用于控制重組蛋白質(zhì)中c端賴氨酸、半乳糖和唾液酸含量的制造方法
【專利說明】用于控制重組蛋白質(zhì)中C端賴氨酸、半乳糖和唾液酸含量 的制造方法
【背景技術(shù)】
[0001] 通過血液流中的內(nèi)源性循環(huán)羧肽酶（Cai, B等人，"體內(nèi)人免疫球蛋白G2重 鏈的C端賴氨酸處理"，《生物技術(shù)與生物工程》，2011年；108:404-412 (Cai，B. et al., "C-terminal Lysine Processing of Human Immunoglobulin G2 Heavy Chain in Vivo, "Biotechnol. Bioeng. 2011 ; 108:404-412))，C 端賴氨酸（CTL)快速地從注入抗體移 除，包括英利昔單抗，并且因此據(jù)信對(duì)產(chǎn)品安全性和功效具有少量（如果有的話）影響。然 而，具有CTL殘基的重組蛋白質(zhì)中的CTL含量可用作制造一致性和產(chǎn)品均質(zhì)性的量度。
[0002] 相比于CTL含量，重組蛋白質(zhì)中的唾液酸含量已與人的生理重要性的許多現(xiàn)象相 關(guān)聯(lián)。例如，糖蛋白（諸如促紅細(xì)胞生成素）中唾液酸的存在促進(jìn)長(zhǎng)循環(huán)半衰期，而促紅細(xì) 胞生成素中唾液酸的不存在導(dǎo)致蛋白質(zhì)從循環(huán)的快速清除。此外，蛋白質(zhì)中增加的唾液酸 含量可調(diào)節(jié)人的蛋白質(zhì)的免疫原性。由于唾液酸對(duì)產(chǎn)品安全性和功效的重要性，唾液酸含 量應(yīng)保持在反應(yīng)臨床所用范圍的范圍內(nèi)。
[0003] 因此，存在理解并控制處理相關(guān)因數(shù)的需求，這些處理相關(guān)因數(shù)影響重組蛋白質(zhì) (特別是施用給人的重組蛋白質(zhì)，諸如REMICADE ds (英利昔單抗）或HUMIRA? (阿 達(dá)木單抗））中的CTL和唾液酸含量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本文所公開的是用于生產(chǎn)抗體（例如，抗腫瘤壞死因子a (TNFa )抗體，諸如單克 隆抗體cA2(本文也稱為英利昔單抗））的方法，該抗體通過控制培養(yǎng)條件（包括鋅濃度、乙 二胺四乙酸（EDTA)濃度和收獲時(shí)間）具有所需的C端賴氨酸（CTL)含量、唾液酸含量、半 乳糖含量和/或唾液酸對(duì)半乳糖的比率。
[0005] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例是一種用于生產(chǎn)抗體的方法，該抗體具有約20%至約70% 的C端賴氨酸含量和約1 %至約20%的唾液酸含量；所述方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)染有 編碼抗體的DNA的鋅響應(yīng)宿主細(xì)胞，該培養(yǎng)基包含至少0. 5 μ M的鋅；并且控制鋅在培養(yǎng)基 中的濃度，從而生產(chǎn)抗體。在一些實(shí)施例中，抗體的C端賴氨酸含量為約40 %至約70%， 例如約55%至約65%，例如或約60%。在一些實(shí)施例中，抗體的唾液酸含量為約3%至約 14%。在一些實(shí)施例中，抗體具有約50%至約90%或約45%至約85%的半乳糖含量。在 一些實(shí)施例中，抗體具有約0. 05至約0. 20的唾液酸對(duì)半乳糖的比率。
[0006] 在一些實(shí)施例中，抗體為抗TNFa抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗TNFa抗 體或其抗原結(jié)合片段（i)競(jìng)爭(zhēng)地抑制A2(ATCC保藏號(hào)ΡΤΑ-7045)結(jié)合至人TNFa ;和（ii) 以至少IX IO8升/摩爾的親和力結(jié)合至人TNF a的中和表位，測(cè)量為締合常數(shù)（Ka)?？?TNFa抗體或其抗原結(jié)合片段可為例如嵌合抗體、人抗體或人源化抗體。在一些實(shí)施例中， 抗TNFa抗體或其抗原結(jié)合片段可為免疫球蛋白類IgGU IgG2、IgG3、IgG4或IgM，并且在 一些實(shí)施例中，包括IgGl恒定區(qū)域。在一些實(shí)施例中，抗TNF a抗體或其抗原結(jié)合片段選 自 Fab、Fab'、F (ab，）2和 Fv。
[0007] 在一些實(shí)施例中，抗TNFa抗體或其抗原結(jié)合片段包括人恒定區(qū)域和非人可變區(qū) 域，或人恒定區(qū)域和人可變區(qū)域。
[0008] 在一些實(shí)施例中，抗TNF a抗體或其抗原結(jié)合片段包含至少一個(gè)人輕鏈和至少一 個(gè)人重鏈。在一些實(shí)施例中，輕鏈包含A2 (ATCC保藏號(hào)PTA-7045)輕鏈的所有抗原結(jié)合區(qū) 域。在一些實(shí)施例中，重鏈包含A2 (ATCC保藏號(hào)PTA-7045)重鏈的所有抗原結(jié)合區(qū)域。在 其它實(shí)施例中，輕鏈包含A2 (ATCC保藏號(hào)PTA-7045)輕鏈的所有抗原結(jié)合區(qū)域，并且重鏈包 含A2 (ATCC保藏號(hào)PTA-7045)重鏈的所有抗原結(jié)合區(qū)域。
[0009] 在一些實(shí)施例中，抗TNF a抗體或其抗原結(jié)合片段包含IgGl人恒定區(qū)域和非人可 變區(qū)域；該非人可變區(qū)域包含選自SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:5的氨基酸序列，或由選自 SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4的核酸序列進(jìn)行編碼。
[0010] 在一些實(shí)施例中，抗TNFa抗體或其抗原結(jié)合片段具有等同于單克隆抗體CA2的 表位特異性，并且在一些實(shí)施例中，抗TNF a抗體或其抗原結(jié)合片段為單克隆抗體cA2。
[0011] 在一些實(shí)施例中，鋅在培養(yǎng)基中的濃度在約0. 6 μ M至約6. 5 μ M或約0. 6 μ M至約 I. 1 μΜ的范圍內(nèi)。
[0012] 在一些實(shí)施例中，培養(yǎng)基還包含濃度范圍為約2. 5μΜ至約30μΜ或約5μΜ至約 16 μ M的EDTA，并且所述方法還包括控制EDTA在培養(yǎng)基中的濃度。
[0013] 在一些實(shí)施例中，所述方法還包括回收抗體，例如當(dāng)培養(yǎng)基中的鋅響應(yīng)宿主細(xì)胞 達(dá)到約1. 5百萬細(xì)胞/mL至約11百萬細(xì)胞/mL或約3百萬細(xì)胞/mL至約11百萬細(xì)胞/mL 的細(xì)胞密度時(shí)。在一些實(shí)施例中，鋅的濃度被控制，直至抗體被回收，或在鋅響應(yīng)宿主細(xì)胞 的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期期間被控制。
[0014] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，控制鋅的濃度包括監(jiān)測(cè)鋅在培養(yǎng)基中的濃度，和調(diào) 節(jié)鋅在培養(yǎng)基中的濃度，以使得鋅在培養(yǎng)基中的濃度為至少〇. 5 μΜ或在約0. 6 μΜ至約 6. 5 μΜ的范圍內(nèi)。
[0015] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，鋅響應(yīng)宿主細(xì)胞為SP2/0細(xì)胞。
[0016] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是一種用于控制抗體的C端賴氨酸含量的方法，該抗體在 用于在培養(yǎng)基中生物合成抗體的過程中具有約20 %至約70 %的C端賴氨酸含量，所述方法 包括在抗體的生物合成期間監(jiān)測(cè)鋅在培養(yǎng)基中的水平；以及在抗體的生物合成期間調(diào)節(jié)鋅 在培養(yǎng)基中的水平。
[0017] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是一種用于控制抗體的唾液酸含量的方法，該抗體在用于 在培養(yǎng)基中生物合成抗體的過程中具有約1%至約20%的唾液酸含量，所述方法包括在抗 體的生物合成期間監(jiān)測(cè)鋅在培養(yǎng)基中的水平；以及在抗體的生物合成期間調(diào)節(jié)鋅在培養(yǎng)基 中的水平。
[0018] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是一種用于控制抗體的半乳糖含量的方法，該抗體在用于 在培養(yǎng)基中生物合成抗體的過程中具有約50%至約90%的半乳糖含量，所述方法包括在 抗體的生物合成期間監(jiān)測(cè)鋅在培養(yǎng)基中的水平；以及在抗體的生物合成期間調(diào)節(jié)鋅在培養(yǎng) 基中的水平。
[0019] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是一種用于控制抗體中唾液酸對(duì)半乳糖的比率的方法，該 抗體在用于在培養(yǎng)基中生物合成抗體的過程中具有約〇. 05至約0. 20的唾液酸對(duì)半乳糖的 比率，所述方法包括在抗體的生物合成期間監(jiān)測(cè)鋅在培養(yǎng)基中的水平；以及在抗體的生物 合成期間調(diào)節(jié)鋅在培養(yǎng)基中的水平。
[0020] 在一種用于控制CTL、唾液酸或半乳糖含量，或唾液酸對(duì)半乳糖的比率的方法的一 些實(shí)施例中，抗體為抗TNF α抗體或其抗原結(jié)合片段，和/或抗體由SP2/0細(xì)胞生物合成。
[0021] 在一個(gè)實(shí)施例中，抗體為結(jié)合TNF表位的氨基酸的mAb，mAb通過雜交瘤或重組宿 主生產(chǎn)。在一個(gè)實(shí)施例中，抗體為嵌合抗體，該嵌合抗體識(shí)別由A2所識(shí)別的表位。在另一 個(gè)實(shí)施例中，抗體為嵌合抗體，該嵌合抗體命名為嵌合A2 (cA2)(即，英利昔單抗）。
[0022] 制備和使用抗TNF抗體的表征和方法詳細(xì)地公開并描述于例如"抗TNF抗體、組 合物、方法和用途"(George Heavner等人，于2007年7月31日發(fā)布的提交于2001年8月 1日的美國(guó)專利7, 250, 165)和"抗TNF抗體、組合物、方法和用途"（Jill Giles-Komar等 人，提交于2003年3月21日的美國(guó)申請(qǐng)10/394,471，公布1^2004/0185047六1)，以及"重 組A2特異性TNF α特異性抗體"(Junming Le等人，于2007年8月7日發(fā)布的提交于2004 年2月6日的美國(guó)專利7,252, 823)中（所有專利全文以引用的方式并入本文中）。
[0023] 在一些實(shí)施例中，抗體包括鼠科mAb A2(其由命名為C134A的細(xì)胞系生產(chǎn)）和 嵌合抗體cA2(其由命名為cl68A的細(xì)胞系生產(chǎn)）。細(xì)胞系cl34A存儲(chǔ)于賓夕法尼亞 州斯普林豪斯的威爾斯&麥基恩路的楊森研發(fā)公司（Janssen Research&Development ,Welsh&McKean Road，Springhouse，PA)。細(xì)胞系cl68A存儲(chǔ)于賓夕法尼亞州馬爾文的 山谷大道 200 號(hào)楊森研發(fā)公司（Janssen Research&Development, 200 Great Valley Parkway, Malvern, Pennsylvania)(郵編19355)，荷蘭萊頓的楊森生物制劑有限公司 (Janssen Biologies BV, Leiden, The Netherlands)〇
[0024] 本文所公開的方法可用于改善例如商業(yè)制造過程中的分批均質(zhì)性，諸如用于產(chǎn)生 在治療例如人自身免疫性疾病所使用的英利昔單抗、單克隆抗TNFa抗體的制造過程。
【附圖說明】
[0025] 上述內(nèi)容根據(jù)如附圖所示的本發(fā)明實(shí)例實(shí)施例的下述更具體的描述將顯而易見。
[0026] 本專利或?qū)＠暾?qǐng)文件包含至少一張繪制成彩色的附圖。在提出請(qǐng)求并支付必要 的費(fèi)用后，美國(guó)專利和商標(biāo)局將會(huì)提供本專利或?qū)＠暾?qǐng)公開的帶彩圖副本。
[0027] 圖1示出了英利昔單抗的實(shí)例的毛細(xì)管等電聚焦（ClEF)電描記圖。
[0028] 圖2為作為ClEF峰1百分比的函數(shù)映射的反相肽賴氨酸缺乏百分比（缺乏C端 賴氨酸％，縮寫為des-Lys)的擬合線曲線圖，并且示出了 CTL含量（表達(dá)為des-Lys的百 分比）和峰1百分比之間的相關(guān)性。
[0029] 圖3為作為生物反應(yīng)器時(shí)期的函數(shù)的CTL去除（表達(dá)為des-Lys的百分比，并且 根據(jù)峰1數(shù)據(jù)利用cIEF方法進(jìn)行計(jì)算）的圖表，并且示出了改變Zn +2濃度對(duì)CTL去除的影 響。Y軸：desl-Lys% ;X軸：生物反應(yīng)器時(shí)期，單位為天。
[0030] 圖4為作為生物反應(yīng)器時(shí)期的函數(shù)的英利昔單抗低聚糖與唾液酸的百分比的圖 表，如通過WAX方法所確定，并且示出了改變Zn +2濃度對(duì)唾液酸百分比的影響。Y軸：唾液 酸％ ;X軸：生物反應(yīng)器時(shí)期，單位為天。
[0031] 圖5為作為生物反應(yīng)器時(shí)期的函數(shù)的活細(xì)胞密度的圖表，并且示出了改變Zn+2濃 度對(duì)活細(xì)胞密度的影響。Y軸：活細(xì)胞密度（數(shù)百萬活細(xì)胞/mL) ;X軸：生物反應(yīng)器時(shí)期，單 位為天。
[0032] 圖6為作為生物反應(yīng)器時(shí)期的函數(shù)的活細(xì)胞百分比的圖表，并且示出了改變Zn+2 濃度對(duì)培養(yǎng)物存活率的影響。Y軸：活細(xì)胞％ ;X軸：生物反應(yīng)器時(shí)期，單位為天。
[0033] 圖7為作為生物反應(yīng)器時(shí)期的函數(shù)的英利昔單抗?jié)舛鹊膱D表，并且示出了改變 Zn+2濃度對(duì)英利昔單抗?jié)舛鹊挠绊?。所指出的y軸濃度mg/mL包含印刷誤差。濃度為mg/ L。Y軸：英利昔單抗?jié)舛龋╩g/L) ;X軸：生物反應(yīng)器時(shí)期，單位為天。
[0034] 圖8A為作為生物反應(yīng)器時(shí)期的函數(shù)的CTL去除（表達(dá)為des-Lys的百分比，并且 根據(jù)峰1數(shù)據(jù)利用ClEF方法進(jìn)行計(jì)算）的圖表，并且示出了在存在0. 76 μ M的Zn+2 (對(duì)應(yīng) 于標(biāo)簽"Fe:5 Zn: I EDTA: 10"的生物反應(yīng)器中Zn+2的初始濃度為6.3 μΜ，而非0.76 μΜ; 0. 76 μ M的Zn+2的目標(biāo)濃度從第13天實(shí)施直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束）的情況下改變EDTA濃度對(duì)CTL 去除的影響。Y軸：desl-Lys% ;Χ軸：生物反應(yīng)器時(shí)期，單位為天。
[0035] 圖8Β為作為生物反應(yīng)器時(shí)期的函數(shù)的CTL去除（表達(dá)為des-Lys的百分比，并且 根據(jù)峰1數(shù)據(jù)利用ClEF方法進(jìn)行計(jì)算）的圖表，并且示出了在存在1. 7 μΜ的Zn+2的情況 下改變?chǔ)?ΤΑ濃度對(duì)CTL去除的影響。Y軸：desl-Lys% ;Χ軸：生物反應(yīng)器時(shí)期，單位為天。
[0036] 圖9Α為作為生物反應(yīng)器時(shí)期的函數(shù)的英利昔單抗低聚糖與唾液酸的百分比的圖 表，如通過WAX方法所測(cè)定，并且示出了在存在0. 76μΜ的Ζη+2(對(duì)應(yīng)于標(biāo)簽"Fe:5 Ζη:1 EDTA: 10"的生物反應(yīng)器中Zn+2的初始濃度為6. 3 μΜ，而非0. 76 μΜ ;0. 76 μΜ的Zn +2的目 標(biāo)濃度從第13天實(shí)施直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束）的情況下改變EDTA濃度對(duì)唾液酸百分比的影響。Y 軸：唾液酸％ ;χ軸：生物反應(yīng)器時(shí)期，單位為天。
[0037] 圖9Β為作為生物反應(yīng)器時(shí)期的函數(shù)的英利昔單抗低聚糖與唾液酸的百分比的圖 表，如通過WAX方法所測(cè)定，并且示出了在存在1. 7 μ M的Zn+2的情況下改變EDTA濃度對(duì)唾 液酸含量的影響。Y軸：唾液酸％ ;Χ軸：生物反應(yīng)器時(shí)期，單位為天。
[0038] 圖9C為作為生物反應(yīng)器時(shí)期的函數(shù)的GOF(WAX組分1)的百分比的圖表，并且示 出了在存在〇. 76 μ M的Zn+2 (對(duì)應(yīng)于標(biāo)簽"Fe: 5 Zn: IEDTA: 10 "的生物反應(yīng)器中Zn+2的初始 濃度為6. 3 μ M，而非0. 76 μ M ;0. 76 μ M的Zn+2的目標(biāo)濃度從第13天實(shí)施直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束） 的情況下改變?chǔ)?ΤΑ濃度對(duì)非半乳糖基物質(zhì)的影響。
[0039] 圖9D為作為生物反應(yīng)器時(shí)期的函數(shù)的GOF(WAX組分1)的百分比的圖表，并且示 出了在存在1. 7 μ M的Zn+2的情況下改變EDTA濃度對(duì)非半乳糖基物質(zhì)的影響。
[0040] 圖10為作為生物反應(yīng)器時(shí)期的活細(xì)胞密度的圖表，并且示出了在存在0. 76 μΜ的 Zn+2或L 7 μΜ的Zn +2(對(duì)應(yīng)于標(biāo)簽"Fe:5 Zn: I EDTA: 10"的生物反應(yīng)器中Zn+2的初始濃度 為6. 3 μ M，而非0. 76 μ M ;0. 76 μ M的Zn+2的目標(biāo)濃度從第13天實(shí)施直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束）的情 況下改變?chǔ)?ΤΑ濃度對(duì)活細(xì)胞密度的影響。Y軸：活細(xì)胞密度（數(shù)百萬活細(xì)胞/mL) ;Χ軸：生 物反應(yīng)器時(shí)期，單位為天。
[0041] 圖IlA為作為生物反應(yīng)器時(shí)期的活細(xì)胞百分比的圖表，并且示出了在存在 0· 76 μΜ的Zn+2或L 7 μΜ的Zn +2(對(duì)應(yīng)于標(biāo)簽"Fe:5 Zn: I EDTA: 10"的生物反應(yīng)器中Zn+2 的初始濃度為6. 3 μ M，而非0. 76 μ M ;0. 76 μ M的Zn+2的目標(biāo)濃度從第13天實(shí)施直至實(shí)驗(yàn) 結(jié)束）的情況下改變?chǔ)?ΤΑ濃度對(duì)培養(yǎng)物存活率的影響。Y軸：活細(xì)胞％ ;Χ軸：生物反應(yīng)器 時(shí)期，單位為天。
[0042] 圖IlB為圖IlA所示圖表的第0-25天的放大圖。Y軸：活細(xì)胞密度（數(shù)百萬活細(xì) 胞/mL) ;Χ軸：生物反應(yīng)器時(shí)期，單位為天。
[0043] 圖12A為作為生物反應(yīng)器時(shí)期的英利昔單抗?jié)舛鹊膱D表，并且示出了在存在 0· 76μΜ的Zn+2或L 7μΜ的Zn+2(對(duì)應(yīng)于標(biāo)簽"Fe:5 Zn:lEDTA:10"的生物反應(yīng)器中Zn+2 的初始濃度為6. 3 μ M，而非0. 76 μ M ;0. 76 μ M的Zn+2的目標(biāo)濃度從第13天實(shí)施直至實(shí)驗(yàn) 結(jié)束）的情況下改變?chǔ)?ΤΑ濃度對(duì)英利昔單抗?jié)舛鹊挠绊?。所指出的y軸濃度mg/mL包含 印刷誤差。濃度為mg/L。Y軸：英利昔單抗?jié)舛龋╩g/L) ;X軸：生物反應(yīng)器時(shí)期，單位為天。
[0044] 圖12B為圖12A所示圖表的第0-25天的放大圖。所指出的y軸濃度mg/mL包含 印刷誤差。濃度為mg/L。Y軸：英利昔單抗?jié)舛龋╩g/L) ;X軸：生物反應(yīng)器時(shí)期，單位為天。
[0045] 圖13A為作為生物反應(yīng)器時(shí)期的函數(shù)的CTL去除（表達(dá)為des-Lys的百分比，并 且根據(jù)峰1數(shù)據(jù)利用ClEF方法進(jìn)行計(jì)算）的圖表；并且示出了改變EDTA濃度（μ M)對(duì)CTL 去除的影響（結(jié)果表示為兩個(gè)重復(fù)生物反應(yīng)器的平均值）。Y軸：desl-LyS%;X軸：生物反 應(yīng)器時(shí)期，單位為天。
[0046] 圖13B為作為生物反應(yīng)器時(shí)期的函數(shù)的英利昔單抗低聚糖與唾液酸的百分比的 圖表，如通過WAX方法所測(cè)定；并且示出了改變EDTA濃度（μ M)對(duì)唾液酸含量的影響（結(jié) 果表示為兩個(gè)重復(fù)生物反應(yīng)器的平均值）。Y軸：唾液酸％ ;Χ軸：生物反應(yīng)器時(shí)期，單位為 天。
[0047] 圖13C為作為生物反應(yīng)器時(shí)期的函數(shù)的活細(xì)胞密度的圖表；并且示出了改變EDTA 濃度（μ Μ)對(duì)活細(xì)胞密度的影響。Y軸：活細(xì)胞密度（數(shù)百萬活細(xì)胞/mL) ;Χ軸：生物反應(yīng) 器時(shí)期，單位為天。
[0048] 圖13D為作為生物反應(yīng)器時(shí)期的函數(shù)的活細(xì)胞百分比的圖表；并且示出了改變 EDTA濃度（μΜ)對(duì)培養(yǎng)物存活率的影響。Y軸：活細(xì)胞％ ;Χ軸：生物反應(yīng)器時(shí)期，單位為 天。
[0049] 圖13Ε為作為生物反應(yīng)器時(shí)期的函數(shù)的英利昔單抗?jié)舛鹊膱D表；并且示出了改變 EDTA濃度（μΜ)對(duì)英利昔單抗?jié)舛鹊挠绊?。所指出的y軸濃度mg/mL包含印刷誤差。濃度 為mg/L。Y軸：英利昔單抗?jié)舛龋╩g/L) ;X軸：生物反應(yīng)器時(shí)期，單位為天。
[0050] 圖13F為圖13E所示圖表的第0-25天的放大圖。所指出的y軸濃度mg/mL包含 印刷誤差。濃度為mg/L。Y軸：英利昔單抗?jié)舛龋╩g/L) ;X軸：生物反應(yīng)器時(shí)期，單位為天。
[0051] 圖13G為作為生物反應(yīng)器時(shí)期的函數(shù)的G0F(WAX組分1)的百分比的圖表，并且示 出