構(gòu)建鏈特異性轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種構(gòu)建鏈特異性轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 轉(zhuǎn)錄組二代測(cè)序作為近年來(lái)新發(fā)展起來(lái)的高通量測(cè)序技術(shù)，為大規(guī)模轉(zhuǎn)錄組學(xué)研 究提供了一種全新的且更為有效的方法。該技術(shù)能在單核苷酸水平上全面快速地獲取某一 物種特定器官或組織在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本。與其他轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)相比，其具有 高通量、低成本、高靈敏度等明顯的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)可以獲得低豐度的表達(dá)基因。
[0003] 目前各大生物公司及文獻(xiàn)報(bào)道了多種文庫(kù)構(gòu)建的方法：從起初需全長(zhǎng)mRNA進(jìn)行 建庫(kù)到目前采用片段化處理mRNA再進(jìn)行建庫(kù)，極大降低了全長(zhǎng)mRNA建庫(kù)帶來(lái)的末端偏好 性及合成全長(zhǎng)cDNA引入的錯(cuò)誤等問(wèn)題，提高了文庫(kù)的均一性及后續(xù)數(shù)據(jù)分析的效率。當(dāng)前 市場(chǎng)上主要存在兩種方法：第一種方法一也是目前最普遍米用的方案，先合成雙鏈cDNA， 然后經(jīng)末端修飾、連接測(cè)序接頭、PCR擴(kuò)增即得到轉(zhuǎn)錄組PE(pairend)文庫(kù)。第二種方法， 鏈特異性建庫(kù)或方向性建庫(kù)，是通過(guò)反轉(zhuǎn)錄將P7測(cè)序接頭序列引入到cDNA第一鏈。與第 一種建庫(kù)方法相比較，后者優(yōu)勢(shì)明顯，主要表現(xiàn)在：1)建庫(kù)周期大大縮短，僅僅一天就可以 完成文庫(kù)構(gòu)建；避免了合成cDNA第二鏈而引入的錯(cuò)誤信息；2)可以確定兩條鏈的轉(zhuǎn)錄方向 性（正義或反義鏈），為基因的進(jìn)一步注釋和功能分析提供更準(zhǔn)確的信息；3)可以挖掘轉(zhuǎn)錄 組中的non-codingRNA信息及反義（antisense)轉(zhuǎn)錄本；4)還可以進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)的研究， 例如原核生物操縱子鑒定，為基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的研究提供有力支持。但目前該鏈特異性建庫(kù) 存在一些缺陷，如cDNA合成效率低、副產(chǎn)物多等。
[0004] 鏈特異性建庫(kù)如Epicentre公司的ScriptSeq?v2RNA-Seq法（如圖1所示）是 通過(guò)末端延伸的方法，將測(cè)序接頭序列引入到cDNA兩端，最后通過(guò)PCR擴(kuò)增得到含有P5/P7 測(cè)序接頭序列的鏈特異性文庫(kù)，具體為：1)mRNA片段化處理：在fragmentbuffer作用下， 85度加熱處理，得到目標(biāo)片段大小主要集中在300bp左右的RNA;2)反轉(zhuǎn)錄：采用R6N進(jìn)行 反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈；3)cDNA3'端標(biāo)記：去除RNA后，采用F6N與cDNA3'端進(jìn)行退火 配對(duì)，在聚合酶作用下對(duì)cDNA進(jìn)行延伸；4)PCR擴(kuò)增：采用含不同標(biāo)簽的引物進(jìn)行擴(kuò)增（一 次性可以處理多個(gè)樣本），產(chǎn)物經(jīng)磁珠純化后即得到鏈特異性轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)；5)質(zhì)檢：電泳檢 測(cè)及Agilent2100檢測(cè)文庫(kù)大小及質(zhì)量。
[0005]v2RNA-Seq法缺陷如下：1)cDNA第一鏈合成效率低：采用隨機(jī)堿基引物進(jìn)行反轉(zhuǎn) 錄，引物與模板mRNA隨機(jī)進(jìn)行匹配退火，導(dǎo)致cDNA第一鏈長(zhǎng)度差異很大，產(chǎn)生較多的短片 段，并且因偏好性問(wèn)題導(dǎo)致cDNA不均一，造成cDNA合成效率低，最終影響文庫(kù)的質(zhì)量，不 利于后續(xù)數(shù)據(jù)的分析。2)副產(chǎn)物影響：采用R6N/F6N末端都是隨機(jī)堿基，極易形成自連產(chǎn) 物，降低了文庫(kù)構(gòu)建的效率，影響文庫(kù)質(zhì)量，甚至導(dǎo)致文庫(kù)構(gòu)建失敗，造成后續(xù)數(shù)據(jù)分析的 困難。3)cDNA3'端標(biāo)記效率低：用于延伸的引物F6N的3'末端6個(gè)N堿基后直接采用C3 spacer處理，因空間位阻，會(huì)影響6N與cDNA末端退火配對(duì)，并且極易互相配對(duì)，降低了反應(yīng) 中F6N的有效濃度，最終影響cDNA3'端延伸。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)v2RNA-Seq法中的cDNA3'端標(biāo)記效率低的技術(shù)問(wèn)題，目的 在于提供一種新的構(gòu)建鏈特異性轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的方法。在該方法中，cDNA第一鏈合成后，采用 TdT末端轉(zhuǎn)移酶在cDNA3'端添加多個(gè)dC堿基（即同聚物dCTP)及ddCTP進(jìn)行末端封閉終 止反應(yīng)，然后與含多個(gè)dG堿基的F5G引物（即帶5個(gè)G的第二鏈合成引物）配對(duì)，在聚合 酶的作用下進(jìn)行cDNA二鏈合成，通過(guò)延伸固定堿基序列克服了原有步驟的缺陷，極大程度 的提高了末端延伸的效率，降低偏好性及自連產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而提高cDNA3'端標(biāo)記效率。
[0007] 本發(fā)明的構(gòu)建鏈特異性轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的方法如下步驟：
[0008] 步驟1)mRNA片段化處理；
[0009] 步驟2)反轉(zhuǎn)錄：合成cDNA第一鏈；
[0010] 步驟3)cDNA3'端標(biāo)記：去除RNA后，采用TdT末端轉(zhuǎn)移酶對(duì)cDNA3'端添加多個(gè) dC堿基，并采用ddCTP進(jìn)行末端封閉終止反應(yīng)，然后與帶5個(gè)G的第二鏈合成引物（簡(jiǎn)稱 F5G引物）進(jìn)行配對(duì)，在聚合酶作用下復(fù)制cDNA第一鏈；
[0011] 步驟4)PCR擴(kuò)增。
[0012] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中cDNA第一鏈合成效率低的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的構(gòu)建鏈特異 性轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的方法在步驟2)反轉(zhuǎn)錄之前，片段化的mRNA3'端連接已知序列的R3接頭； 在步驟2)反轉(zhuǎn)錄中：再采用cDNA逆轉(zhuǎn)錄引物（簡(jiǎn)稱RTprimer)與R3接頭退火配對(duì)進(jìn)行 反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈，如此可有效減少了短片段產(chǎn)生，提高了cDNA均一性，從而顯著地 提高cDNA第一鏈合成效率。
[0013] 在本發(fā)明一較佳實(shí)施例中，在步驟2)反轉(zhuǎn)錄之前，每1μg片段化的mRNA3'端連 接5~12pmol優(yōu)選8~lOpmol已知序列的R3接頭；步驟2)反轉(zhuǎn)錄：采用25~60pmol優(yōu) 選40~50pmolRTprimer與R3接頭退火配對(duì)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈。
[0014] 在本發(fā)明另一較佳實(shí)施例中，步驟3)cDNA3'端標(biāo)記：去除RNA后，針對(duì)lyg片段 化的mRNA3'，cDNA合成后采用30~50U優(yōu)選40UTdT對(duì)cDNA3'端添加多個(gè)dC堿基，并 米用4~6nmol優(yōu)選5nmolddCTP進(jìn)行末端封閉，然后與80~120pmol優(yōu)選lOOpmolF5G 引物進(jìn)行配對(duì)，在聚合酶作用下復(fù)制cDNA第一鏈。
[0015] 本發(fā)明為了解決現(xiàn)有技術(shù)中極易形成自連產(chǎn)物的技術(shù)問(wèn)題，較佳地是，去除RNA 后，先用50pmol的封閉引物（簡(jiǎn)稱Cover-Primer)對(duì)剩余的RTPrimer進(jìn)行封閉，再用TdT 對(duì)cDNA3'端添加多個(gè)dC堿基，如此極大地降低了自連二聚體的產(chǎn)生。
[0016] 步驟 1)每 1μg的mRNA用 30 ~50μL的Dynabeadsoligo(dT) 25 (即寡聚脫氧腺 苷酸磁珠）進(jìn)行富集后再進(jìn)行片段化處理。
[0017] 步驟4)PCR擴(kuò)增：采用含不同標(biāo)簽的引物進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)磁珠純化后即得到鏈 特異性轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)。
[0018] 本發(fā)明的構(gòu)建鏈特異性轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的方法還可包括步驟5)質(zhì)檢：用0.6~1倍優(yōu) 選0. 8倍體積的Ampure磁珠純化回收目的區(qū)域片段，然后采用8%PAGE膠或1 %瓊脂糖凝 膠電泳及Agilent2100檢測(cè)文庫(kù)大小及質(zhì)量。
[0019] 在本發(fā)明中，所述的Cover-Primer的序列為AAANNNNNNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGGA ACTC-C3Spacer。所述的F5G引物的序列為CTACACGACGCTCTTCCGATCTGGGGGH;所述R3 接頭 的序列為TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG;所述的RTprimer的序列為GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA。
[0020] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"TdT"是指末端轉(zhuǎn)移酶；術(shù)語(yǔ)"ddCTP"是指雙脫氧胞嘧啶；術(shù)語(yǔ) "F5G"也稱"Trans-F5G"是指帶5個(gè)G的第二鏈合成引物；術(shù)語(yǔ)"RTprimer"是指cDNA逆 轉(zhuǎn)錄引物；術(shù)語(yǔ)"R3接頭"是指連接到mRNA3'端的接頭；術(shù)語(yǔ)"Cover-Primer"是指封閉引 物，即封閉多余R3接頭序列的引物。
[0021] 本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：如圖2所示為本發(fā)明的構(gòu)建鏈特異性轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的 示意圖，將測(cè)序接頭序列（如R3接頭）直接連接到RNA的3端引入到引物序列中，通過(guò)反 轉(zhuǎn)錄及末端標(biāo)記含多個(gè)dC堿基，通過(guò)含多個(gè)G的第二鏈引物，實(shí)現(xiàn)DNA兩端分別含有測(cè)序 接頭序列，最終通過(guò)PCR擴(kuò)增得到鏈特異性文庫(kù)。并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了優(yōu)化：在cDNA合成 完成后，采用Cover-Primer封閉剩余的RTprimer，減少自連二聚體的產(chǎn)生；mRNA先連接R3 接頭再進(jìn)行cDNA合成，以提高cDNA合成效率、cDNA均一性；三種方案可以有效降低接頭二 聚體的產(chǎn)生、提高文庫(kù)均一性及文庫(kù)質(zhì)量，便于后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1為現(xiàn)有技術(shù)中ScriptSeq?v2RNA-Seq法構(gòu)建文庫(kù)的示意圖。
[0023]圖2為本發(fā)明的構(gòu)建鏈特異性轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的示意圖。
[0024] 圖3為實(shí)施例1和對(duì)比實(shí)施例1獲得的目的區(qū)域片段用1%瓊脂糖凝膠電泳的結(jié) 果圖。
[0025] 圖4為實(shí)施例1和實(shí)施例3獲得的目的區(qū)域片段用1%瓊脂糖膠電泳的結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 實(shí)施例1
[0027]mRNA片段化處理：提取合格的RNA，采用life-tech公司的Dynabead soligo(dT) 2550μL與 1μg總RNA混合純化mRNA。取 7yL5X(即 5 倍）fragmentbuffer 加入到28yLmRNA中，94°C5min，然后立即冰上。加入65yLddH20(即雙蒸水）、20yg糖 元、1/10體積3MpH5. 2NaAc、2. 5倍體積無(wú)水乙醇，混勾，存放-80°C20min;高速離心，沉淀 溶解于13μL去離子水。
[0028] 連接R3 接頭：mRNA溶解于 5μLddH20 中，加入 1μL10μΜ的R3 接頭，70°C2min， 冰上lmin。加入 1.5yLligationMix、200UT4截短型RNA連接酶 2K227Q(T4RNAligase 2TruncatedK227Q)，ddH20 補(bǔ)至 15μL，混勻，22°Clh。
[0029]cDNA合成：加入 1μL50μM的RTprimer，65°C5min，冰上放置lmin;加入 4μL RTMix、20UMMLV逆轉(zhuǎn)錄酶、ddH20補(bǔ)至 20yL，混勻，然后 25°C10min，42°C40min，4°C保存。
[0030]cDNA末端標(biāo)記：加入 20mgRNaseA，37°C15min，降解RNA/DNA雜合體的RNA。加 入 2yL50μΜCover-Primer;65°C5min，緩慢降溫至 20°C。加入 2.5yL10X末端轉(zhuǎn)移 Buffer、0.5yLlOmMdCTP、40UTdT，ddH20 補(bǔ)至 25yL，37°C30min。加入 0.5yLlOmM ddCTP，37°C15min;磁珠純化，20yLpH= 8.0TE(10mMTris-HCl和ImMEDTA)洗脫。加 入 1μL100μM的F5G，65°C2min，冰上lmin;加入 3μLKlenowfragment酶緩沖液、lul dNTP(lOmM)，0· 5μLKlenowfragment(10U/μL)(大腸桿菌DNA聚合酶I大片段），ddH20 補(bǔ)充至30yL，37°C60min。采用1.8倍體積Ampure磁珠進(jìn)行純化DNA，30yLTE洗脫。
[0031]PCR擴(kuò)增：上述純化的DNA14yL、正向引物0.5yL、反向引物0.5yL、2XPCR聚 合酶混合液 12yL混勻后，94°C5min、94°C10s、62°C15s、72°C30s，共 15 個(gè)循環(huán)，4°C保存。
[0032] 采用0. 8倍體積Ampure磁珠純化回收目的區(qū)域片段，并采用8%PAGE膠或1%瓊 脂糖凝膠電泳和Agilent2100檢測(cè)。
[0033] 實(shí)施例2
[0034]mRNA片段化處理：提取合格的RNA，采用life-tech公司的Dynabeadso 1igo(dT) 2530μL與