一種具有極酸性pH響應(yīng)的近紅外熒光探針及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物熒光分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有極酸性pH響應(yīng)的近紅外熒 光探針及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞內(nèi)的pH在酶活性、細(xì)胞增殖和調(diào)亡、抗藥性、離子傳輸、細(xì)胞內(nèi)吞作用以及肌 肉收縮等一系列組織活動中起著至關(guān)重要的作用。pH值的微小變化就有可能導(dǎo)致細(xì)胞功能 紊亂，引起癌癥和阿爾茨海默病等疾病。酸性和堿性過強(qiáng)會導(dǎo)致心、肺病變或神經(jīng)類疾病， 嚴(yán)重時甚至?xí)猩ｋU。在正常的生理?xiàng)l件下，細(xì)胞液中H+的濃度約為7.40,其變動幅度 一般在0.1-0.2個pH單位。而一些酸性細(xì)胞器，如溶酶體的pH值范圍為4.5-5.5。極度酸性環(huán) 境(pH〈4)對大多數(shù)生物體是致命的。細(xì)胞內(nèi)pH值與細(xì)胞功能的密切關(guān)系意味著對細(xì)胞內(nèi)pH 值的精確測量可以為研究小至單個細(xì)胞器的生理學(xué)和病理學(xué)過程提供關(guān)鍵信息。因此，如 何精確地檢測細(xì)胞內(nèi)pH值的變化顯得非常重要。
[0003] 相比于其他pH的測定方法，使用熒光探針法進(jìn)行pH檢測具有靈敏度高、選擇性好 等優(yōu)點(diǎn)，但目前大部分pH探針波長較短，不能避開組織自吸收和自熒光，背景干擾較強(qiáng)，部 分stocks位移小，紫外吸收波譜和熒光光譜重疊較大，信噪比低，毒性較大，不能用于細(xì)胞 和活體pH檢測。而近紅外熒光探針的最大吸收波長和發(fā)射波長為600~900nm，可避免背景 干擾。因此，近紅外熒光檢測在生物樣品分析中有明顯的優(yōu)越性。
[0004] 目前報(bào)道的許多pH熒光探針集中在檢測細(xì)胞內(nèi)中性，即細(xì)胞液的pH值以及溶酶體 和內(nèi)涵體等酸性細(xì)胞器pH值。測定極度環(huán)境，如pH〈5或pH>9的熒光探針報(bào)道的非常少。因 此，設(shè)計(jì)合成具有大的Stokes位移、背景干擾少、能測定極度環(huán)境下pH的熒光探針具有非常 重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明提供了一種具有極酸性pH響應(yīng)的近紅外熒光探針及其制備方法 和應(yīng)用。所述具有極酸性pH響應(yīng)的近紅外熒光探針的stocks位移較大、背景干擾少，對H+有 較高的靈敏度、高選擇性，對細(xì)胞和活體傷害較小，且pKa較低，很適合用來進(jìn)行極酸環(huán)境下 (pH〈4.0)ρΗ的檢測，該探針在結(jié)合H+前后顏色變化較明顯，可方便地通過裸眼識別。
[0006] 本發(fā)明第一方面提供了一種具有極酸性pH響應(yīng)的近紅外熒光探針，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式 如式(I)所示：
[0008] 式（I)中，X為-C(CH3)2-、-〇-、-S-或-Se-，z為-CH2-Ph或以-R'NH 2所示的基團(tuán)，其 中，R '為Ci-12的亞烷基，RjPR2分別獨(dú)立地選自Η原子、Ci-18烷基或以-S0 3R5所示的基團(tuán)，其 中，Rs為18烷基或芐基，R3和R4分別獨(dú)立地選自 18烷基或芐基，Y為F、C1、Br或I 〇
[0009] 優(yōu)選地，所述Z為-CH2-Ph或-CH2CH2NH 2。當(dāng)所述R '為亞乙基時，所述Z為-CH2CH2NH2。
[0010] 優(yōu)選地，所述X為-c(ch3)2-。
[0011] 優(yōu)選地，所述Ri和所述R2均為Η原子。
[0012] 優(yōu)選地，所述R3和所述R4均為乙基。
[0013] 優(yōu)選地，所述Y為I。
[0014] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述X為-C(CH3 )2-，所述Ri和所述R2均為Η原子，所述R3和所述R4均 為乙基，所述Y為I。
[0015]所述具有極酸性pH響應(yīng)的近紅外熒光探針，以近紅外花菁類熒光染料
為母體，在中位上分別修飾上對H+敏感的供體分子
(尺'為心七的亞烷基），在光激發(fā)下會產(chǎn)生從電子給體向受體熒光團(tuán)的電荷 轉(zhuǎn)移，在酸性條件下，H+與供體結(jié)合，促進(jìn)了分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移，增加了體系的共輒程度，電子 流動性增加，吸收光譜紅移。在PH3.5~7.5時，其在激發(fā)光760nm、670nm下發(fā)射波長790nm處 的熒光強(qiáng)度比（簡寫為F760/F670)隨著pH的降低而逐漸增強(qiáng)。
[0016]所述具有極酸性pH響應(yīng)的近紅外熒光探針的最大吸收波長隨著pH降低由670nm紅 移到760nm，能有效避開組織自吸收和自焚光，其最大發(fā)射波長為790nm-800nm，stocks位移 高達(dá)130nm，背景干擾少、信噪比較高。同時毒性較小，對細(xì)胞和活體傷害較小。另外，所述探 針的pKa在4左右，由于所述探針帶正電，在細(xì)胞膜負(fù)電的作用下能很快進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)檢測細(xì) 胞內(nèi)pH。
[0017] 本發(fā)明第一方面提供的所述具有極酸性pH響應(yīng)的近紅外熒光探針，具有較低的 pKa值，對H+有較高的靈敏度、高選擇性、stocks位移較大、背景干擾小，對細(xì)胞和活體傷害 較小，很適合用來進(jìn)行極酸環(huán)境下pH的檢測(其中，極酸是指pH〈4.0)，克服了現(xiàn)有技術(shù)熒光 探針的缺陷。而且該探針在結(jié)合H+前后顏色變化較明顯，可方便地通過裸眼識別。
[0018] 本發(fā)明第二方面提供了一種具有極酸性pH響應(yīng)的近紅外熒光探針的制備方法，包 括以下步驟：
[0019] (1)分別提供化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式（Π )所示的化合物和第一化合物，所述第一化合物 的結(jié)構(gòu)式如（ΙΠ )或式(IV)所示：
[0021 ] 式（Π )中，X為-c(CH3) 2-、-0-、-S-或-Se-，心和辦分別獨(dú)立地選自Η原子、Ci-18烷基 或以-S03R5所示的基團(tuán)，其中，烷基或芐基，R3和R4分別獨(dú)立地選自CK8烷基或芐 基，Y為F、Cl、Br或I;式(IV)中，R'為 12的亞烷基；
[0022] (2)將式（Π )所示的化合與所述第一化合物按照摩爾比為1: (3-6)的比例溶解在 溶劑中，再加入縛酸劑，保護(hù)氣體氛圍下，在50_70°C反應(yīng)下l_5h，提純后得到具有極酸性pH 響應(yīng)的近紅外熒光探針，所述具有極酸性pH響應(yīng)的近紅外熒光探針的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式（I) 所示：
[0024]式（I)中，X為-C(CH3)2-、-〇-、-S-或-Se_，Z為-CH 2_Ph或以-R'NH2所示的基團(tuán)，其 中，R '為Ci-12的亞烷基，RjPR2分別獨(dú)立地選自Η原子、Ci-18烷基或以-S0 3R5所示的基團(tuán)，其 中，Rs為18烷基或芐基，R3和R4分別獨(dú)立地選自 18烷基或芐基，Y為F、C1、Br或I 〇 [0025]優(yōu)選地，所述 Z 為-CH2_Ph 或-CH2CH2NH2。
[0026] 優(yōu)選地，所述X為-C(CH3)2-。
[0027] 優(yōu)選地，所述和所述R2均為Η原子。
[0028] 優(yōu)選地，所述R3和所述R4均為乙基。
[0029] 優(yōu)選地，所述Y為I。
[0030] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述X為-C(CH3)2-，所述R!和所述R2均為Η原子，所述R 3和所述R4均 為乙基，所述Y為I。
[0031]步驟(2)的反應(yīng)方程式為：
[0035] 優(yōu)選地，所述溶劑為N，N-二甲基甲酰胺(DMF)或乙腈。
[0036] 優(yōu)選地，所述縛酸劑為三乙胺、N，N_二異丙基乙胺(DIPEA)或吡啶。
[0037] 優(yōu)選地，所述縛酸劑與所述化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式（Π )的化合物的摩爾比為(2-4): 1。
[0038] 優(yōu)選地，所述保護(hù)氣體為氮?dú)?、氬氣或氦氣?br>[0039] 優(yōu)選地，所述提純的方法包括：反應(yīng)結(jié)束后旋蒸除去溶劑，真空干燥12h，過硅膠 柱，用二氯甲烷和甲醇的混合溶液進(jìn)行梯度洗脫以除去溶劑，得到所述具有極酸性pH響應(yīng) 的近紅外熒光探針。
[0040] 更優(yōu)選地，所述梯度洗脫中，所述二氯甲烷和所述甲醇的體積比從30:1到10:1進(jìn) 行變化。
[0041] 進(jìn)一步優(yōu)選地，當(dāng)所述第一化合物的結(jié)構(gòu)式如(IV)所示時，所述提純還包括：
[0042]在所述進(jìn)行梯度洗脫后，采用乙腈和乙二胺的混合溶劑來脫去Fmoc。
[0043]優(yōu)選地，所述化學(xué)結(jié)構(gòu)式（Π )所示的化合物采用以下方法制得：
[0045] 式（V)中，X為-C(CH3)2-、-〇-、-
[0044] 提供化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式（V )所示的化合物：
，： S-或-Se-，RjPR2分別獨(dú)立地選自Η原子、&-18烷基或以-S03R 5所示的基團(tuán)，其中，1?5為&-18烷 基或芐基，R3和R4分別獨(dú)立地選自&-18烷基或芐基，Y為F、C1、Br或I;
[0046] 將化學(xué)式如（V)所示的化合物和
按摩爾比為1:(3-6)的比例溶解在第二溶 劑中，保護(hù)氣體氛圍下，在60°C_80°C進(jìn)行反應(yīng)l_2h，提純后制得化學(xué)式如式（Π )所示的化 合物。
[0047]更優(yōu)選地，所述第二溶劑為N，N-二甲基甲酰胺(DMF)或乙腈。
[0048] 更優(yōu)選地，所述保護(hù)氣體為氮?dú)?、氬氣或氦氣?br>[0049] 更優(yōu)選地，所述提純的方法為：反應(yīng)結(jié)束后旋蒸除去溶劑，真空干燥12h，過硅膠 柱，用二氯甲烷和甲醇的混合溶液進(jìn)行梯度洗脫，除去溶劑，即得化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式（Π )所示 的化合物。
[0050] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述梯度洗脫中，所述二氯甲烷和所述甲醇的體積比從40:1到20: 1進(jìn)行變化。
[0051] 本發(fā)明第二方面提供的一種具有極酸性pH響應(yīng)的近紅外熒光探針的制備方法，該 制備方法簡單易操作。
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