一種通用型抗體-寡核苷酸探針及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種通用型抗體?寡核苷酸探針及試劑盒，所述通用型抗體?寡核苷酸探針包括寡核苷酸探針部分和抗體部分；所述寡核苷酸探針部分是將寡核苷酸的5'端進行醛基修飾后得到的，所述抗體部分是將抗體進行肼基修飾后得到的；所述寡核苷酸探針部分和所述抗體部分經(jīng)過偶聯(lián)得到所述通用型抗體?寡核苷酸探針。所述通用型抗體?寡核苷酸探針中不同的寡核苷酸可以與不同種類的抗體偶聯(lián)，從而可以進行QPCR，通用的平行檢測細胞中的多種相應(yīng)的抗原，實用性強。
【專利說明】
一種通用型抗體-寡核苷酸探針及試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及免疫聚合酶鏈式反應(yīng)領(lǐng)域，具體涉及一種通用型抗體-寡核苷酸探針 及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 免疫聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)，是一種利用抗原抗體 反應(yīng)的特異性和PCR擴增反應(yīng)的靈敏性而建立的一種微量抗原檢測技術(shù)。為了測定某種特 定抗原，必須制備相應(yīng)的抗體-核苷酸探針。而特定的抗體與核苷酸的交聯(lián)過程非常復(fù)雜， 而且不具有通用性。通常是根據(jù)特定的抗體結(jié)構(gòu)，設(shè)計特定的交聯(lián)方式。
[0003] 如申請?zhí)枮?01110315281.6的中國專利，其專利名稱為《檢測病源細胞的靶向性 分子及其應(yīng)用》，公開了一種用于靶向性檢測病源細胞的試劑盒，其中公開的靶向性分子是 將葉酸或葉酸-半胱氨酸偶聯(lián)物與寡核苷酸探針通過C-S鍵偶聯(lián)得到的。但是該方法僅可得 到葉酸或葉酸-半胱氨酸偶聯(lián)物可識別的病源細胞，通用性不強，無法實現(xiàn)多重檢測的目 的。而一般的細胞檢測往往都需要同時檢測多個抗原，對一份樣品進行反復(fù)的操作，不但大 幅增加了工作量，延長了檢測周期，增加了失誤概率，同時可能帶來樣品污染的問題，檢測 結(jié)果的可靠性不高。
[0004] 并且，偶聯(lián)了寡核苷酸會對抗體的親和性有影響，使結(jié)合了寡核苷酸的抗體特異 性結(jié)合的親和力不高，從而影響檢測的準確度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種通用型抗體-寡核苷酸探針，可對樣本的多個表面抗原 進行平行定量檢測，并且提高了檢測的靈敏度和準確性。
[0006] 本發(fā)明的另一個目的是提供含有上述通用型抗體-寡核苷酸探針的試劑盒。
[0007] 本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0008] -種通用型抗體-寡核苷酸探針，其特征在于：所述通用型抗體-寡核苷酸探針包 括寡核苷酸探針部分和抗體部分;所述寡核苷酸探針部分是將寡核苷酸的5 '端進行醛基修 飾后得到的，所述抗體部分是將抗體進行肼基修飾后得到的；所述寡核苷酸探針部分和所 述抗體部分經(jīng)過偶聯(lián)得到所述通用型抗體-寡核苷酸探針。
[0009] 進一步的，所述寡核苷酸的長度為16-22nt，5 '端為6-14nt長度的引物識別序列， 3'端用延伸引物進行延伸擴展。
[00?0]更進一步的，所述延伸引物的長度為50-80nt，它的3 '端末端與寡核苷酸的3 '端互 補配對，5'端可以形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。延伸引物的序列優(yōu)選為SEQ ID N0:14。
[0011] 所述寡核苷酸探針部分是將5 '端帶有氨基修飾的寡核苷酸，用摩爾當量為5-20倍 的SFB進行醛基修飾后得到的;所述抗體部分是將抗體用摩爾當量為10-50倍的SANH進行肼 基修飾后得到的。
[0012] 其中，上述的SFB是指4-甲酰苯甲酸N-琥珀酰亞胺酯；上述的SANH是指4-(N-馬來 酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯。
[0013]所述抗體-寡核苷酸探針是將摩爾比為（7-10):1的寡核苷酸探針部分和抗體部 分，在室溫條件下反應(yīng)4-24小時后得到的。
[0014]優(yōu)選的，所述寡核苷酸的序列為SEQ ID N0:1-13中所示的任一個。
[0015] 在本發(fā)明的另一方面，提供了一種含有上述通用型抗體-寡核苷酸探針的試劑盒， 所述試劑盒包括：
[0016] 通用型抗體-寡核苷酸探針；
[0017] 用于將通用型抗體-寡核苷酸探針進行PCR擴增的擴增引物及緩沖液；
[0018] 還包括熒光探針。
[0019] 所述擴增引物中包括一對用于將通用型抗體-寡核苷酸探針進行PCR擴增的正向、 反向引物;所述正向引物的5'端與寡核苷酸互補。
[0020] 進一步的，所述試劑盒中還包括延伸引物，所述延伸引物的長度為50-80nt，它的 3 '端末端與寡核苷酸的3 '端互補配對，5 '端可以形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。
[0021 ]所述試劑盒中的通用型抗體-寡核苷酸探針為CK19-寡核苷酸探針。
[0022]本發(fā)明具有如下有益效果：
[0023] 1.本發(fā)明先將寡核苷酸與抗體分別進行定向修飾得到寡核苷酸探針部分和抗體 部分，從而可以避免抗體內(nèi)部發(fā)生交聯(lián)，使寡核苷酸探針部分和抗體部分的偶聯(lián)具有高度 特異性，得到的腙鍵偶聯(lián)物穩(wěn)定性好。而且定向修飾及偶聯(lián)的反應(yīng)條件溫和，不需另外使用 還原劑，抗體不易變性和失活。
[0024] 2.由于抗體-寡核苷酸探針中抗體部分的親和性在一定程度內(nèi)會隨著寡核苷酸鏈 長度增加而下降，而發(fā)明人發(fā)現(xiàn)控制寡核苷酸的長度為16_22nt時，抗體部分的親和性幾乎 不受影響。
[0025] 3.用延伸引物對寡核苷酸的3 '端擴增，可以保證寡核苷酸鏈過短時的PCR擴增要 求，并且延伸引物5'端的發(fā)卡結(jié)構(gòu)可以增加堿基的堆砌力，從而增強探針敏感性，使通用型 抗體-寡核苷酸探針檢測更加靈敏。
[0026] 4.由于寡核苷酸與延伸引物是在3'端互補配對的，因此延伸擴展的過程在PCR擴 增過程中可自行反應(yīng)，延伸擴展之后再以延伸后的抗體-寡核苷酸為模板進行擴增，一步反 應(yīng)即可，反應(yīng)效率高。
[0027] 5.本發(fā)明所述通用型抗體-寡核苷酸探針中不同的寡核苷酸可以與不同種類的抗 體偶聯(lián)，從而可以進行多重PCR，通用的平行檢測細胞中的多種相應(yīng)的抗原，實用性強。
【具體實施方式】
[0028] 以下通過具體實施例來進一步說明本發(fā)明：
[0029] 本發(fā)明要得到通用型抗體-寡核苷酸探針，其是通過先將寡核苷酸與抗體分別進 行醛基和肼基的定向修飾得到寡核苷酸部分和抗體部分，再進行腙鍵偶聯(lián)得到。優(yōu)選的，所 述寡核苷酸探針部分是將5 '端帶有氨基修飾的寡核苷酸，用摩爾當量為5-20倍的SFB進行 醛基修飾后得到的，優(yōu)選摩爾當量為10倍;所述抗體部分是將抗體用摩爾當量為10-50倍的 SANH進行肼基修飾后得到的，優(yōu)選摩爾當量為25倍。其中，SFB為4-甲酰苯甲酸N-琥珀酰亞 胺酯，SANH為4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯。用SFB修飾寡核苷酸 的5 '端上的氨基可以得到醛基活化的寡核苷酸，用SANH修飾抗體可以得到肼基活化的抗體 蛋白。這兩個反應(yīng)為公開技術(shù)可以得到的，如中國文獻"基于核酸分子雜交的免疫芯片抗體 固定新方法"，《分析化學(xué)》，2013年第2期，沙莎等公開的。反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度等條件可根據(jù) 文獻內(nèi)容做出本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的調(diào)整。本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案為:將5'端帶有氨基修 飾的寡核苷酸用pH值為7.4的PBS緩沖液溶解，然后與摩爾當量為寡核苷酸10倍的SFB溶液 混合，室溫反應(yīng)2.5小時，再純化得到醛基修飾的寡核苷酸探針部分。將抗體用pH值為7.4的 PBS緩沖液稀釋后，與摩爾當量為抗體25倍的SANH溶液混合，室溫反應(yīng)2.5小時，再純化得到 肼基修飾的抗體部分。最后將摩爾比為(7-10): 1的寡核苷酸探針部分和抗體部分在室溫下 偶聯(lián)反應(yīng)得到所述通用型抗體-寡核苷酸探針。
[0030]以下通過實施例1來進行進一步說明，其余未說明的具體條件及實驗方法，按照常 規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。
[0031 ]本實施例中所述的"室溫"是指常規(guī)的室內(nèi)溫度，一般為15_30°C。
[0032] 本實施例將序列為SEQ ID ^):(1-13)的01丨8〇簡寫為01丨8〇(1-13)，01丨8〇為寡核 苷酸。
[0033]本實施例中的PBS緩沖液為磷酸緩沖液，MES緩沖液為2-(N-嗎啉代）乙磺酸緩沖 液。
[0034]本實施例中的QPCR為實時熒光定量PCR。
[0035] 本實施例中的Nanodrop為分光光度計。
[0036] 本實施例中的BCA法是指蛋白質(zhì)濃度測定的定量方法。
[0037] 本實施例所用的緩沖液為:配置不同pH值的roS緩沖液，在本發(fā)明的【具體實施方式】 中，具體包括pH值為6.0的PBS緩沖液，以及pH值為7.4的PBS緩沖液，并且配置pH值為5.0的 MES緩沖液，過濾除菌處理，4 °C存放。
[0038]實施例1CK19-寡核苷酸探針 [0039] (1)寡核苷酸探針的醛基修飾
[0040] 將50nmol的Oligol(寡核苷酸）用0.1M的pH 7.4的磷酸緩沖液配置成溶液。稱取 500nmo 1的SFB(4-甲酰苯甲酸N-琥珀酰亞胺酯），用無水DMF(N，N-二甲基甲酰胺)溶解后，在 室溫反應(yīng)2.5h，過柱純化得到01ig〇-FB(醛基修飾的寡核苷酸）。
[0041 ] 檢測01ig〇-FB的濃度：用Nanodrop分光光度計檢測A·的值，計算Oligo-FB的濃度 為0·68nmol/yL〇
[0042]檢測醛基修飾率：用定量的2-肼吡啶-2-鹽酸鹽溶液檢測醛基修飾率。取上述 01ig〇-FB加入到2-肼吡啶-2-鹽酸鹽溶液中，振蕩混勻后于37°C反應(yīng)lh，用Nanodrop檢測 360nm處的吸光值為1 · 41，計算其修飾率，A36Q下的修飾率為0 · 85。
[0043] (2)抗體CK19的肼基修飾
[0044] 對抗體CK19進行脫鹽純化后用Nanodrop檢測抗體蛋白濃度為7.9mg/mL。
[0045]用pH值為7.4的磷酸緩沖液稀釋抗體CK19至濃度為2mg/mL。稱取25倍量的SANH(抗 體與SANH的摩爾比為1:25)，溶解在無水DMF中，再加入到抗體中，在室溫反應(yīng)2.5h，過柱純 化得到CK19-SANH(肼基修飾的CK19)。
[0046] 檢測CK19-SANH的濃度:通過BCA法計算修飾后的CK19-SANH的濃度為1.80mg/mL。
[0047]檢測肼基修飾率：用定量的2-甲酰苯磺酰鈉鹽溶液檢測肼基修飾率。取純化后的 抗體-SANH加入到的2-甲酰苯磺酰鈉鹽溶液中，渦旋混勻后于37°C反應(yīng)lh，Nanodrop檢測 348nm處的吸光值為0.43。通過348nm處的吸光值和CK19-SANH的濃度計算出CK19-SANH的肼 基修飾率為3.7。
[0048] (3)01ig〇-FB 與 CK19-SANH 的偶聯(lián)
[0049] 將01ig〇-FB與CK19-SANH按照摩爾比7:1混合渦旋混勻，室溫反應(yīng)4h，最后得到的 產(chǎn)物經(jīng)過過柱純化后即可得到所述通用型CK19-01igo探針。
[0050] 取CK19_01igo探針進行Nanodrop檢測。在354nm下有明顯吸收峰出現(xiàn)，說明Oligo- FB與CK19-SANH的偶聯(lián)成功。
[0051 ] 取CK19-01igo探針進行SDS-PAGE檢測，分析CK19與oligo偶聯(lián)程度，跟純的CK19比 較，得到多條電泳條帶，說明CK19上偶聯(lián)了不同數(shù)量的寡核苷酸。
[0052]取CK19-01igo探針進行BCA法濃度檢測。BCA法濃度檢測計算偶聯(lián)物抗體的濃度。 用單鏈定量試劑盒定量CK19-01igo中Oligol的濃度。可以計算出CK19與Oligol的比例，并 可以和修飾率結(jié)果比較。說明了CK19-01igo分子中Oligol與抗體的偶聯(lián)比，結(jié)果如表1所 不。
[0053] 表1 CK19-01igo分子中Oligo與抗體的偶聯(lián)比 [0054]
[0055] 實施例2 Oligo分子的QPCR擴增檢測
[0056]將01igo(l-13)分子分別稀釋至108分子數(shù)/μL。然后按照表2所示配置QPCR擴增反 應(yīng)液，得到各自的試劑盒。其中，延伸引物為RT-P，它的3'端末端與寡核苷酸的3'端互補配 對，5 '端可以形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，且中間序列與MGB探針(MGty)的序列互補即可，本實施例的RT-P以序列為SEQIDN0:14所示為例。正向引物為FP，反向序列為RP。FP以序列為SEQIDN0 : 15所示為例，RP以序列為SEQ ID N0:16所示為例，MGty以序列為SEQ ID N0:17所示為例，5' 端的熒光基團用FAM標記，3 '端為MGB。
[0057] 表2 Oligo分子的QPCR擴增試劑盒
[0059]然后按照表3的程序?qū)Ω髯缘脑噭┖蟹謩e進行QPCR擴增：
[0060] 表3 QPCR擴增程序
[0062]擴增結(jié)果如表4所示：
[0063]表4實施例2擴增結(jié)果
[0066] 從表4可以看出，加入了 RT-P后，短鏈的Oligo也可以進行有效的PCR擴增。這是因 為Oligo會先與RT-P進行延伸擴展，然后再以延伸擴展后的鏈為模板進行PCR擴增。
[0067]實施例3 Oligo分子的QPCR擴增特異性檢測
[0068] 將01ig〇l-13分子稀釋至濃度為25000分子數(shù)/μ1、83333分子數(shù)/μL和250000分子 數(shù)AU三個濃度。然后以01igol-3為例，將01ig〇l-3在相同濃度下混合，得到混合樣品Α、Β、 C，如表5所不。
[0069] 表5實施例3樣品配方
[0070]
[0071] 將上述樣品按照表2配置QPCR擴增試劑盒，然后按照表3所示的程序?qū)ligol-3進 行QPCR擴增，以及對混合樣品A、B、C中的01igol-3各自進行QPCR擴增，擴增結(jié)果的Ct值如表 6所示。所用的打^?、1^、1?^ 7均與實施例2相同，擴增是以延伸擴展后的0118〇1-3為模 板。
[0072] 表6擴增結(jié)果Ct值
[0074]從表6可以看出，混合樣品A、B、C中的01igol-3，在相同濃度下擴增的Ct值與單個 Oligo的擴增Ct值為0.1左右。同時，根據(jù)每條Oligo的不同濃度樣品繪出回歸直線，算得回 歸直線方程及相關(guān)系數(shù)R2如下：
[0075] 01igol:y = -3.3664x+40.11，R2 = 0.99937;
[0076] 01igo2：y = -3.384x+40.809,R2 = 0.99997；
[0077] 01ig〇3:y = -3.3824x+38.928，R2 = 0.99463。
[0078] 將每條Oligo對應(yīng)的A-C號樣品根據(jù)各個方程進行計算，算得分子數(shù)除以對應(yīng)理論 分子數(shù)，所得檢測效率如下：
[0080]因此，平行樣品間擴增Ct差值為0.1左右，檢測效率為98.5 %_110.5%之間，說明 三條Oligo分別與其余兩條沒有非特異性擴增，相互之間不會影響擴增效率。其余Oligo經(jīng) 鑒定可以得到同樣結(jié)果，說明本實驗設(shè)計的多條Oligo之間無交叉影響，可以保證多重PCR 的特異性、精確性和靈敏度。其他Oligo可以得到同樣的結(jié)論，由于篇幅原因不一一詳細說 明。
[0081 ] 實施例4制作標準曲線
[0082] 按照實施例1的步驟，用摩爾當量為5倍的SFB對01ig〇2進行修飾得到Oligo-FB，用 摩爾當量為10倍的SANH對CK19進行肼基修飾得到CK19-SANH，將摩爾比為10:1的01ig〇-FB 與CK19-SANH在室溫條件下反應(yīng)16小時后得到CK19-01igo2。
[0083] 按照實施例1的步驟，用摩爾當量為20倍的SFB對01igo3進行修飾得到01ig〇-FB， 用摩爾當量為50倍的SANH對CK19進行肼基修飾得到CK19-SANH，將摩爾比為8:1的01ig〇-FB 與CK19-SANH在室溫條件下反應(yīng)24小時后得到CK19-01igo3。
[0084] 將剩余01igo4-13都按照實施例1的步驟，得到CK19-01igo(4-13)。將CK19-01igo (1-13)按照表2的試劑盒和表3的程序進行QPCR擴增，得到的擴增結(jié)果與表4 一致，說明 01igol-13與CK19-01igo(l-13)的擴增效率一致，偶聯(lián)的抗體部分對Oligo的PCR擴增沒有 影響。
[0085] 用標準品稀釋液將CK19-01 igo 1稀釋成濃度為：833、2500、8333、25000、83333和 250000分子個數(shù)/2.5μ1，共六個濃度，空白對照組為去離子水。
[0086] 按照表2所示的配方配置PCR擴增試劑盒，然后按照表3所示的程序?qū)σ陨细鳚舛?的CK19-01igol以延伸擴展后的Oligol為模板進行QPCR擴增，將擴增結(jié)果根據(jù)CK19-01igol 的不同濃度，繪出標準曲線，進行線性回歸計算，得到回歸直線方程及相關(guān)系數(shù)如下：
[0087] y = -3.3353x+39.193,R2 = 0.99609〇
[0088] 實施例5細胞上抗原數(shù)量檢測
[0089] 為了計算每個細胞上抗原數(shù)量，設(shè)計如下實驗，以MCF-7細胞上的CK19抗原檢測為 例：
[0090] (1)所有1.5mlEP管使用反應(yīng)緩沖液包被15min。
[0091 ] (2)取新鮮培養(yǎng)的MCF-7細胞，消化后細胞計數(shù)，取1*105個細胞離心去上清。移出 上清，400μ1緩沖液重懸后加入100μ1 blocking DNA室溫封閉20min;
[0092] (3)加入CK19-01igol探針，室溫孵育40min后終止反應(yīng)并離心去上清。
[0093] (4)使用PBS洗滌細胞3遍后加入120μ1洗脫液混合均勻，冰上孵育2min，離心取100 μL上清，洗脫未反應(yīng)的CK19-01igol探針;最后加入20yL反應(yīng)中和液中和。
[0094] (5)用實施例4同樣條件進行QPCR擴增來檢測步驟(4)得到樣品Ct值，對應(yīng)實施例4 中的標準曲線Ct值即可計算獲得樣品中CK19-01igol的濃度(分子數(shù)）。將測得的總分子數(shù) 除以加入的細胞數(shù)可得到每個細胞上結(jié)合的分子數(shù)，結(jié)果為總CK19-01igol分子數(shù) 157589726.3個，每個細胞上CK19-01igol分子數(shù)為1575.9個。
[0095] 實驗所得每個細胞上結(jié)合的CK19-〇 1 igo分子數(shù)與通過western blot方法測定的 數(shù)據(jù)結(jié)果基本相同。
[0096] 實施例6循環(huán)腫瘤細胞(CTC)檢測的回收率
[0097] 回收率=(平均檢出細胞數(shù)量-陰性對照品細胞數(shù)量)/摻入的細胞數(shù)量* 100 % [0098]為了檢測循環(huán)腫瘤細胞(CTC)檢測的回收率，設(shè)計如下實驗，以MCF-7細胞檢測為 例：
[0099] (1)從健康人身上抽取的血液中每3ml中分別摻入0、1、10、50、100個1?^-7細胞，以 摻入0個MCF-7細胞的血液為陰性對照品，然后加入12mL細胞裂解液，輕輕顛倒充分混勻。然 后將樣品置于2_8°C冰箱中裂解15min后離心棄上清，加入lOmLPBS洗滌細胞;再離心棄上 清，再加入400yLPBS重懸細胞。
[0100] (2)加入100μΙ blocking buffer室溫封閉20min;加入CK19-01igol探針，室溫孵 育40min后終止反應(yīng)并離心去上清。
[0101] (3)使用PBS洗滌細胞3遍后加入120μ1洗脫液混合均勻，冰上孵育2min，離心取100 μL上清;洗脫未反應(yīng)的CK19-01igol探針;最后加入20yL反應(yīng)中和液中和。
[0102 ]按標曲計算MCF-7細胞個數(shù)，結(jié)果如表7所示：
[0103] 表7 CTC檢測回收率
[0106] 從表7可以看出，本發(fā)明的CK19_01igol探針檢測細胞回收率高于磁珠篩選的回收 率，并且靈敏度高。
[0107] 對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明實施例原理的前提下，還 可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也視為本發(fā)明實施例的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種通用型抗體-寡核苷酸探針，其特征在于:所述通用型抗體-寡核苷酸探針包括 寡核苷酸探針部分和抗體部分;所述寡核苷酸探針部分是將寡核苷酸的5'端進行醛基修飾 后得到的，所述抗體部分是將抗體進行肼基修飾后得到的；所述寡核苷酸探針部分和所述 抗體部分經(jīng)過偶聯(lián)得到所述通用型抗體-寡核苷酸探針。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的通用型抗體-寡核苷酸探針，其特征在于:所述寡核苷酸的長 度為16-22nt，5'端為6-14nt長度的引物識別序列，3'端用延伸引物進行延伸擴展。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的通用型抗體-寡核苷酸探針，其特征在于:所述延伸引物的長 度為50-80nt，它的3'端末端與寡核苷酸的3'端互補配對，5'端可以形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的通用型抗體-寡核苷酸探針，其特征在于:所述寡核苷酸探針 部分是將5 '端帶有氨基修飾的寡核苷酸，用摩爾當量為5-20倍的SFB進行醛基修飾后得到 的;所述抗體部分是將抗體用摩爾當量為10-50倍的SANH進行肼基修飾后得到的。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的通用型抗體-寡核苷酸探針，其特征在于:所述抗體-寡核苷酸 探針是將摩爾比為(7-10):1的寡核苷酸探針部分和抗體部分，在室溫條件下反應(yīng)4-24小時 后得到的。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的通用型抗體-寡核苷酸探針，其特征在于:所述寡核苷酸的序 列為SEQ ID NO: 1-13中所示的任一個。7. -種含有權(quán)利要求1所述通用型抗體-寡核苷酸探針的試劑盒，其特征在于:所述試 劑盒包括： 通用型抗體-寡核苷酸探針； 用于將通用型抗體-寡核苷酸探針進行PCR擴增的擴增引物及緩沖液； 還包括焚光探針。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于:所述擴增引物中包括一對用于將通用型 抗體-寡核苷酸探針進行PCR擴增的正向、反向引物;所述正向引物的5'端與寡核苷酸互補。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中還包括延伸引物，所述延 伸引物的長度為50_80nt，它的3 '端末端與寡核苷酸的3 '端互補配對，5 '端可以形成發(fā)卡結(jié) 構(gòu)。10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中的通用型抗體-寡核苷酸 探針為CK19-寡核苷酸探針。
【文檔編號】C12N15/11GK105886500SQ201610206089
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月5日
【發(fā)明人】陳昌岳, 李靜, 蔡紅東, 鄧文斌, 甘廣利, 張祥林
【申請人】上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司