和對(duì)照分子的濃度低。
在質(zhì)子化的溶劑和洗滌劑的存在下的篩選基于19F配體的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)的一個(gè)特別的優(yōu)點(diǎn)是可以甚至在質(zhì)子化的溶劑、緩沖劑或洗滌劑的存在下進(jìn)行篩選。在100mM HEPES和1％甘油的存在下的HSA的質(zhì)子波譜如圖11所示。緩沖劑和甘油的強(qiáng)烈的信號(hào)屏蔽了進(jìn)行篩選所需的參照和對(duì)照分子的弱信號(hào)。而在19F檢測(cè)試驗(yàn)中就不存在這些問(wèn)題。
因此可能即便在這些困難的試驗(yàn)條件下進(jìn)行如圖11所示的篩選。由于這些特性，基于氟配體的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合篩選實(shí)驗(yàn)對(duì)于對(duì)照溶于SDS(十二烷基磺酸鈉)或其他的洗滌劑的膜蛋白質(zhì)進(jìn)行的分子的篩選是特別有利的。一旦一種適宜的參照分子被識(shí)別了，該基于19F配體的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合NMR篩選將提供一個(gè)可靠的采樣。與膜簡(jiǎn)單結(jié)合的分子和洗滌劑以及那些在不同測(cè)試中表現(xiàn)為潛在配體的分子在此處所示的19F試驗(yàn)中將不會(huì)被檢測(cè)到。僅有與參考分子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的分子才會(huì)識(shí)別出來(lái)。最后，該試驗(yàn)還可被用于植物和真菌提取物的篩選，以及用于活細(xì)胞內(nèi)部分子的篩選。
結(jié)論因此，使用一個(gè)包含19F原子的弱親并結(jié)合配體結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)允許對(duì)照蛋白質(zhì)、DNA或RNA片段快速篩選大量的化學(xué)混合物。此外，該方法能夠?qū)MR采樣的結(jié)合常數(shù)進(jìn)行直接測(cè)定。
試驗(yàn)19F競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合HTS試驗(yàn)不存在重疊問(wèn)題，并且由于19F核的高靈敏度(是1H靈敏度的0.83倍)，因此可能快速篩選巨大的化學(xué)品或天然產(chǎn)物提取物庫(kù)。此外，可以在高濃度的非氘代洗滌劑的存在下進(jìn)行蛋白質(zhì)溶液的試驗(yàn)，因此，能夠試驗(yàn)?zāi)さ鞍踪|(zhì)進(jìn)行HTS。此外，由于未使用所篩選的實(shí)際分子的共振，僅需要間諜分子和對(duì)照分子含有氟殘基。因此，基于氟的競(jìng)爭(zhēng)篩選在制藥工業(yè)中應(yīng)具有廣泛的用途，并將擴(kuò)展NMR篩選對(duì)于藥物發(fā)現(xiàn)方法的影響。
該方法是一種快速方法并且僅需要有限量的蛋白質(zhì)，因此相對(duì)于高通量篩選中所試驗(yàn)的其他的非NMR技術(shù)，該方法更有效。此外，該方法在單一試驗(yàn)內(nèi)提供了一個(gè)有意義的NMR采樣的結(jié)合常數(shù)值。
由于其不存在重疊現(xiàn)象，因此能夠用于篩選來(lái)源于組合化學(xué)、藥物化學(xué)或天然產(chǎn)物提取物的大量的化學(xué)混合物。還可以使用該方法進(jìn)行對(duì)照溶于不同洗滌劑的膜蛋白質(zhì)的篩選。最后，預(yù)期這些試驗(yàn)可以擴(kuò)展至一個(gè)對(duì)照位于活細(xì)胞內(nèi)部的受體的分子的篩選。
這里所引用的專利、專利文獻(xiàn)以及出版物的全部公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)全文引用的方式被單獨(dú)包括在本申請(qǐng)中。在不背離本發(fā)明的精神與范圍的前提下，對(duì)本發(fā)明之方法與組合物之各修改以及改變對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見(jiàn)的。應(yīng)了解，本發(fā)明不受這里所述的具體實(shí)施方案和實(shí)施例的過(guò)度限制。所給出的這些實(shí)施例和具體實(shí)施方案僅是對(duì)本發(fā)明范圍的一種舉例說(shuō)明，本發(fā)明的范圍僅受到如下所述的權(quán)利要求的限制。
權(quán)利要求
1.一種識(shí)別靶分子的配體的方法，該方法包括提供與靶分子相互作用的19F-標(biāo)記參考化合物；在靶分子的存在下采集19F-標(biāo)記參考化合物的1D19F核磁共振波譜；提供包含至少一種測(cè)試化合物的測(cè)試樣品；在各測(cè)試樣品和靶分子的存在下采集19F-標(biāo)記參考化合物的1D19F核磁共振波譜；比較在靶分子的存在下該19F-標(biāo)記參考化合物的波譜與在各測(cè)試樣品和靶分子的存在下該19F-標(biāo)記參考化合物的波譜，以測(cè)定一個(gè)或多個(gè)該19F-標(biāo)記參考化合物共振的變化；和識(shí)別至少一種與靶分子相互作用的測(cè)試化合物，其中該測(cè)試化合物置換19F-標(biāo)記參考化合物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中測(cè)試化合物具有至少與參考化合物一樣緊密的結(jié)合親和力。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中一個(gè)或多個(gè)參考化合物共振中的變化包括在至少一個(gè)參考共振中的信號(hào)強(qiáng)度的增加。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中識(shí)別至少一種測(cè)試化合物包括在各靶分子的存在下記錄19F-標(biāo)記參考化合物的單獨(dú)的1D19F核磁共振波譜。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，該方法進(jìn)一步包括在不同的19F-標(biāo)記參考化合物的濃度下，在靶分子的存在下，采集參考化合物的1D19F核磁共振波譜；和測(cè)定測(cè)試化合物的解離常數(shù)。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，該方法進(jìn)一步包括在不同濃度的靶分子的存在下，采集19F-標(biāo)記參考化合物的1D19F核磁共振波譜；和測(cè)定測(cè)試化合物的解離常數(shù)。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中在采集在用于比較步驟的在靶分子的存在下的19F-標(biāo)記參考化合物的核磁共振波譜之前，該方法包括在不同濃度的靶分子或在不同濃度的19F-標(biāo)記參考化合物的存在下采集19F-標(biāo)記參考化合物的1D19F核磁共振波譜；和測(cè)定識(shí)別至少一種與靶分子相互作用的測(cè)試化合物的最佳實(shí)驗(yàn)條件。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中靶分子是大分子。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中大分子是多肽或多核苷酸。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中大分子是蛋白質(zhì)。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該參考化合物在微摩爾范圍內(nèi)的結(jié)合親和力下與靶分子結(jié)合。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中參考化合物的結(jié)合親和力是通過(guò)等溫滴定量熱法或熒光光譜法測(cè)定的。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，該方法進(jìn)一步包括一個(gè)識(shí)別參考化合物的步驟，該步驟包括在不存在靶分子的條件下，采集潛在參考化合物的WaterLOGSY核磁共振波譜；在靶分子的存在下采集潛在參考化合物的WaterLOGSY核磁共振波譜；和比較WaterLOGSY波譜以識(shí)別潛在參考化合物是否與靶分子相互作用。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其中測(cè)試樣品包括兩種或多種測(cè)試化合物的混合物。
15.如權(quán)利要求14的方法，該方法進(jìn)一步包括在各測(cè)試化合物和靶分子的存在下采集19F-標(biāo)記參考化合物的1D19F核磁共振波譜；和比較在靶分子的存在下該參考化合物的波譜與在各測(cè)試化合物和靶分子的存在下該參考化合物的波譜，以測(cè)定所選擇的19F-標(biāo)記參考化合物共振的變化。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，其中測(cè)試化合物具有比參考化合物更緊密的結(jié)合親和力。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，其中提供19F-標(biāo)記參考化合物包括提供19F-標(biāo)記參考化合物和具有規(guī)定線寬、振幅和頻率的ERETIC信號(hào)；在靶分子的存在下采集19F-標(biāo)記參考化合物的1D19F核磁共振波譜包括在靶分子的存在下采集帶有ERETIC信號(hào)的19F-標(biāo)記參考化合物的波譜；和在各測(cè)試樣品和靶分子的存在下采集19F-標(biāo)記參考化合物的1D19F核磁共振波譜包括在各測(cè)試樣品和靶分子的存在下采集帶有ERETIC信號(hào)的19F-標(biāo)記參考化合物的波譜。
18.如權(quán)利要求1所述的方法，其中提供19F-標(biāo)記參考化合物包括提供19F-標(biāo)記參考化合物和19F-標(biāo)記無(wú)相互作用的化合物；在靶分子的存在下采集19F-標(biāo)記參考化合物的1D19F核磁共振波譜包括在靶分子的存在下采集19F-標(biāo)記參考化合物和19F-標(biāo)記無(wú)相互作用的化合物的波譜；和在各測(cè)試樣品和靶分子的存在下采集19F-標(biāo)記參考化合物的1D19F核磁共振波譜包括在各測(cè)試樣品和靶分子的存在下采集19F-標(biāo)記參考化合物和19F-標(biāo)記無(wú)相互作用的化合物的波譜。
19.一種篩選化合物以識(shí)別靶分子的配體的方法，該方法包括采集至少一種測(cè)試化合物的第一1D19F核磁共振波譜；將至少一種測(cè)試化合物暴露于靶分子；采集至少一種已經(jīng)暴露于靶分子的測(cè)試化合物的第二1D19F核磁共振波譜；和比較該第一和第二波譜以測(cè)定一個(gè)或多個(gè)共振的變化，并識(shí)別至少一種與靶分子相互作用的測(cè)試化合物。
20.如權(quán)利要求1所述的方法，其中提供測(cè)試樣品包括提供多個(gè)測(cè)試樣品，各測(cè)試樣品包括至少一種測(cè)試化合物。
全文摘要
通過(guò)使用
文檔編號(hào)G01N33/53GK1668757SQ03817273
公開(kāi)日2005年9月14日 申請(qǐng)日期2003年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月5日
發(fā)明者C·達(dá)爾維特, B·J·斯托克曼, M·弗洛科, M·維羅尼西 申請(qǐng)人:法瑪西雅厄普約翰有限責(zé)任公司