一種基于聚酰胺-胺的環(huán)糊精功能化衍生物載體系統(tǒng)及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物材料技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種基于聚酷胺-胺的環(huán)糊精功能化衍生物 載體系統(tǒng)及其應(yīng)用，具體是聚酷胺-胺功能化修飾環(huán)糊精陽離子聚合物的制備方法及其作 為載體系統(tǒng)的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 基因治療是通過將外源性的基因?qū)塍w內(nèi)的受體細(xì)胞，修復(fù)或替換有缺陷、受損 基因的方法;通過它可W廣泛治療嚴(yán)重的后天獲得及先天遺傳疾病如:癌癥、獲得性免疫缺 陷綜合癥、屯、血管疾病、傳染病、及染色體相關(guān)的嚴(yán)重綜合性免疫缺陷等;理論上，基因治療 是一種簡單有效的醫(yī)治手段，只需要將病變基因替換成建康基因或是引入先天缺失的基因 W便產(chǎn)生所需的蛋白；事實(shí)上，為了使基因能夠達(dá)到人體的祀向細(xì)胞并正確表達(dá)，其必須克 服眾多阻礙才能實(shí)現(xiàn)。
[0003] 雖然病毒型載體具有低病原性、廣泛取向性、轉(zhuǎn)染效率高的特點(diǎn)，但其具有的高免 疫原性、基因插入突變風(fēng)險(xiǎn)、基因?qū)氲乃矔r(shí)表達(dá)W及較低的基因裝載能力等因素極大地 限制了病毒型載體的應(yīng)用;數(shù)據(jù)顯示，由于具有嚴(yán)重的副作用產(chǎn)生，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體用于重 癥綜合性免疫缺陷（SCID)的治療使用已經(jīng)由28%下降到19.7%;相反，基于非病毒載體系統(tǒng) 制備的新型傳遞系統(tǒng)的臨床實(shí)驗(yàn)研究正在快速增長，聚酷胺-胺(PAMAM)生物材料是W乙二 胺為核，通過邁克爾加成反應(yīng)制備的，分子外層的伯氨基質(zhì)子化形成-N出+基團(tuán)，可W充當(dāng) 結(jié)合位點(diǎn)，而分子內(nèi)叔胺基充當(dāng)了 "質(zhì)子海綿"，提供了良好的緩沖能力，從而提高轉(zhuǎn)染效 率;雖然聚酷胺-胺表現(xiàn)出良好的基因傳遞能力，但隨著分子量的增加，其毒性也在顯著提 高；正是基于上述原因，對于PAMAM的分子修飾成為了目前研究的熱點(diǎn)，旨在通過鍵合功能 性基團(tuán)或帶功能性基團(tuán)的分子，W達(dá)到改善原有性能，拓寬使用范圍的目的。
[0004] 經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈成形術(shù)(PTCA)是治療屯、肌梗塞等屯、臟疾病的微創(chuàng)介入療法，但 該法在采用球囊治療時(shí)不可避免的造成血管內(nèi)皮產(chǎn)生機(jī)械性損傷，導(dǎo)致PTCA術(shù)后3-6月內(nèi) 仍有近50%的患者發(fā)生血管再狹窄，臨床上用于防治術(shù)后血管再狹窄通常介入安置一枚或 多枚血管支架，但順應(yīng)性差始終是難W解決的問題。
[0005] 丹參酬n A來自于唇形科植物丹參的根莖，其藥理作用為改善冠狀動脈循環(huán)，抑制 血栓疾病發(fā)生，丹參素具有顯著擴(kuò)張冠狀動脈，增加冠脈血流量，降低屯、肌耗氧量，同時(shí)，丹 參酬EA具有血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷修復(fù)的功能;基于上述原因，需要設(shè)計(jì)和研發(fā)一種針對于血 管內(nèi)皮的損傷特點(diǎn)的新型輸送載體系統(tǒng)，W解決上述問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提出一種基于聚酷胺-胺的環(huán)糊精功能化衍生物載體系統(tǒng)及其應(yīng) 用，具體的是，制備一種環(huán)糊精內(nèi)核，外部功能化修飾聚酷胺-胺的陽離子聚合物載體系統(tǒng)， 該陽離子聚合物主要用于基因藥物載體及基因傳遞。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開了一種基于聚酷胺-胺的環(huán)糊精功能化衍生物載體 系統(tǒng)及其應(yīng)用，所述載體系統(tǒng)由環(huán)糊精經(jīng)聚酷胺-胺功能化修飾而成，所述載體系統(tǒng)的化學(xué) 結(jié)構(gòu)如下：
其中，環(huán)糊精為e-環(huán)糊精或其衍生物，丫-環(huán)糊精或其衍生物，PAMAM為乙二胺粉。，末 端為胺基化的聚酷胺-胺化0-G4)，m=2-6。
[000引作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:所述載體系統(tǒng)的平均分子量為2199-43858。
[0009] 作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案:所述載體系統(tǒng)的制備方法，包括W下步驟： (1) 定量稱取環(huán)糊精置于500ml圓底燒瓶中，加入無水DMSO溶解并形成澄清透明溶液A， 定量稱取N，N-幾基二咪挫，加無水DMSO溶液并形成澄明溶液B; (2) 在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，將溶液AWSmlA的速度滴加至溶液B中，滴加完畢后避光條件 下室溫?cái)埌?6-24h，將攬拌后得到的反應(yīng)溶液加入到乙酸與乙酸乙醋的混合溶液中，室溫 下W3000rpm條件離屯、lOmin，棄上清溶液得白色粘稠沉淀物，將白色粘稠沉淀物采用乙酸 與四氨巧喃混合液洗涂2-3次后，減壓干燥除去有機(jī)溶媒，用無水DMSO溶解形成溶液C; (3 )將整代PAMAM置于圓底燒瓶中，在圓底燒瓶中加入無水DMSO溶解形成溶液D，氮?dú)獗?護(hù)下，將溶液CW5ml/h的速度滴加至溶液D中，避光條件下室溫?cái)埌?6-24h;將攬拌后所得 反應(yīng)溶液加入到乙酸與乙酸乙醋的混合溶液中，室溫下W3000巧m條件離屯、IOmin，棄去上 清溶液得淡黃色粘稠沉淀物； (4)將淡黃色粘稠沉淀物用雙蒸水溶解，置于透析袋中并攬拌，每化換水，透析3天，所 得透析液在真空度小于等于13pa條件下進(jìn)行冷凍干燥，得白色目標(biāo)產(chǎn)物。
[0010] 作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案:所述步驟1中環(huán)糊精與N，N-幾基二咪挫反應(yīng)摩爾比 為1:50-1:100,環(huán)糊精與PAMAM的摩爾比為1:42-1:120。
[0011] 作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案:所述步驟2和步驟3中乙酸與乙酸乙醋的混合溶液按 照乙酸與乙酸乙醋的體積比為1:1-1: 3配置，反應(yīng)溶液與乙酸與乙酸乙醋的混合溶液的體 積比為 1:10-1:50。
[0012] 作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案:所述白色目標(biāo)產(chǎn)物與DNA形成的復(fù)合物體系平均粒 徑為 50-250nm，PDI 為0.1-0.25，zeta 電位為 12-46mv。
[0013] 作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案:所述環(huán)糊精經(jīng)聚酷胺-胺功能化修飾后形成的載體 系統(tǒng)具有同時(shí)裝載丹參酬HA藥物的功能，能夠共同負(fù)載藥物與基因。
[0014] 作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案:所述載體系統(tǒng)與丹參酬EA的摩爾比為0.8:1-1.2: Io
[0015] 作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案:所述載體系統(tǒng)在體外基因細(xì)胞轉(zhuǎn)染及動脈血管再狹 窄的治療方面的應(yīng)用。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明針對于血管內(nèi)皮的損傷特點(diǎn)，審U 備了一種W環(huán)糊精經(jīng)聚酷胺-胺功能化修飾而成的新型輸送載體系統(tǒng)，該系統(tǒng)可W同時(shí)負(fù) 載丹參酬類藥物及基因，可有效針對受損的內(nèi)皮進(jìn)行修復(fù)，抑制組織細(xì)胞增生，達(dá)到協(xié)同治 療的效果，在PTCA術(shù)后再狹窄的防治方面有很好的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0017] 圖1為本發(fā)明中聚酷胺-胺的環(huán)糊精功能化衍生物紅外光譜圖。
[0018] 圖2本發(fā)明中聚酷胺-胺的環(huán)糊精功能化衍生物毒性試驗(yàn)結(jié)果示意圖。
[0019] 圖3本發(fā)明中聚酷胺-胺的環(huán)糊精功能化衍生物體外轉(zhuǎn)染結(jié)果示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完 整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；?本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他 實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0021] -種基于聚酷胺-胺的環(huán)糊精功能化衍生物載體系統(tǒng)，由環(huán)糊精經(jīng)聚酷胺-胺功能 化修飾而成;所述載體系統(tǒng)的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下：
其中，環(huán)糊精為e-環(huán)糊精或其衍生物，丫-環(huán)糊精或其衍生物，PAMAM為乙二胺粉。，末 端為胺基化的聚酷胺-胺化〇-G4)，m=2-6;所述載體系統(tǒng)的平均分子量為2199-43858。
[0022] 所述基于聚酷胺-胺的環(huán)糊精功能化衍生物載體系統(tǒng)的制備方法，包括W下步驟： (1) 定量稱取環(huán)糊精置于500ml圓底燒瓶中，加入無水DMSO溶解并形成澄清透明溶液A， 定量稱取N，N-幾基二咪挫，加無水DMSO溶液并形成澄明溶液B; (2) 在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，將溶液AWSmlA的速度滴加至溶液B中，滴加完畢后避光條件 下室溫?cái)埌?6-24h，將攬拌后得到的反應(yīng)溶液加入到乙酸與乙酸乙醋的混合溶液中，室溫 下W3000rpm條件離屯、lOmin，棄上清溶液得白色粘稠沉淀物，將白色粘稠沉淀物采用乙酸 與四氨巧喃混合液洗涂2-3次后，減壓干燥除去有機(jī)溶媒，用無水DMSO溶解形成溶液C; (3 )將整代PAMAM置于圓底燒瓶中，在圓底燒瓶中加入無水DMSO溶解形成溶液D，氮?dú)獗?護(hù)下，將溶液CW5ml/h的速度滴加至溶液D中，避光條件下室溫?cái)埌?6-24h;將攬拌后所得 反應(yīng)溶液加入到乙酸與乙酸乙醋的混合溶液中，室溫下W3000巧m條件離屯、IOmin，棄去上 清溶液得淡黃色粘稠沉淀物； (4)將淡黃色粘稠沉淀物用雙蒸水溶解，置于透析袋中并攬拌，每化換水，透析3天，所 得透析液在真空度小于等于13pa條件下進(jìn)行冷凍干燥，得白色目標(biāo)產(chǎn)物。
[0023] 所述步驟1中環(huán)糊精與N，N-幾基二咪挫反應(yīng)摩爾比為1:50-1:100,環(huán)糊精與PAMAM 的摩爾比為1:42-1:120。
[0024] 所述步驟2和步驟3中乙酸與乙酸乙醋的混合溶液按照乙酸與乙酸乙醋的體積比 為1:1-1:3配置，反應(yīng)溶液與乙酸與乙酸乙醋的混合溶液的體積比為1:10-1:50。
[00巧]所述白色目標(biāo)產(chǎn)物與DNA形成的復(fù)合物體系平均粒徑為50-250nm，PDI為0.1-0.25，ze1:a 電位為 12-46mv。
[0026] 所述環(huán)糊精經(jīng)聚酷胺-胺功能化修飾后形成的載體系統(tǒng)具有同時(shí)裝載丹參酬EA 藥物的功能，能夠共同負(fù)載藥物與基因，所述載體系統(tǒng)與丹參酬HA的摩爾比為0.8:1-1.2: 1;所述載體系統(tǒng)在體外基因細(xì)胞轉(zhuǎn)染及動脈血管再狹窄的治療方面的應(yīng)用。
[0027] 實(shí)施例1 稱量0-CDO. 114g，加入25ml無水DMSO溶解形成澄清溶液A，另精密稱量N，N-幾基二咪挫 0.81 Ig置于500ml圓底燒瓶中，加入25ml無水DMSO溶解成溶液B，氮?dú)獗Ｗo(hù)并在快速磁力攬 拌條件下，將溶液AW lml/5min速度滴入到溶液B中，避光室溫?cái)埌?6h;將所得產(chǎn)物溶液加 入到900ml乙酸與乙酸乙醋的混合溶液中，產(chǎn)生白色渾濁;將渾濁液在3000巧m條件下離屯、 lOmin，棄去上清溶液并用上述乙酸與乙酸乙醋混合液洗涂2-3次，備用;將獲得的固體使用 25ml無水DMSO溶解的溶液C，再精密稱取PAMAM-Gl 1.02g溶解于150ml無水DMSO中得溶液D; 在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將溶液C緩慢滴加至溶液D中，避光攬拌16h;將所得產(chǎn)物溶液加入到1200ml 乙酸與乙酸乙醋的混合溶液中，于3000rpm條件下離屯、lOmin，將所得固體用雙蒸水溶解，放 置于截留分子量3500的透析袋中透析3天，將透析液冷凍干燥，得白色目標(biāo)產(chǎn)物，收率 24.7〇/〇。
[0028] 實(shí)施例2 稱量0-CDO. 224g，加入25ml無水DMSO溶解形成澄清溶液A，另精密稱量N，N-幾基二咪挫 2.044g置于500ml圓底燒瓶中，加入25ml無水DMSO溶解成溶液B;氮?dú)獗Ｗo(hù)并在快速磁力攬 拌條件下，將溶液AW lml/5min速度滴入到溶液B中，避光室溫?cái)埌?6h;將所得產(chǎn)物溶液加 入到1500ml乙酸與乙酸乙醋的混合溶液中，產(chǎn)生白色渾濁;將渾濁液在3000rpm條件下離屯、 lOmin，棄去上清溶液并用上述乙酸與乙酸乙醋混合溶液洗涂2-3次，備用;將上一步驟獲得 的固體使用25ml無水DMSO溶解的溶液C，再精密稱取PAMAM-Gl 10.224g溶解于150ml無水 DMSO中得溶液D;在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將溶液C緩慢滴加至溶液D