呼吸道合胞病毒半活疫苗的制作方法
【專利說明】呼吸道合胞病毒半活疫苗 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及呼吸道合胞病毒（RSV)半活疫苗，其包含表達(dá)嵌合RSV/SeV F蛋白的 基因組復(fù)制缺陷型仙臺病毒（SeV)載體。此外，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明的基因組復(fù)制 缺陷型SeV載體的方法，及其在RSV感染和RSV感染相關(guān)疾病的治療中的用途。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 現(xiàn)今使用的許多病毒疫苗（包括麻疹疫苗和一些流感疫苗）基于減毒病毒，并產(chǎn) 生良好和長效的預(yù)防性體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答（Amanna等人，N. Engl. J. Med. 357:1903-1915， 2007)。這樣的減毒活疫苗通過降低所使用病毒的毒力但仍使其保持存活（或"活的"）進(jìn) 行制備。
[0004] 然而，活疫苗的安全不斷被討論，因為它們還與遺傳不穩(wěn)定性和殘留毒力相關(guān) (Ehrenfeld 等人，Expert. Rev. Vaccines 8:899-905, 2009)。如對于 Sabin 脊髓灰質(zhì)炎疫苗 所見的減毒突變的可能逆轉(zhuǎn)（Salk，D.和 Salk，J.，Vaccine 2:59-74,1984 ;1(6￥等人，4]11111· Rev. Microbiol. 59:587-635,2005)，或者尋找減毒的正確平衡（其例如使減毒呼吸道合胞 病毒（RSV)活疫苗的開發(fā)復(fù)雜化（Luongo等人，Vaccines 27:5667-5676, 2009))，例證了活 疫苗的缺陷。
[0005] 考慮到使用活疫苗存在的局限性，病毒載體已作為有力和確定的方法出現(xiàn)，具有 與減毒活疫苗相似的免疫原性特征（Abdulhaqq等人，Immunol. Res. 42:219-232,2008 ; Liniger 等人，Vaccine 27:3299-3305, 2009 ;Zhan 等人，Vaccine 26:3480-3488, 2008 ; Slobod等人，Vaccine 22:3182-3186,2004)。然而，減毒活病毒載體通常面臨與長期使用 的減毒活疫苗相似的安全性擔(dān)憂。
[0006] 在過去受到疫苗開發(fā)者顯著關(guān)注的病毒組是非節(jié)段負(fù)鏈RNA病毒（NNSV)組。這 些病毒具有非常期望的安全特征譜，因為它們含有RNA基因組且僅在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì) 中復(fù)制，從而排除整合到宿主基因組內(nèi)以引起插入誘變的任何可能性。此外，尚未觀察到 重組事件（Bukreyev等人，J. Virol. 80:10293-10306, 2006)。NNSV包含四個科，其中彈狀 病毒科（Rhabdoviridae)(例如水痕性口炎病毒（VSV)和狂犬病病毒（RV))和副粘病毒 科（Paramyxoviridae)(例如仙臺病毒（SeV)和人副流感病毒（hPIV))的成員已優(yōu)先用 于開發(fā)候選病毒載體疫苗（Schmidt等人，J. Virol. 75:4594-4603, 2001 ;Bukreyev等人， J. Virol. 80:10293-10306,2006)〇
[0007] 使用NNSV作為疫苗主鏈，已開發(fā)了各種病毒疫苗載體候選物。例如，通過將人副 流感病毒2型（hPIV2)的HN和F蛋白（其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域替換為人副流感病毒3型（hPIV3) 的相應(yīng)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域）摻入基于hPIV3的病毒載體內(nèi)，來產(chǎn)生hPIV2/hPIV3病毒疫苗載體 (Tao等人，J. Virol. 74:6448-6458, 2000)。此外，描述了牛/人減毒PIV3疫苗載體，其在牛 PIV3(bPIV3)主鏈中表達(dá) hPIV3 的 F 蛋白（Haller 等人，J. Virol. 74:11626-35, 2000)。還 已知的是表達(dá)人PIV3的F和NH蛋白以及人RSV的全長天然F蛋白的基于牛PIV3的疫苗 候選物，其被發(fā)現(xiàn)在非洲綠猴中保護(hù)不受RSV感染（Tang等人，J. Virol. 79:11198-11207， 2004)〇
[0008] 本領(lǐng)域已知的另一種候選病毒載體疫苗基于基因復(fù)制缺陷型仙臺病毒（SeV) (Wiegand 等人，J.Virol.81:13835-13844,2007;W0 2006/084746A1)。如最近所顯示的， 這種載體還能夠在體外表達(dá)基因（Bossow等人，Open Virol. J.6:73-81，2012)。然而，關(guān) 于其復(fù)制缺陷性質(zhì)和遺傳穩(wěn)定性，基于復(fù)制缺陷型SeV的病毒疫苗載體的體內(nèi)安全仍有待 證明。此外，由于其復(fù)制缺陷，體外基因表達(dá)相較于有復(fù)制能力的仙臺載體的表達(dá)是降低的 (Bossow等人，Open Virol. J. 6:73-81，2012)。因此，重組改造以在體內(nèi)導(dǎo)致期望的有效體 液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答的方式有效表達(dá)和展示所選免疫原性肽或蛋白質(zhì)至免疫系統(tǒng)的復(fù) 制缺陷型仙臺載體是有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。
[0009] -種公知的但難以治療的致病性病毒是呼吸道合胞病毒（RSV)。RSV是全世界 幼兒和老年人中嚴(yán)重呼吸性疾病的主因 （Collins P.L.和Crowe J.E.Jr，Respiratory syncytial virus and metapneumovirus,in:Fields Virology, Eds.Knipe D.M.and Howley P., Philadelphia:Lippincott-ffi 11 iams and Wilkins, ffolters Kluwer Business, 2007:1601-1646)。RSV還是慢性阻塞性肺疾?。–OPD)患者中的主要病原體 (Hacking，D.和 Hull，J.，J. Infect. 45:18-24,2002)。然而，盡管近期進(jìn)行了顯著的 RSV 疫 苗開發(fā)努力，但現(xiàn)今仍無法獲得針對該病原體的疫苗。
[0010] 因此，仍存在對于可有效用于治療患有RSV感染和RSV感染相關(guān)疾病的患者特別 是兒童和老年人的安全RSV疫苗的迫切需要。
[0011] 發(fā)明概沐
[0012] 本發(fā)明通過提供表達(dá)嵌合RSV/SeV F(融合）蛋白或包含胞外域和跨膜結(jié)構(gòu)域的 RSV F蛋白的基因組復(fù)制缺陷型仙臺病毒（SeV)載體（在下文中被稱為"本發(fā)明的基因組 復(fù)制缺陷型SeV載體"或"本發(fā)明的rdSeV載體"）而實現(xiàn)了上文提出的需要。本發(fā)明的 rdSeV載體可以有效地大量產(chǎn)生，并且引發(fā)針對RSV的強(qiáng)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，同時是安全 的。它因此非常適合用作"半活" RSV疫苗，即，格外有效（類似"活疫苗"）且還是特別安 全（類似"死疫苗"）的疫苗。
[0013] 在第一個方面，本發(fā)明提供了包含核酸的基因組復(fù)制缺陷型仙臺病毒（SeV)載 體，所述核酸在磷蛋白（P)基因中被修飾以編碼缺乏氨基酸2-77的突變P蛋白，其中所述 核酸還編碼嵌合F蛋白，其包含呼吸道合胞病毒（RSV) F胞外域或其免疫原性片段或突變 體、RSV F跨膜結(jié)構(gòu)域或其功能性片段或突變體、以及SeV F胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域或其任何片段或突 變體（在下文的"嵌合F蛋白"或"嵌合RSV/SeV蛋白"中），或者其中所述核酸編碼F蛋白， 其包含RSV F胞外域或其免疫原性片段或突變體以及RSV F跨膜結(jié)構(gòu)域或其功能性片段或 突變體（在下文的"RSV F蛋白"中）。
[0014] 在另一個方面，本發(fā)明提供了宿主細(xì)胞，其包含本發(fā)明的基因組復(fù)制缺陷型仙臺 病毒（SeV)載體、本發(fā)明的基因組復(fù)制缺陷型SeV載體的核酸或其互補(bǔ)體、和/或編碼本發(fā) 明的基因組復(fù)制缺陷型SeV載體的核酸或編碼該核酸的互補(bǔ)體的DNA分子。
[0015] 在本發(fā)明的其它方面，提供了用于產(chǎn)生本發(fā)明的基因組復(fù)制缺陷型仙臺病毒 (SeV)載體的方法，其包括（i)培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞，和（ii)從細(xì)胞培養(yǎng)物中收集基因組 復(fù)制缺陷型SeV載體。
[0016] 根據(jù)另一個方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的基因組復(fù)制缺陷型仙臺病毒（SeV) 載體和一種或多種藥學(xué)可接受的載體的疫苗。
[0017] 在另外一個方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的基因組復(fù)制缺陷型仙臺病毒（SeV)載體在 治療哺乳動物中的RSV感染或RSV感染相關(guān)疾病中的用途，所述哺乳動物特別是人受試者， 更特別是人類嬰兒或兒童、老年人、人免疫妥協(xié)的個體、移植接受者或患有慢性疾病的個 體。
[0018] 本發(fā)明的優(yōu)選實施方案示于所附從屬權(quán)利要求中。
[0019] 附圖簡沐
[0020] 當(dāng)與附圖結(jié)合閱讀時，前述概述以及下述詳述和實施例將得到更好理解。
[0021] 圖1是顯示本發(fā)明的表達(dá)嵌合RSV/SeV F蛋白的基因組復(fù)制缺陷型SeV載體（指 定為"rdSeV-FRSV/&v"載體）的基因組結(jié)構(gòu)的圖示。SeV F的胞外域和跨膜結(jié)構(gòu)域被替換為 其相應(yīng)的RSV衍生的對應(yīng)物，從而導(dǎo)致下述嵌合F( "FAini2"）蛋白：RSV胞外域（"ecto"； RSV F的氨基酸1-524)、RSV跨膜結(jié)構(gòu)域（"tm";RSV F的氨基酸525-550)和SeV胞質(zhì)結(jié)構(gòu) 域（"cyt〇";SeV F的氨基酸524-565)。在"PJ'ORF中，前76個氨基酸被刪除（ΡΔ 2-77) 以獲得復(fù)制缺陷型疫苗載體。
[0022] 圖2是顯示本發(fā)明的基因組復(fù)制缺陷型SeV載體的變體（指定為"rdSeV-FRSV/ SeV-ACT"）的基因組結(jié)構(gòu)的圖示。該變體等同于圖1中所示的rdSeV-FRSV/&v，但缺乏整個胞 質(zhì)結(jié)構(gòu)域，除了 N末端前兩個氨基酸（SeV F的氨基酸524-525)以外。在"P^/'ORF中，前 76個氨基酸被刪除（ΡΔ 2-77)以獲得復(fù)制缺陷型疫苗載體。
[0023] 圖3是顯示比較基因組復(fù)制缺陷型SeV載體（指定為"rdSeV-sFRSV"）的基因組結(jié) 構(gòu)的圖示，所述載體表達(dá)RSV的可溶性F(sF)蛋白。RSV F胞外域的0RF(RSV F的氨基酸 1-524)作為另外的轉(zhuǎn)錄單位（"sFRSV"）插入P基因的下游。在"P^u/'ORF中，前76個氨基 酸被刪除（PA 2-77)以獲得復(fù)制缺陷型疫苗載體。
[0024] 圖4是顯示本發(fā)明的基因組復(fù)制缺陷型SeV載體（rdSeV-FRSV/SeV)的生產(chǎn)效率的 條形圖。rdSeV-F RSV/SeV載體在由表達(dá)質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的VPN細(xì)胞中產(chǎn)生，所述表達(dá)質(zhì)粒含有 編碼SeV P和N蛋白的基因。兩種載體在不同傳代水平（"P"）上的不同生產(chǎn)運行以比 較（P1-1、P1-2、P2-1、P2-2、P3-1)進(jìn)行，并且在生產(chǎn)期間的不同時間點，例如在第8-11天 ("d8-ll"）、第11-12天（"dll-12"）等等，獲得來自細(xì)胞培養(yǎng)上清液的樣品。隨后測定 所獲得的樣品的載體滴度（pfu/ml)。
[0025] 圖5是顯示rdSeV-FRSV/SeV(黑色條）及其變體（白色條）的