一種抑制ido1表達(dá)的抑制劑及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體為以吲哚胺_2,3_雙加氧酶1 (indoleamin 2,3-dioxygenase 1，ID01，以下簡(jiǎn)稱(chēng)為ID01)為祀點(diǎn)，抑制ID01表達(dá)的抑制劑 及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展，膳食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，中國(guó)人群肥胖患病 率近年來(lái)迅速上升，眾所周知，肥胖是糖尿病發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素之一，而肥胖癥的發(fā)生過(guò) 程伴隨著不同程度的胰島素抵抗。胰島素抵抗以破壞代謝器官的胰島素信號(hào)通路為特征， 使肝臟、骨骼肌、脂肪組織對(duì)胰島素敏感性下降，表現(xiàn)為葡萄糖攝取率和利用率下降，機(jī)體 代償性的分泌過(guò)多胰島素產(chǎn)生高胰島素血癥，以維持血糖的穩(wěn)定；當(dāng)機(jī)體血糖調(diào)節(jié)失衡時(shí) 就導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生，主要癥狀為多尿、多飲、多食和體重減輕。糖尿病會(huì)引發(fā)全身多種并 發(fā)癥的發(fā)生，例如心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等。
[0003] 色氨酸是細(xì)胞生存的必需氨基酸，犬尿氨酸途徑(kynurenine pathway，KP)是色 氨酸代謝的主要途徑，并由此產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物。犬尿氨酸途徑(kynurenine pathway，KP) 的第一限速酶有吲噪胺雙加氧酶1( Indoleamine2,3-Dioxygenase 1，ID01)、吲噪胺雙加氧 酶 2(Indoleamine2,3-Dioxygenase 2, ID02)、色氨酸雙加氧酶2(Tryptophan2,3-Dioxygenase 2，了002)<^02和ID02主要表達(dá)于肝臟、腎臟和肺，而ID01在肝臟以外的其他 組織中都有表達(dá)，其中脂肪組織中含量豐富。研究表明犬尿酸代謝產(chǎn)物涉及免疫調(diào)節(jié)和耐 受機(jī)制。ID01缺陷小鼠顯示出幾乎正常的表型。目前的研究表明犬尿酸代謝途徑產(chǎn)生的代 謝產(chǎn)物參與肥胖的發(fā)生過(guò)程中，而ID01的表達(dá)差異直接影響犬尿酸代謝途徑，這表明ID01 可能成為一個(gè)合適的治療目標(biāo)，通過(guò)抑制ID01的表達(dá)，達(dá)到預(yù)防和治療肥胖及糖尿病等相 關(guān)代謝疾病的目的。由于代謝性疾病的病因包括遺傳的和后天的多種因素，所使用的藥物 多針對(duì)不同的病因，及其繁多，因此確立一個(gè)針對(duì)多種病因、最佳的、副作用最少的治療目 標(biāo)是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。
[0004] RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指一種分子生物學(xué)上由雙鏈RNA誘發(fā)的基因 沉默現(xiàn)象，其機(jī)制是通過(guò)阻礙特定基因的翻譯或轉(zhuǎn)錄來(lái)抑制基因表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi) 源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA時(shí)，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默(Fire A，Xu S， Montgomery M,Kostas S, Driver S,Mello C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.Nature,1998391 (6669): 806-11) ANAi機(jī)制普遍存在于動(dòng)植物，尤其是低等生物中。因此被認(rèn)為是進(jìn)化上相 對(duì)保守的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。研究表明，RNAi機(jī)制可能是作為在RNA水平上抵御病毒入侵的 防御機(jī)制而存在的。
[0005] RNAi在基因沉默方面具有高效性和簡(jiǎn)單性，19個(gè)核苷酸的雙鏈RNA幾乎可以完全 抑制基因的表達(dá)，而且還具有很高的特異性，與靶mRNA之間一個(gè)堿基的錯(cuò)配都會(huì)顯著削弱 基因沉默的效果，所以是基因功能研究的重要工具。大多數(shù)藥物屬于標(biāo)靶基因（或疾病基 因）的抑制劑，因此RNAi模擬了藥物的作用，在今天的制藥產(chǎn)業(yè)中是藥物靶標(biāo)確認(rèn)的一個(gè)重 要工具。同時(shí)，那些在靶標(biāo)實(shí)驗(yàn)中證明有效的siRNA/shRNA本身還可以被進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成為 RNAi藥物。
[0006] 基因敲除(knock-out)小鼠是一種遺傳工程技術(shù)下利用基因剔除技術(shù)所做出的一 或多個(gè)特定基因被剔除的小鼠。此技術(shù)為用來(lái)觀察并研究活體內(nèi)基因表現(xiàn)的工具之一。此 外，更可借由基因剔除后對(duì)小鼠所產(chǎn)生的變化，精確地了解人類(lèi)先天基因缺損所造成疾病 的致病機(jī)制，也是此技術(shù)的重大優(yōu)點(diǎn)之一。
[0007] 我們利用RNA干擾技術(shù)及基因敲除小鼠，了解ID01基因沉默或敲除對(duì)動(dòng)物和人類(lèi) 代謝功能障礙所起的作用，從而確定ID01是否可以成為一種全新的預(yù)防和治療肥胖及胰島 素抵抗等相關(guān)代謝性疾病靶點(diǎn)。對(duì)發(fā)明一個(gè)針對(duì)多種病因、最佳的、副作用最少的治療藥物 或制劑有著極其重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為了解決以上問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種siRNA，該siRNA可靶向抑制ID01 的表達(dá)。
[0009] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案：
[0010] 一種抑制ID01表達(dá)的抑制劑，所述抑制ID01表達(dá)的抑制劑為SiRNA,其特征在于： 所述8丨1?祖為靶向1001基因的雙鏈1?熟分子正義鏈 :5/-600^了6六0六了六06六6六六0六1'-3/，反義
[0011] 優(yōu)選地，所述雙鏈RNA分子的3'末端還有兩個(gè)懸掛堿基，以增加 siRNA活性，能夠?qū)?入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，抑制IDO 1的表達(dá)。
[0012] 優(yōu)選地，所述雙鏈RNA分子為正義鏈:57 -GCCCATGACATACGAGAACATtt-3'，反義鏈： 5/_ATGTTCTCGTATGTCATGGGCtt_ 3/。
[0013] 優(yōu)選地，所述化學(xué)修飾為磷酸骨架修飾，包括對(duì)連接核苷酸的磷酸二酯鍵的部分 修飾或用其他化學(xué)鍵取代，用一個(gè)硫原子取代磷酸二酯鍵的非橋氧原子，提高了 siRNA抗核 酸酶的能力，增加它的穩(wěn)定性。
[0014] 化學(xué)修飾為核糖修飾，包括對(duì)這些SiRNA分子核酸戊糖2位上的0H作的化學(xué)修飾和 改變，RNA酶不易識(shí)別修飾過(guò)的s iRNA，從而增加了 s iRNA的穩(wěn)定性。
[0015] 化學(xué)修飾還包括對(duì)siRNA分子堿基的修飾，siRNA與mRNA通過(guò)堿基互補(bǔ)形成氫鍵， 發(fā)揮RNAi的作用，因此對(duì)堿基進(jìn)行修飾，提高堿基的相互作用。
[0016] 還包括親脂性基團(tuán)修飾，加強(qiáng)siRNA的親脂性，增加其透過(guò)細(xì)胞膜的能力；這些修 飾能夠增加 siRNA的穩(wěn)定性，同時(shí)增強(qiáng)其生物學(xué)活性，能夠順利導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，抑制目 的基因的表達(dá)。
[0017 ]本發(fā)明采用s i RNA設(shè)計(jì)法則，設(shè)計(jì)并篩選出一段能夠抑制IDO 1基因表達(dá)的s i RNA序 列，利用基因敲除技術(shù)得到了ID01缺陷小鼠用于本發(fā)明，通過(guò)高脂飲食誘導(dǎo)，進(jìn)行體重增長(zhǎng) 測(cè)試，葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)以及胰島素敏感實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明與野生型小鼠對(duì)比，ID01基因敲除小 鼠體重低于野生型小鼠，其葡萄糖的耐受性高于野生型小鼠，其胰島素敏感性高于野生小 鼠，并且ID01基因敲除能夠緩解高脂飲食誘導(dǎo)的內(nèi)臟脂肪堆積。并通過(guò)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)將抑制劑 siRNA轉(zhuǎn)入前體脂肪細(xì)胞3T3L1細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，IDOlsiRNA以劑量依賴(lài)的方式抑制 ID01的表達(dá)，siRNA沉默ID01可降低3T3L1分化為脂肪細(xì)胞的效率，這為預(yù)防和治療肥胖及 胰島素抵抗等相關(guān)代謝性疾病提供了理論依據(jù)和臨床基礎(chǔ)。
[0018] 本發(fā)明涉及ID01抑制劑在制備預(yù)防和治療肥胖及糖尿病相關(guān)代謝性疾病藥物中 的應(yīng)用。以ID01為靶基因，設(shè)計(jì)可抑制ID01表達(dá)的雙鏈siRNA，通過(guò)化學(xué)方法合成。經(jīng)過(guò)化學(xué) 修飾或親脂性基團(tuán)修飾后直接注射入哺乳動(dòng)物的體內(nèi)，通過(guò)RNA干擾的方法使I DO 1基因沉 默來(lái)預(yù)防或治療肥胖及糖尿病。
[0019] 本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明的優(yōu)越性在于運(yùn)用RNA干擾技術(shù)及相關(guān)技術(shù)探明了 ID01基因沉默能夠治療和預(yù)防肥胖及胰島素抵抗，從而確定ID01可以成為一種全新的預(yù)防 和治療肥胖及糖尿病等相關(guān)代謝性疾病的靶點(diǎn)，對(duì)發(fā)明一個(gè)針對(duì)多種病因、最佳的、副作用 最少的治療藥物或制劑有著極其重要的意義，為制備相關(guān)藥物或制劑提供了新的選擇，有 著廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1:1 DO 1基因敲除小鼠附睪脂肪中I DO 1表達(dá)缺失。
[0021] WT代表野生型小鼠 （n = 4)，Ido-Λ代表1D01基因敲除鼠 （n = 4)。
[0022]圖2: ID01缺陷小鼠改善高脂飲食誘導(dǎo)下的小鼠肥胖和胰島素抵抗。2A，60%高脂 飲食和普通飲食分別喂養(yǎng)野生型和ID01缺陷小鼠3個(gè)月，HF WT代表高脂野生組，HF K0代表 高脂敲除組，ND WT代表普通野生組，ND K0代表普通敲除組;2B，記錄高脂飲食誘導(dǎo)3個(gè)月小 鼠體重增長(zhǎng)圖；2C，葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)的血糖值;2D，胰島素敏感實(shí)驗(yàn)的血糖值。
[0023]圖3:ID01敲除能夠緩解高脂飲食誘導(dǎo)的內(nèi)臟脂肪堆積。
[0024] 3A，高脂飲食誘導(dǎo)12周，四組小鼠的附睪脂肪組織的大體圖；B，附睪脂肪組織的絕 對(duì)重量；3C，附睪脂肪石蠟切片HE染色（左），附睪脂肪中脂肪細(xì)胞的面積統(tǒng)計(jì)（右）Xtl， Control;林，p〈0.001。
[0025]圖4:ID01siRNA劑量依賴(lài)性抑制前體