一種茶樹(shù)miRNA及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種茶樹(shù)miRNA及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 茶是世界三大飲料作物之一，富含豐富的代謝產(chǎn)物，對(duì)人體健康有重要作用。這些 代謝產(chǎn)物受植物體內(nèi)氮素代謝的影響。氮代謝是植物體內(nèi)重要的物質(zhì)和能量代謝過(guò)程，其 中谷氨酰胺合成酶(GS;EC 6.3.1.2)是氮素代謝中的關(guān)鍵酶，其在ATP的供能下，催化NH4+合 成谷氨酰胺，然后在谷氨酸合酶的作用下將谷氨酰胺的酰胺轉(zhuǎn)化到酮戊二酸中，從而生成 兩分子的谷氨酸。GS/G0GAT是高等植物氮同化的主要途徑，目前在茶樹(shù)中已相繼克隆得到 谷氨酰胺合成酶的編碼基因 GS1;1基因，其可以受轉(zhuǎn)錄因子Dof，14-3-3蛋白的調(diào)控，從而參 與植物的氮素代謝過(guò)程。
[0003] microRNA(miRNA)是由18-25個(gè)核苷酸組成的非編碼RNA，首先由基因組轉(zhuǎn)錄，形成 帶帽狀結(jié)構(gòu)和多聚腺苷酸尾巴的初級(jí)11^1?祖(？1'；[-11111?祖）。？1'；[-11111?嫩經(jīng)核酸酶01'081^處理 后形成約70nt的含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體miRNA(pre-miRNA)，其后又經(jīng)核酸酶剪切為成熟的 miRNA^iRNA通過(guò)堿基非完全配對(duì)與靶基因 mRNA3'utr序列結(jié)合，引導(dǎo)沉默復(fù)合體（1?財(cái)-induced silencing complex,RISC)降解mRNA或抑制mRNA的翻譯，從而調(diào)控基因表達(dá)。一個(gè) miRNA可結(jié)合多個(gè)革E1基因，而一個(gè)mRNA也可由多個(gè)miRNA共同調(diào)節(jié)。這個(gè)復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)即 可通過(guò)一個(gè)miRNA來(lái)調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)，也可以通過(guò)幾個(gè)miRNA的組合來(lái)精細(xì)調(diào)控某個(gè)基 因的表達(dá)。
[0004] 近年來(lái)，對(duì)于植物miRNA及其生物學(xué)功能的研究已成為熱點(diǎn)，研究對(duì)象主要集中在 模式植物擬南芥和水稻，玉米等模式作物中，而對(duì)于茶樹(shù)的miRNA序列信息被發(fā)現(xiàn)相對(duì)較 少，通過(guò)高通量測(cè)序及直接克隆獲得了部分miRNA，其功能的研究報(bào)道更為少見(jiàn)。公布號(hào)為 CN104830859A的專利文獻(xiàn)公開(kāi)了一種茶樹(shù)miRNA及其應(yīng)用，該茶樹(shù)miRNA的堿基序列如SEQ ID NO. 1所示。本發(fā)明通過(guò)Solexa高通量測(cè)序技術(shù)、生物信息學(xué)分析等技術(shù)，首次從茶樹(shù)浙 農(nóng)139中鑒定了 miR156及其前體Cs-miR156g，并通過(guò)不同氮素處理驗(yàn)證了不同氮素條件下 miR156的表達(dá)差異，得出兒茶素總量與miR156呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系的結(jié)論，證明本發(fā)明茶樹(shù) miRNA(miR156)及其前體Cs-miR156g在調(diào)控茶樹(shù)兒茶素表達(dá)中起到重要作用，茶樹(shù)miRNA (miR156)及其前體Cs-miR156g的表達(dá)可抑制茶樹(shù)中兒茶素的合成，在優(yōu)質(zhì)茶葉品種的培育 中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。
[0005] 因此，借鑒上述方法進(jìn)一步發(fā)掘和鑒定茶樹(shù)中的miRNA，對(duì)其革E1基因進(jìn)行鑒定，尤 其是調(diào)控茶樹(shù)氮素代謝的miRNA，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控茶樹(shù)的氮素代謝，提高茶樹(shù)的氮素 利用效率，改善茶葉的品質(zhì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了一種茶樹(shù)特異miRNA及其應(yīng)用，該miRNA能夠調(diào)控茶樹(shù)的氮素代謝， 可應(yīng)用于提高茶樹(shù)氮素利用效率，改良茶葉的品質(zhì)。
[0007] 一種茶樹(shù)miRNA，堿基序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 本發(fā)明的茶樹(shù)miRNA是從茶樹(shù)浙農(nóng)139品種幼苗的新梢中提取篩選得到，命名為 miR32,利用5'RLM-race技術(shù)鑒定茶樹(shù)miR32的靶基因 NCBI登錄號(hào)為AB115183,該靶基因?yàn)?茶樹(shù)谷氨酰胺合成酶的編碼基因 GS1; 1。谷氨酰胺合成酶是茶樹(shù)氮素代謝中的關(guān)鍵酶，因此 本發(fā)明鑒定出的茶樹(shù)miR32在茶樹(shù)氮素代謝中起重要作用。
[0009] 上述茶樹(shù)miRNA的前體，堿基序列如SEQ ID N0.2所示。
[0010] 轉(zhuǎn)錄形成上述茶樹(shù)miRNA前體的DNA片段，堿基序列如SEQ ID NO.3所示。
[0011] 本發(fā)明通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)茶樹(shù)miR32的前體序列，PCR擴(kuò)增，得到轉(zhuǎn)錄形成茶樹(shù) miR32前體的DNA片段，測(cè)序得至IjDNA片段的核苷酸序列信息，進(jìn)而分析出茶樹(shù)miRNA前體的 喊基序列。
[0012] 本發(fā)明將轉(zhuǎn)錄形成茶樹(shù)miR32前體的DNA片段插入了載體中得到重組質(zhì)粒，有利于 茶樹(shù)miR32的穩(wěn)定保存。可根據(jù)具體情況選用合適的載體，作為優(yōu)選原始載體可為pCAMBIA 系列的植物表達(dá)載體，具體可選用PCAMBIA1301。
[0013] 本發(fā)明還提供了上述的茶樹(shù)miRNA在抑制谷氨酰胺合成酶基因 GS1;1表達(dá)中的應(yīng) 用。
[0014] 本發(fā)明采用煙草瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)證明茶樹(shù)miR32抑制谷氨酰胺合成酶基因 GS1;1的 表達(dá)，茶樹(shù)miR32作用于靶基因 mRNA的3'UTR序列。
[0015] 本發(fā)明提供了上述茶樹(shù)miRNA在調(diào)控茶樹(shù)氮素代謝中的應(yīng)用。
[0016] 谷氨酰胺合成酶參與植物體內(nèi)氮代謝的最主要途徑。miR32表達(dá)上調(diào)時(shí)，GS1;1表 達(dá)呈現(xiàn)下調(diào)。反之miR32表達(dá)下調(diào)時(shí)，GS1; 1表達(dá)呈現(xiàn)上調(diào)。因此通過(guò)miR32基因可控制GS1; 1 的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)茶樹(shù)氮代謝調(diào)控。
[0017] 本發(fā)明提供了上述茶樹(shù)miRNA的前體在調(diào)控茶樹(shù)氮素代謝中的應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明具備的有益效果：本發(fā)明通過(guò)Solexa高通量測(cè)序技術(shù)、生物信息學(xué)分析、 RT-PCR等技術(shù)，首次從茶樹(shù)浙農(nóng)139品種中鑒定了 miR32及其前體。通過(guò)5'RLM-race、煙草瞬 時(shí)表達(dá)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等技術(shù)，證明miR32可以負(fù)調(diào)控茶樹(shù)GS1; 1基因表達(dá)。通過(guò)GS1; 1在 擬南芥中過(guò)表達(dá)驗(yàn)證其在茶樹(shù)氮素代謝中的重要作用，表明miR32參與調(diào)控茶樹(shù)氮素代謝， 提高茶樹(shù)氮肥利用效率，改善茶葉品質(zhì)如提高茶氨酸含量等方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1為茶組植物miR32前體比對(duì)。
[0020] 圖2為miR32的前體結(jié)構(gòu)。
[0021] 圖3為注射不同載體的煙草葉片GUS染色觀察，其中(A)單獨(dú)注射miR32;(B)單獨(dú)注 射空載PCMBIA1301; (C)單獨(dú)注射GS1; 1; (D)共注射miR32和GS1; 1。
[0022]圖4為miR32及GS1;1在缺氮處理下的表達(dá)分析，其中（A)缺氮2h，miR32表達(dá)情況； (B)缺氮48h，miR32表達(dá)情況；（C)缺氮2h，GSl; 1表達(dá)情況；（D)缺氮48h，GSl; 1表達(dá)情況。 [0023]圖5為在不同氮素處理下miR32及GS1;1的表達(dá)情況，其中（A)和(B)分別為芽葉和 根中miR32的表達(dá)分析，（C)和(D)分別為芽葉和根中GS1; 1的表達(dá)分析。
[0024]圖6為轉(zhuǎn)基因擬南芥在不同濃度銨條件下培養(yǎng)的形態(tài)觀察結(jié)果，其中A1和A2為對(duì) 照;B1和B2為4mM銨條件下生長(zhǎng)情況;C1和C2為20mM銨條件下生長(zhǎng)情況。
[0025] 圖7為轉(zhuǎn)基因擬南芥在不同濃度銨條件下的生物量測(cè)定結(jié)果，其中(A)為蓮座葉鮮 重；（B)為根鮮重；（C)為抽薹莖鮮重。
[0026] 圖8為轉(zhuǎn)基因擬南芥的生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果，其中（A)為游離氨基酸含量測(cè)定結(jié)果； (B)為可溶性糖含量測(cè)定結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述和說(shuō)明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限 于此。
[0028]下列實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為本領(lǐng)域常規(guī)方法，所用的材料、試 劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑中獲得。
[0029] 實(shí)施例lmiR32的發(fā)掘和鑒定
[0030] 1.植物材料和樣品的準(zhǔn)備
[0031] 取茶樹(shù)(Camellia sinensis)浙農(nóng)139品種一年生扦插苗，置于人工氣候室中水 培，采摘茶樹(shù)幼苗的一芽二葉，液氮速凍后，-70 °C冰箱冷凍備用。
[0032] 2.茶樹(shù)miRNA的高通量測(cè)序
[0033] 采用Trizol法提取茶樹(shù)RNA
[0034] 1)取茶樹(shù)新梢100mg，迅速加液氮冷凍研磨至粉末狀；
[0035] 2)將粉末轉(zhuǎn)至1.5mL離心管內(nèi)，加入1000ml Trizol試劑，冰上放置5min;
[0036] 3)加入200yL氯仿，蓋緊管蓋，用手用力搖晃試管15s，使其充分混勻，靜置5min后， 4°C 12000r/min離心 15min;
[0037] 4)小心吸取上層水相500yL轉(zhuǎn)入新的1.5mL離心管中，加入等體積異丙醇，上下輕 輕顛倒10次，室溫放置l〇min，4°C、12000r/min離心10min;
[0038] 5)小心倒掉上清，留取沉淀。加 lmL75%乙醇振蕩洗滌兩次，4°C、7500r/min離心 5min；
[0039] 6)倒去乙醇，將離心管放置超凈臺(tái)開(kāi)風(fēng)機(jī)吹干，注意不能讓RNA沉淀完全干燥，后 加入30yL ddH20溶解沉淀；
[0040] 7)將獲得的RNA樣品