一種同時(shí)檢測(cè)il28b和itpa基因多態(tài)性的引物及其方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種同時(shí)檢測(cè)IL28B和口 ΡΑ基因多態(tài)性 的引物及其方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 丙型病毒性肝炎，簡(jiǎn)稱為丙型肝炎，是一種由丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus, HCV)感染引起的病毒性肝炎，主要通過(guò)血液傳播。由于大部分感染丙肝病毒的患者在感染 的急性期無(wú)明顯癥狀，因此常常被人們忽視，一般待丙型肝炎轉(zhuǎn)化為慢性丙型肝炎或肝硬 化等頑固疾病時(shí)才有所察覺(jué)，運(yùn)樣往往會(huì)錯(cuò)過(guò)丙型肝炎的最佳治療期。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng) 計(jì)，全球約有1.4-1.7億HCV感染者，我國(guó)HCV感染率約為3.2%，約有3800萬(wàn)HCV感染者，而且 每年呈上升的趨勢(shì)，嚴(yán)重危害人類的健康。
[0003] 2009年，杜克大學(xué)的Ge等在《自然》上發(fā)表了一篇與HCV感染相關(guān)的全基因組相關(guān) 性(genomewide association study,GWAS)研究論著，報(bào)道了IL28B基因位于第19號(hào)染色體 短臂（19ql3)，其編碼干擾素 A3(IL28B)上游約3化附近的單核巧酸多態(tài)性rsl2979860與聚 已二醇干擾素、利己韋林聯(lián)合治療的效果顯著相關(guān)。在1型HCV感染者中，C/C基因型患者的 SVR是CA和ΤΛ型患者的兩倍。C/C基因型在人群中的分布呈現(xiàn)明顯的種族差異，在黃色人 種中占90%、在白色人種中占51%、在黑色人種中占13%js8099917與標(biāo)準(zhǔn)療法的NVR最為相 關(guān)。在1型HCV感染者中，G/G基因型患者對(duì)標(biāo)準(zhǔn)治療方案的失敗率是G/T或T/T型患者的2倍。 杜克大學(xué)的同一研究組在發(fā)現(xiàn)IL28B基因型具有預(yù)測(cè)抗病毒治療應(yīng)答的基礎(chǔ)上，通過(guò) 6胖八5研究發(fā)現(xiàn)，肌巧腺巧^憐酸酶（;[]1〇3；[]1日日(1日]1〇3；[]10化;[地日1日3日，口?4)基因變異可緩解 RBV引起的溶血性貧血，如rsll27354AA和rs7270101CC基因型均為貧血的保護(hù)性因子。因 此，通過(guò)檢測(cè)IL28B和口PA基因多態(tài)性有利于預(yù)測(cè)HCV患者的療效。
[0004] 中國(guó)專利申請(qǐng)201510007333.1公開(kāi)了基于實(shí)時(shí)巧光PCR的IL28B基因多態(tài)性檢測(cè) 試劑盒，所述試劑盒包括IL28B rs8099917型PCR反應(yīng)液、IL28B rsl2979860型PCR反應(yīng)液， 其通過(guò)提取DNA，加入到基于實(shí)時(shí)巧光PCR的IL28B SNP檢測(cè)試劑盒的反應(yīng)液中，利用實(shí)時(shí)巧 光PCR儀進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)巧光擴(kuò)增曲線來(lái)判讀位點(diǎn)突變類型。
[000引中國(guó)專利申請(qǐng) 201210353290.9 公開(kāi)了檢測(cè) IL28B(rs8099917)和 ITPA (rsl 127354)的突變的方法，其多態(tài)性檢測(cè)用探針包含P1或ΡΓ的寡核巧酸、P2或P2'的寡核 巧酸W及P3或P3 '的寡核巧酸，其是通過(guò)將探針進(jìn)行PCR擴(kuò)增后進(jìn)行Tm分析，對(duì)IL28B基因 多態(tài)性的rs8099917和口PA基因多態(tài)性的rsll27354進(jìn)行分型。
[0006] 雖然目前的檢測(cè)方法可W對(duì)IL28B和口 PA進(jìn)行分型，但是上述方法存在檢測(cè)結(jié)果 誤差較大，重復(fù)性較低，而且結(jié)果判斷較復(fù)雜的缺陷。因此，研究和開(kāi)發(fā)出一種操作簡(jiǎn)單，檢 測(cè)結(jié)果誤差小，結(jié)果重復(fù)性高的IL28B基因和口 PA基因的檢測(cè)方法仍是目前研究的熱點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明提供一種同時(shí)檢測(cè)IL28B和ITPA基因多 態(tài)性的引物及其方法，該引物主要用于檢測(cè)IL28B_rs8099917、IL28B_rsl2979860、ITPA_ rs7270101、和ITPA_rsll27354四個(gè)位點(diǎn)，具有特異性好、靈敏度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，為 IL28B和口 PA基因多態(tài)性提供了一種簡(jiǎn)單有效的檢測(cè)方法。
[000引本發(fā)明提供了 一種同時(shí)檢測(cè)IL28B和ITPA基因多態(tài)性的引物，包括PCR擴(kuò)增引物和 SNaPshot PCR引物；所述PCR擴(kuò)增引物包括：針對(duì)IL28B9917的上游引物5 ' -AGTAAGTCTTGTATTTCACCTCCTG-3'（SEQ ID NO. 1)和下游弓| 物5'-AAAGCCAGCTACCAAACTGTAT-3 '（ SEQ ID NO . 2)，針對(duì)IL28B9860的上游引物5 ' -61^6了60：了61^6了6了4(：1'-3'（沈9 10側(cè).3)和下游引物5'-1^46661^441^4〔4644666-3'（沈9 10側(cè).4)，針對(duì)口口4的上游引物5'-66464了666〔46〔46467^-3'（沈9 10側(cè).5)和下游引物 5'-CAGGTCACAGGAAGACAGAGA-3'（SEQIDN0.6);所述SNaPshotPCR引物包括：針對(duì) IL28B9917的SNaPshotPCR引物5'-CATGGTTCCAATTTGGGTGA-3'（SEQIDN0.7)，針對(duì) IL28B9860的SNaPshot PCR引物5 ' - AAAAAAAAAAAAAATGCGGAGTGCAATTCAACCCTGGTTC-3 ' (SEQ ID N0.8)，針對(duì)ITPA0101的SNaPshot PCR 弓| 物 5'-AAAAAAAAAAAAGATCGATCGAGAAATCCAACCATCTTTTAAAAA-3'（沈Q ID ^.9)，針對(duì)口口47354的 SfePshot PCR 引物5 ' - AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATATTTTCTGTGCCACCAAAGTGCAT G-3'（沈Q ID N0.10)。
[0009] 進(jìn)一步地，所述PCR擴(kuò)增引物中IL28B9917、IL28B9860和口 PA的引物濃度比為1:1: 1，所述測(cè)aPshot PCR引物中IL28B9917、IL28B9860、ITPA0101 和ITPA7354的引物濃度比為 1:1:1:1。
[0010] 另外，本發(fā)明提供了 一種同時(shí)檢測(cè)IL28B和ITPA基因多態(tài)性的方法，包括如下步 驟： S1提取DNA樣品； S2W步驟S1提取的DNA樣本為模板，采用權(quán)利要求1中所述的PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行多重PCR 擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化； S3W步驟S2純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，采用權(quán)利要求1中所述的SNaPshot PCR引物 進(jìn)行SNaPshot PCR擴(kuò)增，并對(duì)SNaPshot PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化； S4采用毛細(xì)管電泳技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，確定SNP位點(diǎn)及其基因型。
[0011] 進(jìn)一步地，所述步驟S1中的DNA樣品為邸TA抗凝外周血的DNA樣品。
[0012] 進(jìn)一步地，所述步驟S2中的多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件包括:階段1:98°C 3min;階段2: 98°C 10s;階段3:58°C 30s;階段4:72°C Imin;階段5:返回到階段2,29個(gè)循環(huán);階段6:72°C 5min;階段7:25°C保溫。
[0013] 進(jìn)一步地，所述步驟S3中的挪aPshot PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件包括:階段1:96°C 10s;階 段2:55°C 5s;階段3:60°C 30s;階段4:返回到階段1，25個(gè)循環(huán);階段5:4°C保溫。
[0014] 進(jìn)一步地，所述步驟S4中采用GE肥MAPP邸ID V4.1軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。
[0015] 除此之外，本發(fā)明提供的同時(shí)檢測(cè)IL28B和ITPA基因多態(tài)性的引物在制備檢測(cè) IL28B和口PA基因多態(tài)性試劑中的用途。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的技術(shù)方案具有W下優(yōu)勢(shì):本發(fā)明提供的同時(shí)檢測(cè) IL28B和口PA基因多態(tài)性的引物具有特異性好，不會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)，準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn) 了同時(shí)檢測(cè)IL28B和口PA基因多態(tài)性的檢測(cè)，可用于指導(dǎo)利己韋林的用量調(diào)整，W提高抗病 毒治療的反應(yīng)，同時(shí)也可w為臨床預(yù)測(cè)丙型肝炎抗病毒個(gè)體化治療效果提供依據(jù)，具有重 大的社會(huì)意義。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1為本發(fā)明提供的IL28B9917基因引物的擴(kuò)增片段； 圖2為本發(fā)明提供的IL28B9860基因引物的擴(kuò)增片段； 圖3為本發(fā)明提供的口 PA基因引物的擴(kuò)增片段； 圖4為本發(fā)明提供的IL28B和口PA基因 SNaPshot PCR引物的檢測(cè)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0019] 實(shí)施例一、引物 本發(fā)明提供的IL28B和ITPA基因引物如表1所示，包括PCR擴(kuò)增引物和挪aPshot PCR引 物，所述PCR擴(kuò)增引物和挪aPshot PCR引物是相對(duì)應(yīng)的。本發(fā)明提供的所有引物序列均通過(guò) UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，無(wú)已知SNP位點(diǎn)。
[0020] 表1本發(fā)明提供的引物
實(shí)施例二、引物的特