一種dpyd*9b基因多態(tài)性的引物及其檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[00011本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種DPYD*9B基因多態(tài)性的引物及其檢 測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]二氫啼啶脫氫酶（dihydropyrimidinedehydrogenase，DPD)編碼基因是位于 1 號(hào) 人類染色體的短臂上（lq22)，基因全長(zhǎng)約150kb，含有3kb的編碼序列，其由23個(gè)外顯子構(gòu) 成，長(zhǎng)度從69bp到1404bp，基因中內(nèi)含子由長(zhǎng)短不等的序列組成。二氫嘧啶脫氫酶是作用于 5-FU藥物代謝途徑的關(guān)鍵酶之一，是分解代謝的限速酶，其含量的高低決定了5-FU藥物的 代謝速度，進(jìn)而影響體內(nèi)藥物的毒性和療效。
[0003] 5-Fu及其前體藥物卡培他濱廣泛用于腫瘤化療，80%以上的5-Fu及其前體藥物是 通過DH)代謝降解為無活性代謝物二氫氟尿嘧啶(FUH2)而失活。不同個(gè)體間DPD酶活性存在 明顯差別，導(dǎo)致藥物清除率、腫瘤的反應(yīng)性及患者的毒性反應(yīng)存在明顯的個(gè)體差異性。
[0004] DPYD突變會(huì)影響Dro酶活性的改變，中國(guó)北方人群的研究發(fā)現(xiàn)DPYD*9(外顯子2， T85C)的突變頻率較高（11.25%)。因此，檢測(cè)DPYD基因多態(tài)性可以對(duì)腫瘤患者進(jìn)行藥物敏感 指導(dǎo)，提高治療效果，降低藥物的毒副作用。
[0005] 中國(guó)專利CN102146440B公開了一種甄別DPYD基因*9A突變位點(diǎn)的PCR檢測(cè)試劑盒， 所述試劑盒主要包括特異性引物、EvaGreen熒光染料、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物 和DNA聚合酶。該實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法可以實(shí)現(xiàn)二氫嘧啶脫氫酶基因*9A突變位點(diǎn)快速、準(zhǔn) 確、特異分析。但是，但其高居不下的假陽性率為實(shí)際應(yīng)用所詬病，而且該檢測(cè)方法還存在 檢測(cè)通量少，每次只能檢測(cè)一種突變類型的缺陷，不能滿足實(shí)際應(yīng)用的需要。
[0006] 中國(guó)專利CN102952866B公開了一種DPYD基因多態(tài)性檢測(cè)特異性引物和液相芯片， 該液相芯片包括野生型和突變型ASPE引物，每種ASPE引物由5 '端的tag序列和3 '端針對(duì)目 的基因多態(tài)性位點(diǎn)的特異性引物序列組成。該液相芯片可用于并行或單項(xiàng)檢測(cè)DPYD基因三 種常見基因型G55A、G141A和G134T的野生型和突變型。但是，上述檢測(cè)方法操作復(fù)雜，不利 于大規(guī)模的推廣和應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明提供一種DPYD*9B基因多態(tài)性的引物及 其檢測(cè)方法，該引物主要用于檢測(cè)DPYD基因的DPYD*9B( c. 2846A>T)位點(diǎn)，具有特異性強(qiáng)、檢 測(cè)靈敏度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，為DPYD*9B基因多態(tài)性提供了 一種簡(jiǎn)單有效的檢測(cè)方法。
[0008] 本發(fā)明提供了一種DPYD*9B基因多態(tài)性的引物，包括PCR擴(kuò)增引物和SNaPshotPCR 引物;所述PCR擴(kuò)增引物為：針對(duì)DPYD*9B的上游引物5 ' -GCTTGCTAAGTAATTCAGTGGCTAT-3 ' (SEQIDN0.1)和下游引物5'-AGCATTCTAATTCCAGCAGGATTC-3'（SEQIDN0.2);所述 SNaPshotPCR弓I物為：針對(duì)DPYD*9B的SNaPshotPCR弓|物5'_ ttttttttttttttttttttttttgagcaagttgtggctatgattg_ 3'（SEq IDN〇.3)。
[0009]另外，本發(fā)明還提供了一種DPYD*9B基因多態(tài)性的檢測(cè)方法，包括如下步驟： S1提取DNA樣品； S2以步驟S1提取的DNA樣本為模板，采用權(quán)利要求1中所述的PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化； S3以步驟S2純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，采用權(quán)利要求1中所述的SNaPshotPCR引物 進(jìn)行SNaPshotPCR擴(kuò)增，并對(duì)SNaPshotPCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化； S4采用毛細(xì)管電泳技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，確定SNP位點(diǎn)及其基因型。
[0010]進(jìn)一步地，所述步驟S1中的DNA樣品為EDTA抗凝外周血的DNA樣品。
[0011] 進(jìn)一步地，所述步驟S2中的多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件包括:階段1:98°C3min;階段2: 98°C10s;階段3:58°C30s;階段4:72°Clmin;階段5:返回到階段2,29個(gè)循環(huán);階段6:72°C 5min;階段7:25°C保溫。
[0012]進(jìn)一步地，所述步驟S3中的SNaPshotPCR擴(kuò)增反應(yīng)條件包括:階段1:96°C10s;階 段2:55°C5s;階段3:60°C30s;階段4:返回到階段1，25個(gè)循環(huán);階段5:4°C保溫。
[0013]進(jìn)一步地，所述步驟S4中采用GENEMAPPERID V4.1軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。
[00M]除此之外，本發(fā)明提供的所述的DPYD*9B基因多態(tài)性的引物在制備檢測(cè)DPYD*9B基 因多態(tài)性試劑中的用途。
[0015]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的技術(shù)方案具有以下優(yōu)勢(shì):本發(fā)明提供的DPYD*9B基 因多態(tài)性的引物具有特異性好，不會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)，準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了DPYD*9B基因 多態(tài)性的檢測(cè)，可以對(duì)腫瘤患者進(jìn)行有效的藥物敏感指導(dǎo)，提高藥物的清除率、腫瘤的反應(yīng) 性及患者的毒性反應(yīng)，為實(shí)現(xiàn)腫瘤患者個(gè)體化治療提供了依據(jù)，更有利于腫瘤患者的康復(fù)。
【附圖說明】
[0016]圖1為本發(fā)明提供的DPYD*9B基因引物的擴(kuò)增片段； 圖2為本發(fā)明提供的DPYD*9B基因引物擴(kuò)增產(chǎn)物的部分測(cè)序圖； 圖3為本發(fā)明提供的DPYD*9B基因SNaPshotPCR引物的檢測(cè)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0018]實(shí)施例一、引物 本發(fā)明提供的DPYD*9B基因引物如表1所示，包括PCR擴(kuò)增引物和SNaPshotPCR引物，所 述PCR擴(kuò)增引物和SNaPshotPCR引物是相對(duì)應(yīng)的。本發(fā)明提供的所有引物序列均通過UCSC 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，無已知SNP位點(diǎn)。
[0019]表1本發(fā)明提供的引物
實(shí)施例二、引物的特異性 將本發(fā)明提供的引物于UCSC中進(jìn)行Blasting，結(jié)果如下： 1)DPYD*9B基因特異引物于UCSC中進(jìn)行Blast，所有引物的擴(kuò)增片段均覆蓋了相應(yīng)的檢 測(cè)位點(diǎn)，無其它同源基因，DPYD*9B基因擴(kuò)增片段位于chrl: 97547858-97548057,長(zhǎng)度為 200bp，擴(kuò)增序列圖如圖1。
[0020] 2)使用表1中PCR擴(kuò)增引物分別對(duì)檢測(cè)樣本進(jìn)行擴(kuò)增及Sanger測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如圖 2所示，各引物擴(kuò)增序列與DPYD*9B基因參考序列吻合。
[0021] 3)使用表1中S