特異性識(shí)別β-葡萄糖醛酸苷酶的核酸適配體序列及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，針對(duì)葡萄糖醛酸苷酶的核酸適配體。公開(kāi)的核酸 適配體有希望能夠?qū)崿F(xiàn)3-葡萄糖醛酸苷酶的純化和固定化的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 3 -葡萄糖醛酸苷酶是一種糖苷類水解酶，能催化各種類型的3 -葡萄糖醛酸苷 水解，在動(dòng)物體內(nèi)參與廣泛的代謝過(guò)程從而維持機(jī)體正常的生理活動(dòng)，臨床上可作為腫瘤 治療中靶向前藥的水解酶，另外還被廣泛用于水質(zhì)檢測(cè)、體內(nèi)代謝藥物分析、天然產(chǎn)物的生 物催化轉(zhuǎn)化等領(lǐng)域。特別是作為催化劑應(yīng)用于生物轉(zhuǎn)化甘草酸生產(chǎn)甘草次酸和單葡萄糖醛 酸基甘草次酸過(guò)程中，克服了傳統(tǒng)化學(xué)法的反應(yīng)條件苛刻，選擇性差，產(chǎn)物收益率低，污染 環(huán)境等缺陷。3 -葡萄糖醛酸苷酶作為生物催化轉(zhuǎn)化甘草酸的關(guān)鍵酶，已受到越來(lái)越多的關(guān) 注，具有廣闊的應(yīng)用和開(kāi)發(fā)前景。固定化葡萄糖醛酸苷酶使工業(yè)用葡萄糖醛酸苷 酶的穩(wěn)定性提高并延長(zhǎng)了 葡萄糖醛酸苷酶的使用壽命。因此葡萄糖醛酸苷酶的固 定化受到了較為廣泛的關(guān)注。
[0003] 酶的固定化方法主要有吸附法，共價(jià)偶聯(lián)法，交叉法和包埋法等。但是，大量研究 表明這些固定化方法會(huì)一定程度上降低固定化酶的活性，主要原因?yàn)楣潭ɑ傅目臻g位阻 的存在阻礙底物與葡萄糖醛酸苷酶的活性位點(diǎn)的結(jié)合。另外，酶通過(guò)多位點(diǎn)與載體的 無(wú)序結(jié)合改變其活性構(gòu)象，從而造成酶活的損失?；谝陨峡紤]，利用酶的特定位點(diǎn)和特定 的材料及工藝將酶定向固定化到載體上，維持了酶的活性位點(diǎn)的穩(wěn)定的構(gòu)象，利于和底物 結(jié)合與反應(yīng)，能顯著提高固定化酶的活性和使用效率。同時(shí)，生物相容性差也是引起葡 萄糖醛酸苷酶的變性和活力的下降的原因，具有良好的生物相容性的載體能夠?yàn)?-葡萄 糖醛酸苷酶創(chuàng)造適宜的微環(huán)境。
[0004]核酸適配體是一種經(jīng)體外篩選技術(shù)得到的寡核苷酸序列ONA/RNA)，與相應(yīng)的靶 分子具有嚴(yán)格的識(shí)別能力和高度的親和力。目前，核酸適配體的主要通過(guò)SELEX技術(shù)體外 篩選獲得，其核心是模擬自然進(jìn)化過(guò)程，通過(guò)寡核苷酸間的堿基相互作用形成穩(wěn)定的二級(jí) 結(jié)構(gòu)（凸環(huán)、發(fā)卡、假節(jié)、G-四聯(lián)體等）與靶分子的特異性結(jié)合，利用寡核苷酸文庫(kù)與靶分 子親和力的不同，進(jìn)行多輪的篩選，最終獲得與靶分子高親和力和高特異性結(jié)合的寡核苷 酸序列。目前已被成功的應(yīng)用于氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、有機(jī)化合物、金屬離子、細(xì)胞等快速 檢測(cè)。與抗體等多肽類的適配體相比，核酸適配體的優(yōu)勢(shì)相當(dāng)明顯，如：制備簡(jiǎn)單快捷、化學(xué) 性質(zhì)穩(wěn)定、至今未見(jiàn)報(bào)道存在免疫原性或毒性、靶分子范圍廣、親和力高、特異性強(qiáng)、易于進(jìn) 行改造修飾，同時(shí)具有良好的生物相容性特點(diǎn)等優(yōu)點(diǎn)。
[0005] 目前，針對(duì)葡萄糖醛酸苷酶，尚無(wú)關(guān)于與其具有高特異性和高親和力的核酸 適配體及其制備方法和和應(yīng)用的研究報(bào)道。因此本發(fā)明通過(guò)篩選獲得對(duì)葡萄糖醛酸苷 酶的特異性核酸適配體，實(shí)現(xiàn)葡萄糖醛酸苷酶的定向純化和固定化，提高葡萄糖醛 酸苷酶的使用效率，降低使用成本，具有重要的社會(huì)價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一組葡萄糖醛酸苷酶核酸適配體序列，具體涉及一種 3 -葡萄糖醛酸苷酶PGUS-E的核酸適配體中具有高親和力和高特異性結(jié)合PGUS-E。
[0007] 本發(fā)明中，所述的0 -葡萄糖醛酸苷酶為0 -葡萄糖醛酸苷酶P⑶S-E。
[0008] 本發(fā)明采用核酸適配體序列的體外篩選（SELEX)技術(shù)，以葡萄糖醛酸苷酶 PGUS-E為篩選靶標(biāo)，篩選與PGUS-E特異結(jié)合的核酸適配體，獲得具有特異結(jié)合PGUS-E的核 酸適配體Apt5和Apt9。
[0009] 本發(fā)明通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0010] 采用改進(jìn)的核酸適配體的體外篩選技術(shù)即SELEX技術(shù)，以0 -葡萄糖醛酸苷酶 PGUS-E為篩選靶標(biāo)，從體外合成的隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)5'-AGCAGCACAGAGGTCAGATGNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3, ) %PGUS-E 特異性結(jié)合的核酸適配體；將篩選出的核酸適配體序列用引物Apt-F(5'-AGCAGCACAGAG GTCAGATG-3'）和Apt-R(5' -ITCACGGTAGCACGCATAGG-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增并進(jìn)行TA克隆 與PMD19-T載體（大連寶生物公司），轉(zhuǎn)化ToplO細(xì)菌（北京博邁德生物公司）；通過(guò) PMD19-T載體通用引物M13F(-47) :(5' -CGCCAGGGmTCCCAGTCACGAC-3'）和M13R(-48): (5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3'）進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增篩選陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性克隆菌落培 養(yǎng)后送北京金維智生物公司測(cè)序。
[0011] 通過(guò)測(cè)序獲得的核酸適配體對(duì)P⑶S-E進(jìn)行純化固定化測(cè)定，將生物素修飾的核 苷酸適配體與鏈霉素修飾的磁珠共價(jià)連接，進(jìn)行核苷酸適配體與P⑶S-E的特異性捕捉和 固定化測(cè)定。
【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖1為本發(fā)明所涉及的基于SELEX技術(shù)的核酸適配體的篩選流程圖。
[0013] 圖2為本發(fā)明核酸適配體固定化P⑶S-E的穩(wěn)定性對(duì)比圖。圖中（?)表示Apt5 固定化P⑶S-E，（ )表示Apt9固定化P⑶S-E。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 實(shí)施例1 : 0 -葡萄糖醛酸苷酶P⑶S-E的制備
[0015] 將含有質(zhì)粒pET-28a-GUS/BL21 (DE3)菌株接種于30ml的LB(卡那霉素Kanamycin 50yg/ml)，37 °C過(guò)夜制備種子液，以1/100的接種量轉(zhuǎn)接于500ml的新鮮的LB(卡那霉 素Kanamycin50iig/ml)培養(yǎng)基中，在37°C條件下培養(yǎng)直至0D6(i(i=~0. 6時(shí)，加入異丙 基-1-硫代-D-半乳糖吡喃糖苷（0. 5mM)，16°C條件誘導(dǎo)5小時(shí)。誘導(dǎo)后的菌體4°C， 12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，棄上清收集菌體，菌體重懸于蛋白破碎緩沖液洗滌，4°C， 12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘。最后將菌體重懸于20ml蛋白緩沖液中，冰浴中超聲破碎。 超聲破碎后的菌液4°C，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，收集上清，獲得粗酶液。
[0016] P-葡萄糖醛酸苷酶P⑶S-E的純化。粗酶液利用AKTApurifaction系統(tǒng)進(jìn)行平 衡、裝載，再平衡，然后用蛋白洗脫液洗脫蛋白并收集洗脫液，洗脫蛋白的緩沖液各組分如 下：50mMTris-HCl，300mmol/LNaCl，pH8.0其中咪唑濃度為25mM。將鎳柱洗脫收集的目標(biāo) 蛋白稀釋，鹽離子濃度控制在50mM以下裝載到強(qiáng)陰離子柱SoucerQ200,控制鹽離子濃度 洗脫目標(biāo)