棉花植物事件aD14-2以及用于其檢測(cè)的組合物和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其是農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物育 種領(lǐng)域，特別是涉及具有改良棉花纖維品質(zhì)的棉花轉(zhuǎn)化事件aD14-2,以及檢測(cè)該轉(zhuǎn)化事件 的特有方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 棉花纖維是棉花生產(chǎn)的主要產(chǎn)品，棉花纖維的產(chǎn)量和品質(zhì)直接決定了棉花生產(chǎn)的 產(chǎn)值和效益。因此，提高棉花纖維品質(zhì)一直是棉花育種的主要目標(biāo)。但是棉花的產(chǎn)量和品質(zhì) 均為數(shù)量性狀，受到多種因素的影響并且產(chǎn)量與品質(zhì)之間存在負(fù)相關(guān)，嚴(yán)重阻礙著棉花纖 維品質(zhì)和產(chǎn)量的同步改良。棉花栽培品種主要是陸地棉，而優(yōu)良纖維品質(zhì)基因主要源于二 倍體的瑟伯氏棉（纖維強(qiáng)度）、異常棉（纖維強(qiáng)度與細(xì)度）以及四倍體的海島棉（纖維強(qiáng)度 與細(xì)度）等。這些優(yōu)良性狀基因的利用，在常規(guī)育種中卻受到諸多限制，單靠現(xiàn)有的棉花遺 傳種質(zhì)資源和常規(guī)育種手段已經(jīng)難以大幅度提高棉花產(chǎn)量，難以滿足快速發(fā)展的紡織工藝 革命對(duì)纖維品質(zhì)的要求。利用基因工程技術(shù)育種可以打破物種間的遺傳障礙，實(shí)現(xiàn)優(yōu)良目 的基因的定向轉(zhuǎn)移，同時(shí)具有后代易于穩(wěn)定，育種周期短等優(yōu)點(diǎn)，這為棉花纖維產(chǎn)量和品質(zhì) 的改良提供了新的途徑。但是目前人們還未得到與棉花纖維形成，以及產(chǎn)量和品質(zhì)（強(qiáng)度、 細(xì)度和長(zhǎng)度等）直接相關(guān)的基因，使導(dǎo)利用基因工程改良棉花纖維缺乏有效的目的基因。
[0003] 棉纖維的品質(zhì)主要由棉花纖維細(xì)胞的分化與發(fā)育階段決定，是一個(gè)復(fù)雜有序的過(guò) 程，在不同的發(fā)育時(shí)期均有大量的基因表達(dá)，參與纖維細(xì)胞發(fā)育的調(diào)控。棉纖維細(xì)胞由胚珠 外珠被單個(gè)細(xì)胞分化而來(lái)，是高等植物中伸長(zhǎng)最快、合成纖維素最多的模式單細(xì)胞。其分化 和發(fā)育過(guò)程可分為纖維細(xì)胞分化與突起、纖維細(xì)胞的迅速伸長(zhǎng)、次生壁的合成和脫水成熟4 個(gè)時(shí)期，是多種基因共同表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程。其中纖維伸長(zhǎng)和次生壁合成兩個(gè)時(shí)期部分 重疊，對(duì)纖維的發(fā)育與品質(zhì)形成關(guān)系密切。棉纖維的品質(zhì)主要包括纖維長(zhǎng)度、強(qiáng)度、伸長(zhǎng) 率、麥克隆值等性狀。纖維的起始與伸長(zhǎng)直接影響到纖維的數(shù)量與長(zhǎng)度，而次生壁加厚期纖 維素的合成則影響纖維的強(qiáng)度與麥克隆值等性狀。人們對(duì)棉花纖維發(fā)生、發(fā)育和品質(zhì)形成 的分子機(jī)理也知之甚少。這些都極大的阻礙了對(duì)棉花纖維進(jìn)行產(chǎn)量和品質(zhì)改良的進(jìn)程。
[0004] 目前通過(guò)分子生物學(xué)手段改良棉花纖維品質(zhì)的思路主要是通過(guò)植物轉(zhuǎn)基因技術(shù) 導(dǎo)入能調(diào)控棉花體內(nèi)激素、纖維素及多糖合成的基因。John等（1996)將乙酰CoA還原酶基 因（phaB)和PHB合酶基因（phaC)導(dǎo)入到陸地棉栽培種中，轉(zhuǎn)基因棉纖維品質(zhì)如強(qiáng)度、長(zhǎng)度 等雖然沒(méi)明顯的改良，但轉(zhuǎn)基因棉花的吸熱性和導(dǎo)熱性能明顯增加。J〇hn(1999)將與生長(zhǎng) 素合成相關(guān)的基因 iaaM和iaaH導(dǎo)入常規(guī)棉花中，雖然轉(zhuǎn)基因棉纖維中IAA的含量顯著地 增加然而纖維長(zhǎng)度、細(xì)度和強(qiáng)度與對(duì)照相比沒(méi)有顯著差異。Jiang等（2011)將纖維素合酶 基因（GhSusAl)轉(zhuǎn)入棉花中，結(jié)果表明過(guò)度表達(dá)GhSusAl基因的棉花株系纖維品質(zhì)明顯高 于非轉(zhuǎn)基因株系。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明人通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法獲得了轉(zhuǎn)基因事件aD14_2的棉花品系。該轉(zhuǎn)化事件 具有穩(wěn)定的改良棉花纖維品質(zhì)的性狀。其代表性種子已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理 委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為：CGMCC No. 8881，分類命名為陸地棉，拉丁文名稱是 Gossypium hirsutum，保藏單位地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生 物研究所，保藏日期為2014年5月8日。
[0006] 本發(fā)明的第一方面提供棉花轉(zhuǎn)化事件aD14_2,其特征序列如SEQ ID No :21所 示，其由第398-4145bp的T-DNA插入序列，第l-397bp上游側(cè)翼棉花基因組序列和第 4146-4489bp的下游側(cè)翼棉花基因組序列構(gòu)成。
[0007] 本發(fā)明的第二方面提供一種核酸構(gòu)建體，其包含所述棉花轉(zhuǎn)化事件aD14_2。
[0008] 本發(fā)明的第三方面提供一種重組載體，其包含本發(fā)明第一方面所述的T-D ΝΑ插入 序列或含有棉花轉(zhuǎn)化事件aD14_2的核酸構(gòu)建體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體為說(shuō)明書附 圖 1 中的 p2300-pE203-mCBD 載體。
[0009] 本發(fā)明第四方面提供一種重組細(xì)胞，含有本發(fā)明第一方面所述的T-DNA插入序列 或本發(fā)明第二方面所述的核酸構(gòu)建體或本發(fā)明第三方面所述的載體，所述重組細(xì)胞為重組 農(nóng)桿菌細(xì)胞。
[0010] 本發(fā)明第五方面提供用于檢測(cè)本發(fā)明第一方面所述的棉花轉(zhuǎn)化事件的引物對(duì)，其 由特異性識(shí)別本發(fā)明第一方面所述的T-DNA插入序列的第一引物和特異性識(shí)別本發(fā)明第 一方面所述的任一側(cè)翼序列的第二引物組成。在一些實(shí)施方案中，所述第一引物選自SEQ ID N0 :22或23時(shí)，所述第二引物選自SEQ ID N0 :14或17。在另一些實(shí)施方案中，所述第 一引物選自SEQ ID N0 :24或25時(shí)，所述第二引物選自SEQ ID N0 :15或18。
[0011] 本發(fā)明第六方面提供一種鑒定棉花生物樣品中aD14-2轉(zhuǎn)化事件的方法，其包括：
[0012] (a)從待鑒定的棉花生物樣品提取DNA樣品；
[0013] (b)以提取的DNA樣品為模板使用本發(fā)明第五方面所述的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0014] (c)檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如果擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度與SEQ ID N0 :21上所述PCR引物對(duì)的 序列之間的理論長(zhǎng)度一致，則表明所述棉花生物樣品中aD14-2轉(zhuǎn)化事件存在。
[0015] 本發(fā)明第七方面提供了一種制備轉(zhuǎn)基因棉花的方法，培養(yǎng)含有本發(fā)明第一方面所 述的轉(zhuǎn)化事件的棉花種子或其他組織，包括：利用含有本發(fā)明第一方面所述的轉(zhuǎn)化事件材 料的棉花材料，與其它棉花育種材料進(jìn)行雜交后，進(jìn)一步進(jìn)行回交，獲得含有本發(fā)明第一方 面所述的轉(zhuǎn)化事件的新材料；在雜交及回交過(guò)程中，利用本發(fā)明第六方面的方法在后代群 體中進(jìn)行篩選鑒定，確認(rèn)本發(fā)明第一方面所述的轉(zhuǎn)化事件的存在。
[0016] 本發(fā)明第八方面提供本發(fā)明第一方面所述的轉(zhuǎn)化事件、發(fā)明第二方面所述的核酸 構(gòu)建體、發(fā)明第三方面所述的重組載體、發(fā)明第四方面所述的重組細(xì)胞、發(fā)明第六方面或發(fā) 明第七方面所述的方法用于提高棉花纖維品質(zhì)、進(jìn)行植物育種以及用作分子標(biāo)記的用途。
[0017] 本發(fā)明中利用的編碼CBD蛋白的cbd基因 （GenBank :AAA23218. 1)來(lái)源于食纖維 梭菌（Clostridium cellulovorans)，該CBD蛋白是1990年由0· Shoseyov從食纖維梭菌中 純化到的纖維素酶復(fù)合物的組成成分，該復(fù)合物對(duì)微晶纖維（crystalline celluose)有纖 維酶的活性。實(shí)驗(yàn)表明若將CBDs從纖維素酶或纖維小體的腳手架結(jié)構(gòu)中去除將極大的降 低酶活。E.Shpigel對(duì)CBDs的功能研究發(fā)現(xiàn)，CBDs能在體外增強(qiáng)Prunus persica L.花粉 管的伸長(zhǎng)；增加 A. Xylinum纖維素合成酶的活性，促進(jìn)纖維素的合成。本發(fā)明利用纖維特 異性啟動(dòng)子EV0203驅(qū)動(dòng)cbd基因，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化棉花，通過(guò)篩選獲得棉纖維 衣份、比強(qiáng)和馬克隆值均有明顯改善的單拷貝轉(zhuǎn)化事件aD14-2,并利用分子生物學(xué)手段獲 得了該插入事件左右兩側(cè)的棉花基因組序列。
[0018] 本發(fā)明創(chuàng)造出的cbd基因的優(yōu)質(zhì)棉花轉(zhuǎn)化事件，不僅可以顯著改善棉花纖維品 質(zhì)，遺傳穩(wěn)定、單拷貝整合且整合側(cè)翼序列分子特征清楚，在生產(chǎn)育種中具有重要應(yīng)用價(jià) 值，而且由于具有獨(dú)特的檢測(cè)方法，可方便地通過(guò)雜交聚合的方式聚合不同的商業(yè)化轉(zhuǎn)化 事件。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1示出了植物表達(dá)載體p2300-pE203-mCBD的構(gòu)建流程。
[0020] 圖2示出了利用Southern雜交技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因事件aD14_2拷貝數(shù)進(jìn)行檢測(cè)的實(shí)驗(yàn) 結(jié)果。1，經(jīng)Hind III酶切的含mCBD基因的質(zhì)粒；2,經(jīng)EcoR I酶切的轉(zhuǎn)化事件aD14-2基 因組DNA件；3,經(jīng)Hind III酶切的轉(zhuǎn)化事件aD14-2基因組DNA ;Marker，經(jīng)EcoR I/Hind III酶切的XDNA。
[0021] 圖3是右邊界（RB)旁側(cè)序列示意圖。
[0022] 圖4是左邊界（LB)旁側(cè)序列示意圖。
[0023] 圖5是aD14_2事件的插入序列及鑒定引物的示意圖。
[0024] 圖 6 示出 了利用引物對(duì) RBcheck51 ' /GSP2-mCBD32 '、RBcheck52 ' / GSP2-mCBD32，以及 LBcheck3r /GSP2-NPTII52，、LBcheck32，/GSP2-NPTII52，分別 擴(kuò)增aD14_2事件和冀棉14的棉花樣品結(jié)果。M，marker，ADNA/EcoR I+Hind III;1， 3 :RBcheck5r /GSP2-mCBD32 ^ 擴(kuò)增 aD14-2 事件和冀棉 14,陽(yáng)性擴(kuò)增條帶 1810bp ;2， 4 :RBcheck52 ^ /GSP2-mCBD32 ^ 擴(kuò)增 aD14-2 事件和冀棉 14,陽(yáng)性擴(kuò)增條帶 1665bp ;5， 7 iLBcheckSI' /GSP2-NPTII52'擴(kuò)增 aD14-2 事件和冀棉 14,陽(yáng)性擴(kuò)增條帶 802bp ;6,8 : LBcheck32' /GSP2-NPTII52'擴(kuò)增aD14-2事件和冀棉14,陽(yáng)性擴(kuò)增條帶773bp。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 在本發(fā)明中，"轉(zhuǎn)化事件"是指外源插入DNA序列和特定棉花基因組DNA序列 的接合。"轉(zhuǎn)化事件"并不是一種植物細(xì)胞或植株，植物細(xì)胞或植株是轉(zhuǎn)化事件存在的載 體；轉(zhuǎn)化事件的核心特征是外源基因在植物基因組中特定位點(diǎn)的插入所形成的外源插入序 列和特定棉花基因組序列連接的一段特征DNA序列。
[0026] 具有某個(gè)轉(zhuǎn)基因事件的植物品系被稱為相同名稱的品系。例如，具有aD14_2轉(zhuǎn)基 因事件的植物品系被稱為aD14_2品系。
[0027] 實(shí)施例
[0028] 下面結(jié)合非限制性實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明。
[0029] 實(shí)施例1.植物表達(dá)載體構(gòu)建
[0030] 因編碼纖維素結(jié)合域CBD (cellulose binding domain)基因來(lái)源于食纖維梭菌， 其GC含量及密碼子偏好性與棉花基因組有所差異，因此根據(jù)棉花密碼子偏好改變其堿基 組成，用人工合成的方法合成SP和CBD基因融合序列（序列為SEQ ID N〇:l)，其中SP序 列來(lái)自擬南芥CEL1基因的N端24個(gè)堿基，為導(dǎo)肽序列。融合序列委托Takara公司進(jìn)行全 基因人工合成新基因命名為SP+mCBD。選擇植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA2300 (購(gòu)自北京鼎國(guó) 昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）作為植物表達(dá)載體，用Pnos啟動(dòng)子替換NPTII基因含雙增強(qiáng) 子的35S啟動(dòng)子，以降低NPTII蛋白在植物中的表達(dá)。選取來(lái)自棉花纖維中特異表達(dá)的啟 動(dòng)子EV0203(序列為SEQ ID No :2所示），驅(qū)動(dòng)融合基因的表達(dá)，以Tnos作為終止子。
[0031] 用引物SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4以