一種hbv表面抗體時(shí)間分辨免疫熒光檢測(cè)試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明的一種HBV表面抗體時(shí)間分辨免疫熒光檢測(cè)試劑盒，本試劑盒采用的是時(shí)間分辨免疫熒光分析法，可有效地排除非特異性熒光的干擾，極大的提高了靈敏度；另外，本發(fā)明的包被反應(yīng)板的為完全不透光的板架和相應(yīng)配合的酶標(biāo)板組成，每個(gè)微孔之間完全無(wú)影響，使得陰性樣本與Blank的熒光本底大大降低，信噪比顯著提高，酶標(biāo)板包被采用特殊輻照，使得包被效果顯著提高，進(jìn)一步地提高了試劑盒的靈敏度；同時(shí)本試劑盒包被用的HBV表面抗原采用特定方法而獲得，亦提高了表面抗原的純度及得率，使得包被和檢測(cè)效果進(jìn)一步提高，使得本發(fā)明具有和進(jìn)口試劑盒相似甚至更高的檢測(cè)靈敏度，但成本遠(yuǎn)低于進(jìn)口試劑盒，適合規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】
一種HBV表面抗體時(shí)間分辨免疫熒光檢測(cè)試劑盒及其制備 方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及病毒蛋白免疫分析技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種HBV表面抗體時(shí)間分辨免 疫熒光檢測(cè)試劑盒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)是一種嗜肝病毒，是肝病毒家族的DNA逆 轉(zhuǎn)錄病毒，于1965年被丹娜發(fā)現(xiàn)，被稱之為丹式顆粒。主要存在于肝細(xì)胞并損害肝細(xì)胞，該 病原體可通過(guò)血液，母嬰和性傳播感染機(jī)體，引起肝細(xì)胞炎癥、壞死、纖維化，損害肝臟，弓丨 發(fā)乙型病毒性肝炎疾病，簡(jiǎn)稱乙肝。乙型病毒性肝炎分急性和慢性兩種。急性乙型肝炎在成 年人中90%可自愈，而慢性乙型肝炎表現(xiàn)不一，分為慢性乙肝攜帶者、慢性活動(dòng)性乙型肝 炎、乙肝肝硬化等。HBV在全世界范圍內(nèi)均有流行，據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，全球約有20億人感染過(guò)HBV病 毒，其中3億以上的人群為慢性HBV攜帶者，迄今為止，每年仍有近100萬(wàn)人死于HBV感染引起 的肝衰竭和肝癌。在我國(guó)，約有1億的HBV攜帶者，目前乙肝病毒攜帶率為7.18%，其中約三 分之一有反復(fù)肝損害，表現(xiàn)為活動(dòng)性的乙型肝炎或者肝硬化。乙肝流行范圍廣，治療困難， 對(duì)人體造成的危害大。首先，乙肝的傳染性極強(qiáng)。乙肝病毒由質(zhì)地堅(jiān)硬的外殼包被，保護(hù)病 毒不受外界惡劣環(huán)境侵害，使其生命力極其頑強(qiáng)，它可通過(guò)患者排出的各種體液傳染給健 康的人群。其次，乙肝的治愈非常困難，雖然現(xiàn)在市面上針對(duì)乙肝治療的藥品很多，但真正 治愈的特效藥品很少。此外，乙肝容易發(fā)生惡變，據(jù)統(tǒng)計(jì)，HBV攜帶者如果不加以治療， 31.6 %~60.1 %將會(huì)轉(zhuǎn)化成慢性肝炎，而20.8 %~56.3 %的慢性肝炎會(huì)惡化變成肝硬化， 肝硬化患者如不及時(shí)治療就會(huì)有16%~51.1%的患者轉(zhuǎn)化為肝癌，危及生命。乙肝還具有 突發(fā)性，乙肝病毒在人體內(nèi)存在，具有一定的潛伏期，不易被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)外界條件成熟，就可突 然間發(fā)作，并且不可抑制。對(duì)HBV的防治成為全世界亟待解決的問(wèn)題。在尚未找到較好的治 療方法之前，對(duì)乙肝病毒的預(yù)防就顯得尤為重要。乙肝疫苗的推廣應(yīng)用，使得乙肝病毒的感 染率逐年下降，對(duì)乙型肝炎的預(yù)防和控制起重要作用。
[0003] 乙型肝炎表面抗體是對(duì)乙肝病毒免疫的保護(hù)性抗體。它的陽(yáng)性表明既往感染過(guò)乙 肝病毒，但已經(jīng)排除病毒，或者接種過(guò)乙肝疫苗，產(chǎn)生了保護(hù)性抗體。血清中乙型肝炎表面 抗體滴度越高，保護(hù)力越強(qiáng)。乙型肝炎表面抗體是由乙型肝炎表面抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生，為保護(hù)性 抗體。在HBV感染恢復(fù)期或注射乙肝疫苗后出現(xiàn)，它的出現(xiàn)標(biāo)志對(duì)HBV感染產(chǎn)生特異性免疫。 乙型肝炎表面抗體是指動(dòng)物或人體抗乙型肝炎表面抗原產(chǎn)生的IgG、IgM等類型抗體的總 稱，廣泛應(yīng)用于乙型肝炎病毒鑒定、乙型肝炎疫苗以及乙型肝炎表面抗原的定性和定量檢 測(cè)中。
[0004] 近年來(lái)臨床上應(yīng)用較多的乙型肝炎病毒表面抗體免疫檢測(cè)方法主要有放射免疫 測(cè)定(Radioimmunoassay，RIA)、酶聯(lián)免疫分析法(Enzyme Immunoassay，EIA)、化學(xué)發(fā)光免 疫分析法（Chemilumineseent Immunoassay，CLIA)和時(shí)間分辨免疫焚光分析法（Time-resolved Immunofluorometric Assay，TRIFMA)〇
[0005] RIA臨床應(yīng)用較早，敏感性高，特異性好，結(jié)果可用儀器定量檢測(cè)。
[0006] EIA推廣應(yīng)用稍晚于RIA，其優(yōu)點(diǎn)在于其無(wú)污染、操作簡(jiǎn)單、試劑有效期長(zhǎng)、特異性 好以及結(jié)果可用儀器測(cè)定等特點(diǎn)。
[0007] CLIA的優(yōu)點(diǎn)在于其靈敏度高、線性范圍廣、便于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、產(chǎn)品有效期長(zhǎng)、對(duì)環(huán) 境無(wú)污染、對(duì)人體無(wú)毒無(wú)害等優(yōu)點(diǎn)。
[0008] RIA存在核輻射危害、有效期短、操作復(fù)雜、測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)和難于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等缺點(diǎn)。 EIA敏感性相對(duì)較低，測(cè)定范圍相對(duì)較窄等缺點(diǎn)，主要用于定性檢測(cè)，限制了其在微量免疫 定量分析中的應(yīng)用。由于大多數(shù)板式CLIA試劑盒仍采用EIA相同的酶促反應(yīng)，以辣根酶或堿 性磷酸酶交聯(lián)抗體，使用魯米諾或金剛烷等作為底物，檢測(cè)的是動(dòng)態(tài)發(fā)光，導(dǎo)致檢測(cè)信號(hào)值 衰減較快、高濃度和低濃度信號(hào)衰減速度不一致，限制了其在免疫定量分析中的低端檢測(cè) 靈敏度、穩(wěn)定性和重復(fù)性。TRIFMA靈敏度相對(duì)較高，特異性好，但是國(guó)內(nèi)應(yīng)用TRIFMA法的試 劑盒與和進(jìn)口試劑盒相比，普遍存在靈敏度不夠的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問(wèn)題提出的一種兼具操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異 性好、無(wú)污染特點(diǎn)，又能夠以較低成本具備和進(jìn)口發(fā)光試劑相似的檢測(cè)靈敏度的HBV表面抗 體時(shí)間分辨免疫熒光檢測(cè)試劑盒及其制備方法。
[0010] 為了實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施為：
[0011] 一種HBV表面抗體時(shí)間分辨免疫熒光檢測(cè)試劑盒，包括包被反應(yīng)板，還包括乙型肝 炎表面抗體校準(zhǔn)品、鑭系元素離子標(biāo)記的HBV表面抗原，所述包被反應(yīng)板包括相互配合的板 架和酶標(biāo)板，所述板架設(shè)有多個(gè)與酶標(biāo)板配合的通孔，所述酶標(biāo)板吸附有HBV表面抗原。 [0012]為了進(jìn)一步優(yōu)化上述技術(shù)方案，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施還包括：
[0013] 優(yōu)選地，上述的板架為完全不透光的材料制作，所述酶標(biāo)板為經(jīng)鈷60輻照30天后， HBV表面抗原使用緩沖液稀釋至l-5yg/mL后加入微孔反應(yīng)板內(nèi)，以IOOyL/孔包被過(guò)夜，然后 經(jīng)洗滌、封閉、干燥而獲得，其中HBV表面抗原為用鹽析離心法與疏水層析法相結(jié)合而獲得； 具體地，所述HBV表面抗原的具體制備方法為將重組抗原溶液按體積加10%硫酸銨沉淀，經(jīng) 0.65um濾芯除去細(xì)胞碎片后，經(jīng)層析柱分離獲得洗脫峰，洗脫峰經(jīng)溴化鉀等密度梯度超速 離心（1.04g/ml-l. 34g/ml)，30000r/min離心24h，用高比重頂液頂出，分部收集，將收集的 液體經(jīng)凝膠過(guò)濾層析，得到高純度的HBV表面抗原。所述酶標(biāo)板是經(jīng)過(guò)鈷60射線輻照后，微 孔表面發(fā)生了氧化，產(chǎn)生了某些含氧的活性基團(tuán)改善了對(duì)包被生物分子的親水性與化學(xué)反 應(yīng)性能，從而在不改變檢測(cè)的特異性但可明顯提高檢測(cè)的敏感性和均一性。
[0014] 進(jìn)一步地，上述的板架的高度和酶標(biāo)板完全匹配，使得板架和酶標(biāo)板組合后，不同 微孔之間完全沒(méi)有光線的相互干擾，板架的高度優(yōu)選為1-1.5cm，板架上的通孔的邊緣的相 互距離為0.6-1.2mm。
[0015] 進(jìn)一步地，本發(fā)明的試劑盒還包括緩沖液、洗滌液、熒光增強(qiáng)液。
[0016] 優(yōu)選地，所述鑭系元素離子為EU3+、Tb3+、Sm3+、D y3+中的至少一種，更優(yōu)選為EU3+。
[0017] 進(jìn)一步地，本發(fā)明的熒光增強(qiáng)液含有β-二酮類化合物或芳香胺類化合物。
[0018] 另一方面，本發(fā)明還提供制備上述試劑盒的方法，包括以下步驟：
[0019]步驟1制備預(yù)處理包被反應(yīng)板：
[0020]使用黑色聚苯乙烯制備板架，預(yù)留與酶標(biāo)板相互配合的通孔;酶標(biāo)板經(jīng)過(guò)鈷60輻 照30天后，與板架配合組裝，獲得預(yù)處理包被反應(yīng)板，備用；
[0021 ]步驟2包被HBV表面抗原反應(yīng)板的獲得：
[0022]用鹽析離心法與疏水層析法相結(jié)合獲得HBV表面抗原，使用鹽析離心法與疏水層 析法相結(jié)合制備抗原具有無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。鹽析離心法收率高，但由于大量使用長(zhǎng)時(shí)間的 超速離心，純化周期較長(zhǎng)，由于超速離心機(jī)轉(zhuǎn)頭壽命有限，費(fèi)用較高;疏水層析法純度高，但 收率較低，本發(fā)明在制備HBV表面抗原時(shí)，結(jié)合2種方法的優(yōu)點(diǎn)，大大提高了表面抗原的純度 及得率。將獲得的表面抗原使用緩沖液稀釋至l-5yg/mL后加入步驟1獲得的預(yù)處理包被反 應(yīng)板的酶標(biāo)板微孔內(nèi)，以IOOyL/孔包被過(guò)夜，然后經(jīng)洗滌、封閉、干燥，將微孔板條真空密封 于鋁箱袋內(nèi)，冷藏備用；
[0023]步驟3鑭系元素離子標(biāo)記的HBV表面抗原的獲得：
[0024]將另一種具有和包被抗原所不同的抗原表位的HBV表面抗原經(jīng)緩沖液透析后，與 鑭系元素離子以10:1的比例混合，靜置24±2小時(shí)后經(jīng)Sephacryl S-50分離柱分離，獲得鑭 系元素離子標(biāo)記的HBV表面抗原；
[0025] 步驟4乙型肝炎表面抗體校準(zhǔn)品的獲得:采用WHO Anti-HBs國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品配制的線 性系列來(lái)標(biāo)定陽(yáng)性血衆(zhòng)制備的抗-HBs企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品，使用經(jīng)標(biāo)化的抗-HBs企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定 抗-HBs多抗，然后稀釋成0，5，10，50，250，1000mIU/ml的乙型肝炎表面抗體校準(zhǔn)品；
[0026] 步驟5熒光增強(qiáng)液的配制：以無(wú)水乙醇溶解β-ΝΤΑ、Τ0Ρ0,再加入令苯二甲酸氫鉀和 三蒸水，40°C溶解后，加入乙酸、Ttiton Χ-100,調(diào)PH至3.2,定容后保存?zhèn)溆茫?br>[0027]步驟6組裝各個(gè)組分，獲得HBV表面抗體時(shí)間分辨免疫熒光檢測(cè)試劑盒。
[0028]優(yōu)選地，所述鑭系元素離子為Eu3+。
[0029] 本發(fā)明采用上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下技術(shù)效果：
[0030] 本發(fā)明的試劑盒采用表面抗原包被反應(yīng)孔，用銪標(biāo)記表面抗原，加入校準(zhǔn)品及待 測(cè)樣本后，樣本中表面抗體與包被于微孔表面抗原結(jié)合成抗-HBs-HBsAg復(fù)合物，洗滌后，再 加入銪標(biāo)記表面抗原(HBsAg-Eu) ,HBsAg-Eu與結(jié)合在板上的抗-HBs反應(yīng)，在微孔中形成免 疫復(fù)合物:HBsAg-抗-HBs-HBsAg-Eu。洗滌除去游離的銪標(biāo)記表面抗原，加入增強(qiáng)液將復(fù)合 物上的Eu3+解離到溶液中，并與增強(qiáng)液中的有效成份形成高熒光強(qiáng)度的螯合物，其熒光強(qiáng) 度和樣品中的抗-HBs濃度成正比。通過(guò)劑量一反應(yīng)曲線得出樣本抗-HBs的濃度值。
[0031] 本試劑盒采用的是時(shí)間分辨免疫熒光分析法，應(yīng)用鑭系元素作為示蹤劑，標(biāo)記抗 原或抗體，根據(jù)鑭系元素螯合物的發(fā)光特點(diǎn)，用時(shí)間分辨技術(shù)測(cè)量熒光。同時(shí)檢出波長(zhǎng)和時(shí) 間兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行信號(hào)分辨，可有效地排除非特異性熒光的干擾，極大的提高了靈敏度；另 外，本發(fā)明的包被反應(yīng)板的為完全不透光的板架和相應(yīng)配合的酶標(biāo)板組成，每個(gè)微孔之間 完全無(wú)影響，使得陰性樣本與Blank的熒光本底大大降低，信噪比顯著提高，酶標(biāo)板包被采 用特殊輻照，使得包被效果顯著提高，進(jìn)而進(jìn)一步地提高了試劑盒的靈敏度；同時(shí)本試劑盒 包被用的HBV表面抗原采用特定的鹽析離心法與疏水層析法相結(jié)合的方法而獲得，亦大大 提高了表面抗原的純度及得率，使得包被和檢測(cè)效果進(jìn)一步提高，使得本發(fā)明具有和進(jìn)口 試劑盒相似甚至更高的檢測(cè)靈敏度，但成本遠(yuǎn)低于進(jìn)口試劑盒。
【附圖說(shuō)明】
[0032] 圖1為利用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行HBV表面抗體檢測(cè)的檢測(cè)原理示意圖；
[0033] 圖2為實(shí)施例三中本發(fā)明的試劑盒與雅培試劑線性范圍內(nèi)樣本測(cè)值散點(diǎn)圖直線回 歸分析；
[0034] 圖3為實(shí)施例三中本發(fā)明的試劑盒與雅培試劑全部樣本測(cè)值線性回歸分析。
[0035] 圖4為本發(fā)明的試劑盒中包被反應(yīng)板的板架示意圖；
[0036] 圖5為發(fā)明的試劑盒中包被反應(yīng)板的整體示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0037]本發(fā)明提供了一種HBV表面抗體時(shí)間分辨免疫熒光檢測(cè)試劑盒，還包括乙型肝炎 表面抗體校準(zhǔn)品、鑭系元素離子標(biāo)記的HBV表面抗原，所述包被反應(yīng)板包括相互配合的板架 和酶標(biāo)板，所述板架設(shè)有多個(gè)與酶標(biāo)板配合的通孔，所述酶標(biāo)板吸附有HBV表面抗原。
[0038] 下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)和具體的介紹，以使更好的理解本發(fā)明， 但是下述實(shí)施例并不限制本發(fā)明范圍。
[0039] 實(shí)施例一 HBV表面抗體時(shí)間分辨免疫熒光檢測(cè)試劑盒的制備
[0040] 使用Eu3+作為熒光標(biāo)記物制備試劑盒，具體操作如下：
[0041]步驟1制備預(yù)處理包被反應(yīng)板：
[0042]使用黑色聚苯乙烯制備板架，預(yù)留與酶標(biāo)板相互配合的通孔(如附圖4所示）；酶標(biāo) 板經(jīng)過(guò)鈷60輻照30天后，與板架配合組裝(如附圖5所示），獲得預(yù)處理包被反應(yīng)板，備用； [0043]步驟2包被HBV表面抗原反應(yīng)板的獲得：
[0044] 用鹽析離心法與疏水層析法相結(jié)合獲得HBV表面抗原，將重組抗原溶液按體積加 10 %硫酸銨沉淀，經(jīng)0.65um濾芯除去細(xì)胞碎片后，經(jīng)層析柱分離獲得洗脫峰，洗脫峰經(jīng)溴化 鉀等密度梯度超速離心（1.04g/ml-l. 34g/ml)，30000r/min離心24h，用高比重頂液頂出，分 部收集，將收集的液體經(jīng)凝膠過(guò)濾層析，得到高純度的HBV表面抗原;將獲得的HBV表面抗原 使用緩沖液稀釋至Hyg/mL后加入步驟1獲得的預(yù)處理包被反應(yīng)板的酶標(biāo)板微孔內(nèi)，以100 μ!7孔包被過(guò)夜，然后經(jīng)洗滌、封閉、干燥，將微孔板條真空密封于鋁箱袋內(nèi)，冷藏備用；
[0045] 步驟3鑭系元素離子標(biāo)記的HBV表面抗原的獲得：
[0046]將HBV表面抗原經(jīng)緩沖液透析后，與鑭系元素離子以10:1的比例混合，靜置24±2 小時(shí)后經(jīng)SephacryI S-50分咼柱分咼，獲得鑭系兀素咼子標(biāo)記的HBV表面抗原；
[0047] 步驟4乙型肝炎表面抗體校準(zhǔn)品的獲得:采用WHO Anti-HBs國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品配制的線 性系列來(lái)標(biāo)定陽(yáng)性血衆(zhòng)制備的抗-HBs企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品，使用經(jīng)標(biāo)化的抗-HBs企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定 抗-HBs多抗，然后稀釋成0，5，10，50，250，1000mIU/ml的乙型肝炎表面抗體校準(zhǔn)品；
[0048] 步驟5熒光增強(qiáng)液的配制：以無(wú)水乙醇溶解β-ΝΤΑ、Τ0Ρ0,再加入令苯二甲酸氫鉀和 三蒸水，40°C溶解后，加入乙酸、Ttiton Χ-100,調(diào)PH至3.2,定容后保存?zhèn)溆茫?br>[0049] 上述組分制備完畢后，加入緩沖液、洗滌液等其他試劑盒組分，制備得到HBV表面 抗體時(shí)間分辨免疫熒光檢測(cè)試劑盒。
[0050] 實(shí)施例二應(yīng)用本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)乙肝表面抗體 [0051 ] 具體操作如下：
[0052] 1.加樣:吸取IOOyL Anti-HBs校準(zhǔn)品、待檢樣本，按順序加入微孔中。
[0053] 2.第一次孵育:微孔反應(yīng)條在室溫條件下，用振蕩儀緩慢振蕩孵育40分鐘。
[0054] 3.第一次洗板:將微孔反應(yīng)條放入洗板機(jī)吸干各孔并每孔注入工作洗滌液400yL， 再吸干各孔，重復(fù)以上洗滌2次。
[0055] 4.加銪標(biāo)記物工作液:每孔加入IOOyL銪標(biāo)記物工作液。
[0056] 5.第二次孵育:微孔反應(yīng)條在室溫條件下，用振蕩儀緩慢振蕩孵育40分鐘。
[0057] 6.第二次洗板:將微孔反應(yīng)條放入洗板機(jī)吸干各孔并每孔注入工作洗滌液400yL， 再吸干各孔，重復(fù)以上洗滌6次。
[0058] 7.加增強(qiáng)液:每孔加入增強(qiáng)液100yL。
[0059] 8.檢測(cè):微孔反應(yīng)條在室溫下，用振蕩儀緩慢振蕩5分鐘。
[0060] 9.濃度計(jì)算:使用6個(gè)校準(zhǔn)品作出劑量反應(yīng)曲線，校準(zhǔn)品復(fù)孔使用以保證準(zhǔn)確性。 樣本中Anti-HBs濃度通過(guò)標(biāo)定曲線得出。
[0061] 實(shí)施例三本發(fā)明的試劑盒與進(jìn)口發(fā)光試劑盒的比較
[0062] 利用本發(fā)明的HBV表面抗體時(shí)間分辨免疫焚光檢測(cè)試劑盒(時(shí)間分辨免疫焚光分 析法)與美國(guó)Abbott公司乙型肝炎病毒表面抗體定量測(cè)定試劑盒(化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢 測(cè)法)在三家醫(yī)院同時(shí)檢測(cè)了 1106例臨床樣本，其中包括陽(yáng)性樣本618例，陰性樣本488例 (其中包括干擾樣本 107 例）。干擾因素包括 HCV/CMV/HBsAg/HAV/ANA/TP/RF/HIV/EB/TOXO/ Rubella以及孕婦樣本(即HCG或THCG陽(yáng)性）。
[0063] 線性范圍內(nèi)陽(yáng)性樣本測(cè)值線性回歸分析:本次臨床研究共檢測(cè)618例陽(yáng)性樣本，其 中614例檢測(cè)結(jié)果在兩方試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)，對(duì)614例樣本檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行線性回歸及定量相 關(guān)性分析，以參比試劑的測(cè)定數(shù)值為橫坐標(biāo)，考核試劑的測(cè)定數(shù)值為縱坐標(biāo)，使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸及相關(guān)性分析。614例兩方試劑測(cè)值散點(diǎn)圖直線回 歸分析見(jiàn)圖2，線性回歸方程為y = 11.0937+0.9969x，線性回歸系數(shù)為0.9969，相關(guān)系數(shù)r = 0.9464，P<0.0001，說(shuō)明兩組數(shù)據(jù)具有直線相關(guān)關(guān)系，且相關(guān)程度較高。
[0064]全部樣本測(cè)值線性回歸分析:三家醫(yī)院臨床研究共檢測(cè)有效樣本1106例，對(duì)兩方 試劑檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行線性回歸及定量相關(guān)性分析，以參比試劑的測(cè)定數(shù)值為橫坐標(biāo)，考核試 劑的測(cè)定數(shù)值為縱坐標(biāo)，使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸及相關(guān)性分析。 1106例考核試劑批次1與對(duì)比試劑兩個(gè)批次測(cè)值散點(diǎn)圖直線回歸分析見(jiàn)圖3,線性回歸方程 為y = 18.6793+0.9753x，線性回歸系數(shù)為0.9753，相關(guān)系數(shù)r為0.9542，P<0.0001，說(shuō)明兩組 數(shù)據(jù)具有直線相關(guān)關(guān)系，且相關(guān)程度較高。
[0065]定性結(jié)果的一致性分析
[0066] 將Abbott濃度計(jì)算值大于等于lOmIU/mL的結(jié)果判定為參比試劑的反應(yīng)性（陽(yáng)性）， 小于lOmIU/mL的結(jié)果判定為參比試劑的非反應(yīng)性（陰性）；將本發(fā)明試劑盒測(cè)定的濃度計(jì)算 值大于等于lOmIU/mL的結(jié)果判定為考核試劑的反應(yīng)性（陽(yáng)性），小于lOmIU/mL的結(jié)果判定為 考核試劑的非反應(yīng)性（陰性）。對(duì)兩個(gè)批次的考核試劑及對(duì)比試劑的檢測(cè)結(jié)果兩兩之間進(jìn)行 四格表分析，結(jié)果如下表1所示：
[0067]表 1
[0069]被考核試劑盒，即本發(fā)明的HBV表面抗體時(shí)間分辨免疫熒光檢測(cè)試劑盒，相比對(duì)比 試劑，根據(jù)四格表計(jì)算本發(fā)明的試劑盒各項(xiàng)性能指標(biāo)，結(jié)果如下(95%置信區(qū)間）：
1_0071」配對(duì)四格表卡方檢驗(yàn)(McNemar檢驗(yàn))p值=1.0000>0.05，表明兩種試劑盒的檢測(cè) 結(jié)果差異無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0072] 綜上所述，本試劑盒采用時(shí)間分辨免疫熒光分析法，應(yīng)用鑭系元素作為示蹤劑，標(biāo) 記抗原或抗體，根據(jù)鑭系元素螯合物的發(fā)光特點(diǎn)，用時(shí)間分辨技術(shù)測(cè)量熒光。同時(shí)檢出波長(zhǎng) 和時(shí)間兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行信號(hào)分辨，可有效地排除非特異性熒光的干擾，極大的提高了靈敏度， 具有特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、精密度高、可測(cè)定范圍寬、試劑有效期長(zhǎng)、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)自動(dòng)化 程度高、數(shù)據(jù)自動(dòng)生成處理能力強(qiáng)、無(wú)環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn);本發(fā)明的試劑盒具備和進(jìn)口試劑盒 相似的檢測(cè)靈敏度，但成本遠(yuǎn)低于進(jìn)口發(fā)光試劑，適合規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用。
[0073] 以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限 制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和 替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和 修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種HBV表面抗體時(shí)間分辨免疫熒光檢測(cè)試劑盒，包括包被反應(yīng)板，其特征在于，還 包括乙型肝炎表面抗體校準(zhǔn)品、鑭系元素離子標(biāo)記的HBV表面抗原，所述包被反應(yīng)板包括相 互配合的板架和酶標(biāo)板，所述板架設(shè)有多個(gè)與酶標(biāo)板配合的通孔，所述酶標(biāo)板吸附有HBV表 面抗原。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的板架為完全不透光的材料制作， 所述酶標(biāo)板為經(jīng)鉆60福照30天后，HBV表面抗原使用緩沖液稀釋至l -5yg/mL后加入微孔反 應(yīng)板內(nèi)，以1 〇〇μL7孔包被過(guò)夜，然后經(jīng)洗滌、封閉、干燥而獲得，其中HBV表面抗原為用鹽析 離心法與疏水層析法相結(jié)合而獲得。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述HBV表面抗原的具體制備方法為將 HBV重組抗原溶液按體積加10 %硫酸銨沉淀，經(jīng)0.65um濾芯除去細(xì)胞碎片后，經(jīng)層析柱分離 獲得洗脫峰，洗脫峰經(jīng)溴化鉀等密度梯度30000r/min超速離心24h，用高比重頂液頂出，分 部收集，將收集的液體經(jīng)凝膠過(guò)濾層析，得到高純度的HBV表面抗原。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，還包括緩沖液、洗滌液、熒光增強(qiáng)液。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述鑭系元素離子為Eu3+、 Tb3+、Sm3+、Dy3+中的至少一種。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述鑭系元素離子為Eu3+。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述熒光增強(qiáng)液含有β-二酮類化合物或 芳香胺類化合物。8. -種制備如權(quán)利要求1所述的試劑盒的方法，其特征在于，包括以下步驟： 步驟1制備預(yù)處理包被反應(yīng)板： 使用黑色聚苯乙烯制備板架，預(yù)留與酶標(biāo)板相互配合的通孔;酶標(biāo)板經(jīng)過(guò)鈷60輻照30 天后，與板架配合組裝，獲得預(yù)處理包被反應(yīng)板，備用； 步驟2包被HBV表面抗原反應(yīng)板的獲得： 用鹽析離心法與疏水層析法相結(jié)合獲得HBV表面抗原，將獲得的表面抗原使用緩沖液 稀釋至l-5yg/mL后加入步驟1獲得的預(yù)處理包被反應(yīng)板的酶標(biāo)板微孔內(nèi)，以100μL孔包被 過(guò)夜，然后經(jīng)洗滌、封閉、干燥，將微孔板條真空密封于鋁箱袋內(nèi)，冷藏備用； 步驟3鑭系元素離子標(biāo)記的HBV表面抗原的獲得： 將另一種HBV表面抗原經(jīng)緩沖液透析后，與鑭系元素離子以10:1的比例混合，靜置24 土 2小時(shí)后經(jīng)Sephacryl S-50分咼柱分咼，獲得鑭系兀素咼子標(biāo)記的HBV表面抗原； 步驟4乙型肝炎表面抗體校準(zhǔn)品的獲得:采用WHO Anti-HBs國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品配制的線性系 列來(lái)標(biāo)定陽(yáng)性血衆(zhòng)制備的抗-HBs企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品，使用經(jīng)標(biāo)化的抗-HBs企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定抗-HBs 多抗，然后稀釋成〇，5，10，50，250，1000mIU/ml的乙型肝炎表面抗體校準(zhǔn)品； 步驟5熒光增強(qiáng)液的配制：以無(wú)水乙醇溶解β-ΝΤΑ、Τ0Ρ0,再加入令苯二甲酸氫鉀和三蒸 水，40°(：溶解后，加入乙酸、1'衍切11乂-100，調(diào)?!1至3.2，定容后保存?zhèn)溆茫? 步驟6組裝各個(gè)組分，獲得HBV表面抗體時(shí)間分辨免疫熒光檢測(cè)試劑盒。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述鑭系元素離子為Eu3+。
【文檔編號(hào)】G01N33/534GK105938146SQ201610255505
【公開(kāi)日】2016年9月14日
【申請(qǐng)日】2016年4月22日
【發(fā)明人】李楠, 黃加喜, 于春紅
【申請(qǐng)人】蘇州新波生物技術(shù)有限公司