一種酶催化制備n-溴乙酰-7-氨基頭孢烷酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于酶催化及生物制藥領(lǐng)域，公開了一種酶催化制備N?溴乙酰?7?氨基頭孢烷酸的方法，包括如下步驟：將7?氨基頭孢烷酸和酰基供體加入緩沖液中混合均勻后，再加入固定化青霉素?；高M(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)后經(jīng)分離得到N?溴乙酰?7?氨基頭孢烷酸。本發(fā)明方法具有反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好、工藝簡單，且目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】
一種酶催化制備N-溴乙酰-7-氨基頭孢烷酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于酶催化及生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種青霉素?；复呋苽銷-溴乙酰-7-氨基頭孢烷酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]頭孢硫脒是我國首個(gè)自主研發(fā)成功的半合成頭孢菌素。頭孢硫脒是一種廣譜抗菌劑，對(duì)大部分革蘭氏陽性菌、部分革蘭氏陰性菌均具有較強(qiáng)的殺滅作用，尤其是對(duì)腸球菌殺滅效果超過臨床所用同類品種。此外，頭孢硫脒還對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林表皮葡萄球菌感染也表現(xiàn)出一定的療效(中國抗生素雜志，2005,30(2): 107)。臨床研究表明，頭孢硫脒具有血藥濃度高、臨床療效好等特點(diǎn)。近年來，頭孢硫脒的市場呈穩(wěn)步增長的態(tài)勢。然而，當(dāng)前工業(yè)上頭孢硫脒仍采用化學(xué)法生產(chǎn)，包括兩步:(I)以7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)為原料，在低溫下加入高活性的溴乙酰溴，制備N-溴乙酰-7-ACA; (2)N_溴乙酰-7-ACA與N，N’_二異丙基硫脲縮合得到頭孢硫脒(中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1978，9(4):1)?；蛘咭月纫阴Ｂ忍娲逡阴ｄ?，通過類似的化學(xué)酰化及縮合工藝制備得到頭孢硫脒(中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2009，40(12):888;CN 102285999 B；CN 101486718 B)，但氯乙?；械穆然钚暂^低，導(dǎo)致第二步縮合反應(yīng)收率低，故在工業(yè)上，頭孢硫脒合成的第一步仍采用溴乙酰溴作為?；w。另一種合成頭孢硫脒的方法則是先合成側(cè)鏈I，3_二異丙基脒基-2-硫代-乙酸鹽酸鹽，然后再經(jīng)VilsmeieH式劑活化后，最后與帶有保護(hù)基的7-ACA縮合，脫保護(hù)后，得到頭孢硫脒(中國藥物化學(xué)雜志，2001，11 (5): 293 ;CN 101704827 B)；雖然該合成途徑路線的目標(biāo)產(chǎn)物收率相對(duì)較高(56%)，但其操作繁雜，條件較苛刻，所用硅烷化試劑昂貴，成本較高;并且活化過程需要采用三光氣和三苯基氧磷等高毒性活潑試劑，而且還要使用甲苯、二甲苯、氯苯、二氯苯等高毒性試劑。因此，化學(xué)法制備頭孢硫脒不僅需要使用高活性的?；w(酰氯或酰溴)、揮發(fā)性有機(jī)溶劑及堿，并且需要低溫反應(yīng)，其反應(yīng)條件苛刻、過程復(fù)雜、環(huán)境污染嚴(yán)重，不符合當(dāng)前可持續(xù)社會(huì)和環(huán)境發(fā)展的要求。此外，化學(xué)法制備頭孢硫脒關(guān)鍵中間體——N-溴乙酰-7-ACA的產(chǎn)率通常不理想，最高僅為73% (中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2010 27⑵:126)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種綠色、簡單且高效的酶催化制備N-溴乙酰-7-ACA的方法。
[0004]本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0005]—種酶催化制備N-溴乙酰-7-氨基頭孢烷酸(頭孢硫脒關(guān)鍵中間體)的方法，包括如下步驟:將7-ACA和?；w加入緩沖液中混合均勻后，再加入固定化青霉素?；高M(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)后經(jīng)分離得到N-溴乙酰-7-ACA。
[0006]所述?；w為溴乙酸烷基酯或溴乙酰胺。
[0007]所述溴乙酸烷基酯的烷基鏈長為Cl?C6。
[0008]所述溴乙酸烷基酯為溴乙酸甲酯或溴乙酸乙酯。
[0009]所述7-ACA 濃度為 20mM ?70mM。
[0010]所述7-ACA與?；w的摩爾比為1:1?1:6。
[0011 ] 反應(yīng)條件為溫度10°C?40°C，反應(yīng)時(shí)間Ih?24h，振蕩速度150r/min?300r/min。
[0012]所述固定化青霉素酰化酶的用量為2U/mL?5U/mL。
[0013]所述固定化青霉素酰化酶為青霉素G?；窱1、青霉素G酰化酶IV、青霉素?；窼IPA-1I1、青霉素酰化酶SIPA-1V、青霉素?；窼IPA-V或青霉素?；窹GA-750。
[0014]優(yōu)選地，所述7-ACA與?；w的摩爾比為1:2?1:3;所述固定化青霉素?；笧榍嗝顾仵；窹GA-750;酶用量為3U/mL?5U/mL;反應(yīng)時(shí)間為Ih?5h。
[0015]所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液，pH為5.0?9.0。
[0016]目標(biāo)產(chǎn)物分離方法為反應(yīng)結(jié)束后，過濾除酶，濾液中加入鹽酸調(diào)節(jié)pH至0.5?2.0，過濾、水洗、干燥，即得N-溴乙酰-7-ACA。
[0017]與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的優(yōu)點(diǎn):
[0018]I)采用高效的生物催化劑——青霉素酰化酶催化制備N-溴乙酰-7-ACA。
[0019]酶作為一種天然的生物催化劑能有效地降低反應(yīng)活化能，故僅需使用活性中等的溴乙酸烷基酯或溴乙酰胺等作為?；w，無需使用高活性的溴乙酰溴或氯乙酰氯，從而極大地提高了反應(yīng)的安全性。
[0020]2)酶是易生物降解的生物大分子，克服了化學(xué)催化劑環(huán)境不友好的缺點(diǎn)。
[0021]3)本發(fā)明反應(yīng)過程簡單易控，且以廉價(jià)易得、且環(huán)境友好的水溶液作為反應(yīng)介質(zhì)，無需使用有機(jī)溶劑。
[0022]4)本發(fā)明以固定化青霉素?；缸鳛榇呋瘎?，在反應(yīng)結(jié)束后可以通過簡單的過濾回收固定化酶，既可實(shí)現(xiàn)生物催化劑的重復(fù)利用，又易于產(chǎn)物的分離純化。
[0023]5)本發(fā)明反應(yīng)條件溫和，頭孢母核7-ACA在反應(yīng)過程中不易發(fā)生分解，故產(chǎn)品品質(zhì)尚O
【附圖說明】
[0024]圖1為反應(yīng)前液相色譜圖。
[°°25]圖2為反應(yīng)后液相色譜圖。
[0026]圖3為N-漠乙醜_7-ACA標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027]通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。
[0028]實(shí)施例1
[0029]在50mL帶蓋三角瓶中加入1mL磷酸鹽緩沖液(10mM,pH 7.5)、40mM7_ACA及120mM溴乙酸甲酯，混合均勻，隨后加入30U青霉素G?；窱I(購于石藥集團(tuán))，于20°C及200r/min下反應(yīng)。Ilh后，液相色譜分析表明N-溴乙酰-7-ACA產(chǎn)率為34%。
[0030]實(shí)施例2
[0031]在50mL帶蓋三角瓶中加入1mL磷酸鹽緩沖液(10mM,pH 7.5),40mM7_ACA及120mM溴乙酸甲酯，混合均勻，隨后加入30U青霉素G酰化酶IV(購于石藥集團(tuán))，于20°C及200r/min下反應(yīng)。7h后，液相色譜分析表明N-溴乙酰-7-ACA產(chǎn)率為32 %。
[0032]實(shí)施例3
[0033]在50mL帶蓋三角瓶中加入1mL磷酸鹽緩沖液(10mM,pH 7.5)、40mM7_ACA及120mM溴乙酸甲酯，混合均勻，隨后加入30U青霉素?；窹GA-750(購于浙江順風(fēng)海德爾有限公司)，于20°C及200r/min下反應(yīng)。3h后，液相色譜分析表明N-溴乙酰-7-ACA產(chǎn)率為91 %。反應(yīng)前后液相色譜圖分別如附圖1及附圖2所示，7-ACA和N-溴乙酰-7-ACA的保留時(shí)間分別為2.58及4.1Omin。隨后，過濾除酶，濾液中加入鹽酸調(diào)節(jié)pH至1.0，過濾、水洗、干燥，即得N-溴乙酰-740六，收率為88%。
[0034]實(shí)施例4
[0035]在50mL帶蓋三角瓶中加入1mL磷酸鹽緩沖液(10mM,pH 7.5),40mM7_ACA及120mM溴乙酸甲酯，混合均勻，隨后加入30U青霉素酰化酶SIPA-1IK購于湖南福來格生物技術(shù)有限公司)，于20°C及200r/min下反應(yīng)。Ilh后，液相色譜分析表明N-溴乙酰-7-ACA產(chǎn)率為32%。
[0036]實(shí)施例5
[0037]在50mL帶蓋三角瓶中加入1mL磷酸鹽緩沖液(10mM,pH 7.5)、40mM7_ACA及120mM溴乙酸甲酯，混合均勻，隨后加入30U青霉素?；窼IPA-1V(購于湖南福來格生物技術(shù)有限公司)，于20°C及200r/min下反應(yīng)。Ilh后，液相色譜分析表明N-溴乙酰-7-ACA產(chǎn)率為52%。
[0038]實(shí)施例6
[0039]在50mL帶蓋三角瓶中加入1mL磷酸鹽緩沖液(10mM,pH 7.5)、40mM7_ACA及120mM溴乙酸甲酯，混合均勻，隨后加入30U青霉素?；窼IPA-V(購于湖南福來格生物技術(shù)有限公司)，于20°(:及20(^/1^11下反應(yīng)。2411后，液相色譜分析表明1溴乙酰-7404產(chǎn)率為16%。
[0040]實(shí)施例7
[0041 ] 在50mL帶蓋三角瓶中加入1mL磷酸鹽緩沖液(10mM,pH 7.5),40mM7_ACA及120mM溴乙酸乙酯，混合均勻，隨后加入30U青霉素酰化酶PGA-750，于20°C及200r/min下反應(yīng)。5h后，液相色譜分析表明N-溴乙酰-7-ACA產(chǎn)率為87%。隨后，過濾除酶，濾液中加入鹽酸調(diào)節(jié)pH至1.0，過濾、水洗、干燥，即得N-溴乙酰-7-ACA，收率為85 %。
[0042]實(shí)施例8
[0043]在50mL帶蓋三角瓶中加入1mL磷酸鹽緩沖液(10mM,pH 7.5)、40mM7_ACA及120mM溴乙酰胺，混合均勻，隨后加入30U青霉素?；窹GA-750，于20°C及200r/min下反應(yīng)。5h后，液相色譜分析表明N-溴乙酰-7-ACA產(chǎn)率為84%。隨后，過濾除酶，濾液中加入鹽酸調(diào)節(jié)pH至1.0，過濾、水洗、干燥，即得N-漠乙醜-7-ACA，收率為83 %。
[0044]實(shí)施例9
[0045]在50mL帶蓋三角瓶中加入1mL磷酸鹽緩沖液(100mM，pH 7.5)、40mM7_ACA及40mM溴乙酸甲酯，混合均勻，隨后加入30U青霉素?；窹GA-750，于20°C及200r/min下反應(yīng)。Ih后，液相色譜分析表明N-溴乙酰-7-ACA產(chǎn)率為53%。
[0046]實(shí)施例10
[0047]在50mL帶蓋三角瓶中加入1mLTris-HCl緩沖液(10mM,pH 9.0)、40mM 7-ACA及120mM溴乙酸甲酯，混合均勻，隨后加入30U青霉素?；窹GA-750，于20°C及200r/min下反應(yīng)。2h后，液相色譜分析表明N-溴乙酰-7-ACA產(chǎn)率為88%。隨后，過濾除酶，濾液中加入鹽酸調(diào)節(jié)pH至1.0，過濾、水洗、干燥，即得N-溴乙酰-7-ACA，收率為88 %。
[0048]實(shí)施例11
[0049]在50mL帶蓋三角瓶中加入1mL磷酸鹽緩沖液(10mM,pH 7.5)、40mM7_ACA及120mM溴乙酸甲酯，混合均勻，隨后加入30U青霉素?；窹GA-750，于40°C及200r/min下反應(yīng)。Ih后，液相色譜分析表明N-溴乙酰-7-ACA產(chǎn)率為73%。
[0050]實(shí)施例12
[0051 ] 在50mL帶蓋三角瓶中加入1mL磷酸鹽緩沖液(10mM,pH 7.5)、40mM7-ACA&100mM溴乙酸甲酯，混合均勻，隨后加入30U青霉素?；窹GA-750，于20°C及200r/min下反應(yīng)。3h后，液相色譜分析表明N-溴乙酰-7-ACA產(chǎn)率為85%。隨后，過濾除酶，濾液中加入鹽酸調(diào)節(jié)pH至1.0，過濾、水洗、干燥，即得N-溴乙酰-7-ACA，收率為83 %。
[0052]實(shí)施例13
[0053]在50mL帶蓋三角瓶中加入1mL磷酸鹽緩沖液(10mM,pH 7.5)、60mM7_ACA及180mM溴乙酸甲酯，混合均勻，隨后加入30U青霉素?；窹GA-750，于20°C及200r/min下反應(yīng)。5h后，液相色譜分析表明N-溴乙酰-7-ACA產(chǎn)率為79 %。
[0054]實(shí)施例14
[0055]在50mL帶蓋三角瓶中加入1mL磷酸鹽緩沖液(10mM,pH 7.5)、50mM7_ACA及150mM溴乙酸甲酯，混合均勻，隨后加入40U青霉素?；窹GA-750，于20°C及200r/min下反應(yīng)。2h后，液相色譜分析表明N-溴乙酰-7-ACA產(chǎn)率為85%。隨后，過濾除酶，濾液中加入鹽酸調(diào)節(jié)pH至1.0，過濾、水洗、干燥，即得N-溴乙酰-7-ACA，收率為82 %。
[0056]對(duì)比例
[0057]在50mL帶蓋三角瓶中加入1mL磷酸鹽緩沖液(10mM,pH 7.5)、40mM7-ACA&100mM溴乙酸甲酯，混合均勻，于20 °C &200r/min下反應(yīng)。24h后，仍未見目標(biāo)產(chǎn)物N-溴乙酰-7-ACA生成。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種酶催化制備N-溴乙酰-7-氨基頭孢烷酸的方法，其特征在于，包括如下步驟:將7-氨基頭孢烷酸和?；w加入緩沖液中混合均勻后，再加入固定化青霉素?；高M(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)后經(jīng)分離得到N-溴乙酰-7-氨基頭孢烷酸。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述?；w為溴乙酸烷基酯或溴乙酰胺。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述溴乙酸烷基酯的烷基鏈長為Cl?C6。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述溴乙酸烷基酯為溴乙酸甲酯或溴乙酸乙酷。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述7-氨基頭孢烷酸濃度為20mM?70mM。6.根據(jù)權(quán)利要求1?5任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述7-氨基頭孢烷酸與?；w的摩爾比為1:1?1:6。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，反應(yīng)條件為溫度10°C?40°C，反應(yīng)時(shí)間Ih?24h，振蕩速度 150r/min ?300r/min。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述固定化青霉素酰化酶的用量為2U/mL?5U/mL;所述固定化青霉素?；笧榍嗝顾谿酰化酶I1、青霉素G酰化酶IV、青霉素?；窼IPA-1I1、青霉素?；窼IPA-1V、青霉素?；窼IPA-V或青霉素酰化酶PGA-750。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述7-氨基頭孢烷酸與酰基供體的摩爾比為1:2?1:3;所述固定化青霉素?；笧榍嗝顾仵；窹GA-750;酶用量為3U/mL?5U/mL;反應(yīng)時(shí)間為Ih?5h。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液，pH為5.0?9.0。
【文檔編號(hào)】C12P35/04GK105907829SQ201610392858
【公開日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年6月6日
【發(fā)明人】李寧, 張曉利, 宗敏華, 羅春
【申請(qǐng)人】華南理工大學(xué), 廣州白云山醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司白云山化學(xué)制藥廠