一種利用南極磷蝦制備轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)移酶，尤其是一種利用南極磷蝦制備轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶是一種廣泛存在于動(dòng)物組織和人體液體內(nèi)的一類酶，它可以催化蛋白質(zhì)分子之間，多肽及各種伯胺之間的共價(jià)交聯(lián)聚合，它與血液凝固、傷口愈合、表皮角質(zhì)化、紅細(xì)胞膜硬化等多種生物現(xiàn)象有關(guān)。近年來(lái)，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶已經(jīng)引起了廣大技術(shù)人員的興趣，其在食品行業(yè)、酶的固定化和紡織工業(yè)有很大的應(yīng)用潛力。
[0003]目前，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的提取方法主要有從動(dòng)植物組織中提取和由微生物發(fā)酵法生產(chǎn)。其中，由微生物發(fā)酵法生產(chǎn)最為廣泛，但是條件難控制，且由微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶無(wú)法達(dá)到從動(dòng)植物組織中提取的生物活性的強(qiáng)度?，F(xiàn)有技術(shù)中有從豚鼠和魚(yú)組織中制備轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的，但其研究仍處于初級(jí)階段。
[0004]南極磷蝦的營(yíng)養(yǎng)豐富，是高蛋白質(zhì)食物。到目前為止，還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)從南極磷蝦中制備轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種制備方法合理、制備速度快、操作簡(jiǎn)單、得物純度高的利用南極磷蝦制備轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的方法。
[0006]本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為:一種利用南極磷蝦制備轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的方法，其特征在于:其經(jīng)過(guò)下列工藝步驟:
(1)原料處理:選取南極磷蝦為原料，用清水洗凈，切碎，加入緩沖液，進(jìn)行勻漿，離心，收集清液；其中，所述的緩沖液與南極磷蝦的比例為1: 2?3(m/v);
(2)過(guò)濾:將步驟(1)中得到的清液采用醋酸纖維膜過(guò)濾，收集濾液；
(3)透析:將步驟(2)中得到的濾液采用醋酸鈉透析液進(jìn)行透析，其中，濾液與醋酸鈉透析液體積比為1:20?30，4°C透析過(guò)夜，得南極磷蝦蛋白質(zhì)粗提液；
(4)超濾:將步驟(3)中得到的南極磷蝦粗提液采用分子截留量為10000道爾頓的超濾設(shè)備進(jìn)行超濾分離，截留包括小分子蛋白質(zhì)在內(nèi)的雜質(zhì)，得南極磷蝦蛋白質(zhì)濾過(guò)液；
(5)離子交換層析純化:將步驟(4)中得到的南極磷蝦蛋白質(zhì)濾過(guò)液采用強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂進(jìn)行離子交換層析，采用洗脫液洗脫，收集吸收峰，得轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶純化液；
(6)超濾濃縮:將步驟(5)中得到的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶純化液經(jīng)過(guò)分子截留量為10000道爾頓的超濾設(shè)備進(jìn)行超濾濃縮，得轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶濃縮液；
(7)冷凍干燥:將步驟￠)中得到的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶濃縮液用80?90%乙醇沉降，離心，收集沉淀；將沉淀冷凍干燥，得純化的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。
[0007]所述的勻漿是將加入緩沖液的南極磷蝦送入勻漿機(jī)，控制轉(zhuǎn)速4000?6000r/min，勾楽 10 ?30min。
[0008]所述的離心是將勾楽后的南極磷?!下送入離心機(jī)，控制轉(zhuǎn)速6000?8000r/min，離心 10 ?15min。
[0009]所述的緩沖液是將8mM NaCl與15mM Tris-HCl溶于1000ml去離子水中制成。
[0010]所述的醋酸鈉透析液是將20mM醋酸鈉、45mM NaCl、2mM EDTA與0.5mM DTT溶于1000ml去離子水中，調(diào)節(jié)pH值為6.5制成。
[0011 ]所述洗脫液是 0.2mol/L 的 Tris-HCl。
[0012]本發(fā)明對(duì)清洗過(guò)的南極磷蝦切碎加入緩沖液進(jìn)行勻漿，離心，取清液用醋酸纖維膜過(guò)濾去除上層濁液，得到的濾液用醋酸鈉透析液對(duì)其進(jìn)行透析，再采用超濾設(shè)備進(jìn)行超濾，濾過(guò)液經(jīng)過(guò)離子交換樹(shù)脂層析純化后，將得到的純化液超濾濃縮，冷凍干燥，即得純化的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。本發(fā)明在制備過(guò)程中采用醋酸纖維膜過(guò)濾，能夠保證吸附量最低，不會(huì)吸附目的蛋白；采用了離子交換層析，靈敏度高，重復(fù)性、選擇性好，分析速度快；采用了兩次超濾，既能使樣品得到濃縮，又能去除雜質(zhì)。本發(fā)明的利用南極磷蝦制備轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的方法，其制備工藝合理，操作簡(jiǎn)單，制備速度快，提取得到的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶純度較高，經(jīng)測(cè)定，其酶活回收率為75?85%。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
[0014]實(shí)施例1
一種利用南極磷蝦制備轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的方法，其經(jīng)過(guò)下列工藝步驟:
(1)原料處理:選取南極磷蝦為原料，用清水洗凈，切碎，加入緩沖液，送入到勻漿機(jī)中，控制轉(zhuǎn)速6000r/min，勾楽20min ;勾楽后的南極磷4下送入離心機(jī)，控制轉(zhuǎn)速8000r/min，離心lOmin ;去除雜質(zhì)，收集清液；其中，緩沖液是將8mM NaCl與15mM Tris-HCl溶于1000ml去離子水中制備而成，緩沖液與南極磷蝦的比例為1: 2.5(m/v);
(2)過(guò)濾:將步驟(1)中得到的清液采用醋酸纖維膜過(guò)濾，去除上層濁液，收集濾液；
(3)透析:將步驟(2)中得到的濾液采用醋酸鈉透析液進(jìn)行透析，其中，醋酸鈉透析液是將20mM醋酸鈉、45mM NaCl、2mM EDTA與0.5mM DTT溶于1000ml去離子水中，調(diào)節(jié)pH值為6.5制備而成；濾液與醋酸鈉透析液體積比為1:25，4°C透析過(guò)夜，得南極磷蝦蛋白質(zhì)粗提液；
(4)超濾:將步驟(3)中得到的南極磷蝦粗提液采用分子截留量為10000道爾頓的超濾設(shè)備進(jìn)行超濾分離，截留包括小分子蛋白質(zhì)在內(nèi)的雜質(zhì)，得南極磷蝦蛋白質(zhì)濾過(guò)液；
(5)離子交換層析純化:將步驟(4)中得到的南極磷蝦蛋白質(zhì)濾過(guò)液采用GE公司的強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂進(jìn)行離子交換層析，利用0.2mol/L的Tris-HCl作為洗脫液進(jìn)行洗脫，收集吸收峰，得轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶純化液；
(6)超濾濃縮:將步驟(5)中得到的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶純化液經(jīng)過(guò)分子截留量為10000道爾頓的超濾設(shè)備進(jìn)行超濾濃縮，得轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶濃縮液；
(7)冷凍干燥:將步驟￠)中得到的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶濃縮液用85%乙醇沉降，離心，收集沉淀；將沉淀冷凍干燥，得純化的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。
[0015]本實(shí)施例所提供的利用南極磷蝦制備轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的方法，其工藝合理，操作簡(jiǎn)單，分離純化速度快，提取得到的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶純度較高。經(jīng)測(cè)定，其酶活回收率為82.5%。
[0016]實(shí)施例2 一種利用南極磷蝦制備轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的方法，其經(jīng)過(guò)下列工藝步驟:
(1)原料處理:選取南極磷蝦為原料，用清水洗凈，切碎，加入緩沖液，送入到勻漿機(jī)中，控制轉(zhuǎn)速5000r/min，勾楽lOmin ;勾楽后的南極磷好送入離心機(jī)，控制轉(zhuǎn)速7000r/min，離心12min ;去除雜質(zhì)，收集清液；其中，緩沖液是將8mM NaCl與15m