一種具有熱療效應的基因載體的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種具有熱療效應的基因載體的制備方法，屬于生物工程技術領域。首先制備金納米籠；然后采用4，4’?二硫代二丁酸、1?乙基?(3?二甲基氨基丙基)碳二亞胺、N?羥基丁二酰亞胺和聚乙烯亞胺發(fā)生酰胺化反應，得到不溶于水的似凝膠材料，將似凝膠材料與巰基乙醇反應得到一端帶有巰基、另一端接枝聚乙烯亞胺的陽離子聚合物；最后將得到的金納米籠與制備的陽離子聚合物混合，對金納米籠進行表面修飾，再經(jīng)過離心和清洗后，即得到具有熱療效應的基因載體。本發(fā)明制備的載體與質(zhì)粒DNA形成的復合物具有細胞毒性低，轉染效率高等優(yōu)點，同時該載體還具有熱效應，可以實現(xiàn)熱療和基因治療的雙重效果。
【專利說明】
一種具有熱療效應的基因載體的制備方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種新型的具有熱療效應的基因載體的制備方法，具體涉及一種以金 納米籠作為母體，表面接枝修飾陽離子聚合物聚乙烯亞胺來構建新型非病毒基因載體的方 法。這種載體具有基因治療和熱治療的雙重療效，屬于生物工程技術領域。
【背景技術】
[0002] 基因治療是指在基因水平上對遺傳缺陷進行糾正，主要通過引入外源基因以糾正 或補償基因的缺陷，關閉或抑制基因的異常表達，從而達到治療疾病的目的。它作為一種全 新的、革命性的治療手段，其臨床應用范圍不斷被擴大，主要體現(xiàn)在癌癥治療研究上。為提 高基因藥物的穩(wěn)定性、靶向性和轉染效率，研究者大多都基于病毒如腺病毒、逆轉錄病毒等 構建基因載體。雖然采用病毒作為載體，其轉染效率高，但仍存在自身免疫原性和生物安全 性等問題。例如，世界上第一個基因新藥一一Gendi Cine("今又生"），就是以腺病毒作為p53 基因載體，臨床使用過程中病人會出現(xiàn)寒戰(zhàn)、高熱和應激性過敏等不良反應，同時對免疫抑 制的患者來說，有可能引起更嚴重后果，如誘導基因突變致癌或致死等。正是由于病毒載體 的這些缺點驅(qū)使人們迫切尋找一種非病毒載體來負載基因。
[0003] 常見的非病毒載體包括陽離子脂質(zhì)體、陽離子聚合物和陽離子多肽分子或蛋白質(zhì) 等。非病毒載體依賴于DNA與陽離子聚合物或質(zhì)粒之間的非共價鍵組裝來負載基因。其中， 陽離子脂質(zhì)體具有類似細胞膜的雙層結構，可與細胞膜上陰離子成分"電子配對"，短暫性 破壞細胞膜而成功將基因載入細胞內(nèi)。陽離子聚合物通過靜電吸附帶有負電荷的DNA來負 載基因。基于陽離子聚合物的載體其制備的可操作性強，可以在同一個分子上加上多個功 能基團使其在基因載體方面有著廣泛的應用?，F(xiàn)有的聚陽離子其效能低，且會導致生理缺 陷，因此需對其進行修飾。
[0004]聚乙烯亞胺（（英文簡稱PEI))作為一種陽離子聚合物，通過靜電作用來吸附帶有 負電荷的DNA，支化結構的PEI的結合位點較多，可以攜帶大量的DNA，且PEI質(zhì)子海綿效應顯 著，囊泡中帶有正電荷的PEI通過不斷吸附細胞質(zhì)中的H+，由于滲透壓的改變，導致包有基 因載體的囊泡破裂，將載體釋放到細胞質(zhì)中。研究發(fā)現(xiàn)，如果將聚乙烯亞胺(PEI)引入到基 因轉染中，可以很好地解決非病毒載體轉染效能低的問題。研究發(fā)現(xiàn)，PEI的基因轉染效率 及毒性與分子量很大關系，在相同濃度下，未經(jīng)修飾的PEI-2000分子量其轉染效率比PEI-2500分子量低兩個數(shù)量級。當對PEI-2000進行烷基化修飾后，其轉染效率比PEI-2500高5 倍。而將烷基化修飾后的PEI-2000與金納米粒子偶聯(lián)，這種偶聯(lián)物的轉染效率比PEI-2500 高6倍。
[0005] 金納米顆粒由于具有優(yōu)良的光學性能，在特殊波長對光進行吸收和散射。這種特 殊的局域表面等離子體共振(LSPR)現(xiàn)象可以增強某些特定組織的光信號特征，從而提高成 像的對比度，因此在醫(yī)學光成像上具有潛在的應用前景。
[0006] 球形的金納米顆粒其SPR峰主要在可見光范圍內(nèi)，這種光對組織穿透深度較淺，而 金納米籠的SPR峰位置可通過調(diào)節(jié)銀納米立方體與氯金酸之間的摩爾比得到的不同刻蝕程 度及表面孔隙率和孔徑的金納米籠，從而實現(xiàn)在近紅外區(qū)700-1200nm內(nèi)有特征吸收。由于 近紅外區(qū)的光穿透深度較深，在這個波段范圍中，光波在血液和軟組織中的吸收都處于最 小，有利于深層組織病變的檢測和治療。
[0007] 另外金納米籠狀顆粒有較大的吸收截面積，可以達到3.48 Xl(T14m2,能有效地吸 收光子，并把光能轉化為熱能使溫度升高，從而把癌細胞原位殺死。金納米籠狀顆粒的毒性 相對較低，顆粒表面容易被生物分子所修飾，金納米籠制備過程中及納米籠表面包覆PVP通 過Au-N配位鍵從而實現(xiàn)穩(wěn)定包覆，由于Au-s共價鍵比Au-N配位鍵的結合力強，所以金表面 容易被帶有-SH的有機物鏈修飾，從而實現(xiàn)金納米籠表面功能化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種具有低細胞毒性、高基因轉染效率且具備熱療功能的 表面接枝陽離子聚合物的金納米籠基因載體的制備方法。
[0009 ] -種具有熱療效應的基因載體的制備方法，包括以下步驟：
[0010] 1)首先制備金納米籠(A);
[0011] 2)然后采用4,4'_二硫代二丁酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)、N- 羥基丁二酰亞胺和聚乙烯亞胺(PEI)發(fā)生酰胺化反應，得到不溶于水的似凝膠材料(B)，將 似凝膠材料(B)與巰基乙醇反應得到一端帶有巰基、另一端接枝聚乙烯亞胺的陽離子聚合 物(C);
[0012] 3)然后將得到的金納米籠(A)與制備的陽離子聚合物(C)混合對金納米籠進行表 面修飾，再經(jīng)過離心和清洗后，即得到本發(fā)明具有熱療效應的基因載體(D)。
[0013] 本發(fā)明中，制備金納米籠的優(yōu)選方法為多元醇法，即先通過多元醇法制備銀納米 立方體，然后以此作為模版，制備金納米籠。
[0014] 本發(fā)明優(yōu)選的金納米籠的制備方法主要包括以下步驟：
[0015] (1)通過多元醇法制備銀立方體，將制備的銀立方體離心處理后分散在三蒸水中， 得到銀納米立方體的分散液，濃度為6-8nM;將聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶于三蒸水中，配置成 濃度為〇. l-9mM的PVP水溶液;將立方銀溶液加至IjPVP水溶液中，立方銀溶液與PVP水溶液的 體積比范圍可優(yōu)選為1:20-1:100，在水浴中加熱攪拌至沸騰；
[0016] (2)取0.1 mM氯金酸水溶液以0.8-lml/min的速度滴加到上述溶液中，待溶液顏色 由黃色變?yōu)榻咏该鞯幕疑珪r，停止滴加氯金酸，加熱攪拌回流10~20min后停止反應，得 到金納米籠。
[0017] 進一步地，將得到的金納米籠進行離心分離，移除上清液，將所得沉淀加三蒸水進 行超聲分散，重復操作3次，將最終產(chǎn)物分散在三蒸水中，得到金納米籠。
[0018] 本發(fā)明具有熱療效應的基因載體的制備方法中，一端帶有巰基、另一端接枝聚乙 烯亞胺的陽離子聚合物(C)的制備方法，主要包括以下步驟：
[0019] ⑴將4,4_二硫代二丁酸與1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，在冰浴中攪拌2-4h;然后加入N-羥基丁二酰亞胺，再在冰浴中攪拌 2-4h;將聚乙烯亞胺(PEI)溶于DMF，與上述溶液混合，室溫下攪拌10h-30h，發(fā)生酰胺化反 應，得到白色的不溶于水的似凝膠材料(B);所制備的似凝膠材料(B)懸浮于蒸餾水中，滴加 數(shù)滴巰基乙醇，攪拌l_3h，得到初級陽離子聚合物(C);
[0020] 優(yōu)選的，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)與4,4_二硫代二丁酸的摩爾 比為1:1~4:1，N-羥基丁二酰亞胺與4,4-二硫代二丁酸的摩爾比為1:1~5 :1，聚乙烯亞胺 (PEI)與4,4_二硫代二丁酸的摩爾比為0.03:1~3:1;
[0021] (2)將所得初級陽離子聚合物(C)過濾，濾液在去離子水中透析3_72h，將所得濾液 進行旋蒸，除去大部分水分后，將剩余液體在冷凍干燥機中凍干，得到純凈的巰基化修飾的 陽離子聚合物(C)。
[0022]在陽離子聚合物(C)的制備過程中，采用的聚乙烯亞胺(PEI)的PEI分子結構為帶 有支鏈的分子結構，平均分子量在1000-30000之間。
[0023] 本發(fā)明中，將金納米籠(A)與陽離子聚合物(C)按照一定比例混合對金納米籠進行 表面修飾，其中，金納米籠(A)與陽離子聚合物(C)按照摩爾比為1:1~30:1的比例混合，以 使金納米籠的表面進行硫氫鍵接枝修飾。
[0024] 在金納米籠的表面修飾反應過程中，采用超聲方法進行表面修飾，反應時間為1-3h，反應體系溫度控制在20-50°C之間，超聲頻率控制在3000-300000HZ之間。
[0025]在表面修飾過程完成后，通過離心收集基因載體（D)，所述的離心轉速為50-6000rpm之間，離心時間在5_60min之間。
[0026] 離心后收集的基因載體(D)再應用透析方法清洗掉未反應的陽離子聚合物以及其 他雜質(zhì)成分，透析次數(shù)為1-10次，每次10-30分鐘，即可得到純凈的基因載體(D)。
[0027] 本發(fā)明的上述技術方案與現(xiàn)有技術相比具有如下優(yōu)點:本發(fā)明制備的載體具有生 物相容性好、基因轉染效率高、細胞毒性低的優(yōu)點，該載體與質(zhì)粒DNA形成的復合物細胞毒 性低，同時該載體還具有熱效應，可以同時實現(xiàn)熱療和基因治療的雙重效果。
【附圖說明】
[0028]圖Ι-a和圖Ι-b分別為PEI進行巰基化修飾過程中，中間產(chǎn)物DSB的紅外譜圖和電噴 霧電離(ESI)質(zhì)譜圖。
[0029]圖2為基因載體產(chǎn)物的透射電子顯微照片。
[0030]圖3為基因載體Au-PEI-18000在不同功率的激光照射下其溫度與時間的變化曲 線。
[0031]圖4為基因載體Au-PEI-18000瓊脂糖凝膠電泳凝膠阻滯實驗圖。
【具體實施方式】
[0032]為使本發(fā)明實施例的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結合本發(fā)明實施例 中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是 本發(fā)明的一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人 員在沒有做出創(chuàng)造性勞動的前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。 [0033]本發(fā)明提供的具有熱療效應的基因載體的制備方法包括以下步驟:首先制備金納 米籠(A):通過多元醇法制備銀納米立方體，并以此作為模版，制備金納米籠(A);然后使用 4，4 二硫代二丁酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(英文簡稱EDC)、N-羥基丁二酰 亞胺和一定分子量的聚乙烯亞胺（英文簡稱PEI)發(fā)生酰胺化反應，得到不溶于水的似凝膠 材料(B)，將似凝膠材料與巰基乙醇反應得到一端帶有巰基、另一端接枝聚乙烯亞胺的陽離 子聚合物(C);然后將得到的金納米籠(A)與這種陽離子聚合物(C)按照一定比例混合對金 納米籠進行表面修飾，再經(jīng)過離心和清洗后即得到這種新型的基因載體(D)。
[0034]具有熱療效應的基因載體的制備方法，具體步驟如下：
[0035] 1、金納米籠的制備：
[0036] 通過多元醇法制備45nm的銀立方體，具體方法如下：30ml乙二醇加入到100ml三口 圓底燒瓶中，于155°C油浴中預熱攪拌50min，攪拌速率為300rpm。之后，向反應體系以 1000ml/min速率通入氬氣。lOmin后，先后注入460μ1 Na〗S · 9H2〇(3mM，乙二醇做溶劑）和 7.5ml聚乙烯吡咯烷酮溶液(20mg/ml，乙二醇做溶劑）。繼續(xù)攪拌lOmin后，加入2.5mlAgN0 3 溶液(48mg/ml，乙二醇做溶劑），顏色最終變?yōu)橹行某示G赭石色、邊緣呈紅色時，將燒瓶置于 冰水浴中終止反應。待反應液溫度冷卻至室溫后，向體系中加入約等于反應液體積2倍的丙 酮，混合均勻后，溶液顏色由綠赭石色變?yōu)榍煽肆ψ厣?，將溶液離心去除上清液，將沉淀分 散在無水乙醇中，此步操作重復3次以充分除去乙二醇和多余的聚乙烯吡咯烷酮，得到45nm 的銀立方體，參考文獻（Qiang Zhang，et al.ACS Appl.Mater.Interfaces.2009，l(9): 2044-2048.)〇
[0037]將制備的45nm的銀立方體離心處理后分散在三蒸水中，得到銀納米立方體的分散 液，濃度為6_8nM;將聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶于三蒸水中，配置成濃度為0.卜9mM的PVP水溶 液。
[0038] 滴加5ml 9mM PVP溶液到50ml圓底燒瓶中，放入一個干凈的攪拌子。在80~100°C 恒溫油浴中加熱至沸騰，接著加入1〇〇μ1 8nM銀立方體水溶液，攪拌至沸騰狀態(tài)。用微量注 射器以0.8~lml/min的速率向反應體系中滴加6.5ml 0.1 mM HAuCl4溶液，溶液顏色由黃色 變?yōu)榻咏该鞯幕疑?。注射完畢后，繼續(xù)回流10~20min直至顏色變得穩(wěn)定。冷卻該系統(tǒng)至 室溫。冷卻全過程保持磁力攪拌。得到的產(chǎn)物采用3000rpm的轉速離心10~30min，移除上清 液，將所得沉淀加 l〇ml三蒸水，超聲分散10~30min，然后采用3000rpm的轉速離心30min。重 復操作3次。將最終產(chǎn)物分散在三蒸水中，得到金納米籠。
[0039] 2、陽離子聚合物的巰基化修飾：
[0040] 取6.25mmol4,4-二硫代二丁酸與13.75mmolEDC溶于6.25mlDMF中，在冰浴中攪 拌2h，得到溶液1;取16.25mmol N-羥基丁二酰亞胺溶于5ml DMF，得到溶液2;將溶液2滴加 到溶液1中，冰浴中攪拌2h，得到溶液3;取0.625mmol聚乙烯亞胺PEI-18000(分子量為18000 的PEI)室溫下攪拌溶于2.25ml DMF，得到溶液4;取1.5ml溶液3，加入2.25ml DMF，得到的混 合溶液滴加到溶液4中，室溫下攪拌過夜，得到白色的不溶于水的中間產(chǎn)物1;將中間產(chǎn)物1 懸浮于12.5ml水中，滴加0.6ml巰基乙醇，攪拌lh，得到反應液5;將反應液5過濾除掉不溶性 雜質(zhì)，濾液在去離子水中攪拌透析48h，每8h換一次水，除掉小分子雜質(zhì)。將最終的透析液在 45°C下旋蒸除去大部分水分，將旋蒸瓶中剩余的液體倒入培養(yǎng)皿中，液體高度不超過lcm。 將培養(yǎng)皿置于冷凍干燥機中先進行預凍，待樣品溫度降至-45°C時，真空冷凍干燥20~30h， 最終得到白色絮狀的巰基化修飾的HS-PEI-18000。
[0041] 3、金納米籠表面接枝陽離子聚合物的制備：
[0042] 金納米籠與巰基化修飾的HS-PEI-18000按照摩爾比為5:1的比例混合，在功率為 100W的超聲機中超聲反應lh，反應體系溫度為30攝氏度，超聲頻率為5000Hz，然后以 3000rpm的轉速離心30min，移除上清液，將沉淀分散在三蒸水中，重復離心3次，將沉淀分散 在三蒸水中儲存?zhèn)溆?，得到具有熱療效應的基因載體Au-PEI-18000。
[0043] PEI進行巰基化修飾的合成路線：
[0045] PEI進行巰基化修飾過程中，中間產(chǎn)物DSB的紅外譜圖和電噴霧電離(ESI)質(zhì)譜分 別如圖Ι-a和圖Ι-b所示，紅外譜圖（圖Ι-a)上1680CHT 1處為DSB中C = 0的伸縮振動峰。ESI質(zhì) 譜（圖Ι-b)顯示的主產(chǎn)物質(zhì)荷比為450.1，而DSB理論分子量為432,即DSB帶上了質(zhì)子化的 NH4+，說明成功制備中間產(chǎn)物DSB。
[0046] 對上述制備得到的基因載體Au-PE 1-18000進行如下測試：
[0047] (1)透射電子顯微鏡測試：
[0048]如圖2所示，為用透射電子顯微鏡表征得到的基因載體產(chǎn)物。從圖中可清楚地看 至|J，金納米籠尺寸均勾、形貌單一，表面被刻蝕成孔洞結構，內(nèi)部中空，其壁厚約3nm左右，孔 直徑15nm左右。
[0049] (2)制備的基因載體Au-PE I -18000的熱效應表征：
[0050] 將制備的金納米籠分別配制成濃度為0.04nM，0.07nM的溶液，在室溫為21°C的環(huán) 境中，采用波長為800nm的激光器照射分散液，照射時間為300s，并記錄分散液溫度隨激光 照射時間的變化情況。對照組采用二蒸水。
[0051] 結果如圖3所示，為同一濃度的金納米籠溶液在不同功率的激光照射下其溫度與 時間的變化曲線，對照組為二蒸水，從上到下三條曲線分別表示:0.07nM、0.04nM金納米籠 溶液和二蒸水;測試結果顯示本發(fā)明制備的金納米籠具有明顯的熱效應，且隨著濃度升高， 升溫速率加快。
[0052] (3)制備的基因載體Au-PE I -18000與質(zhì)粒DNA的結合情況表征：
[0053] 1)制備Au-PE Ι/DNA 復合物
[0054] 按上述實施例制備的Au-PEI-18000與2μ1質(zhì)粒DNA(EGFP，濃度為375ngAU)按照 Au/DNA質(zhì)量比為從0到200混合，加1 X TAE緩沖液配成28μ1溶液，在渦旋振蕩器上混合lmin， 然后靜置30min。
[0055] 2)瓊脂糖凝膠電泳實驗
[0056] 取28μ1步驟1)中的混合物與2μ1上樣緩沖液(6X，Solarbio)充分混合后加入到濃 度為1 %的瓊脂糖凝膠中（含IX GelRed Nucleic Acid Gel Stain)，電泳緩沖液為IX TAE， 電壓為120V，電泳時間為40min，然后在紫外下觀察DNA電泳譜圖并拍照。
[0057]如圖4所示，為金納米籠與DNA按照不同質(zhì)量比復合的凝膠阻滯實驗圖，其中金納 米籠表面修飾接枝的是PEI-18000，對照組為裸DNA及PEI-25000;結果顯示本發(fā)明制備的基 因載體具有很強的DNA結合能力；且當Au/DNA比例大于20時，能觀察到明顯的阻滯效果，顯 示出基因載體Au-PEI-18000具有較好地攜帶DNA的能力。
[0058]本發(fā)明方法以金納米籠作為母體，表面接枝陽離子聚合物聚乙烯亞胺來構建新型 非病毒基因載體;該載體與質(zhì)粒DNA形成的復合物具有細胞毒性低，轉染效率高等優(yōu)點，同 時該載體還具有熱效應，能同時實現(xiàn)基因治療和熱治療雙重療效。
【主權項】
1. 一種具有熱療效應的基因載體的制備方法，包括以下步驟： 1) 制備金納米籠； 2) 采用4,4'_二硫代二丁酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺、N-羥基丁二酰亞 胺和聚乙烯亞胺發(fā)生酰胺化反應，得到不溶于水的似凝膠材料，將似凝膠材料與巰基乙醇 反應得到一端帶有巰基、另一端接枝聚乙烯亞胺的陽離子聚合物； 3) 將得到的金納米籠與制備的陽離子聚合物混合，對金納米籠進行表面修飾，再經(jīng)過 離心和清洗后，即得到具有熱療效應的基因載體。2. 根據(jù)權利要求1所述的具有熱療效應的基因載體的制備方法，其特征在于，采用多元 醇法制備金納米籠，先通過多元醇法制備銀納米立方體，然后以此作為模版，制備金納米 籠。3. 根據(jù)權利要求2所述的具有熱療效應的基因載體的制備方法，其特征在于，所述的金 納米籠的制備方法包括以下步驟： (1) 通過多元醇法制備銀立方體，將制備的銀立方體離心處理后分散在三蒸水中，得到 銀納米立方體的分散液，濃度為6_8nM;將聚乙烯吡咯烷酮溶于三蒸水中，配置成濃度為 0. l-9mM的PVP水溶液;將立方銀溶液加到PVP水溶液中，在水浴中加熱攪拌至沸騰； (2) 取0.1 mM氯金酸水溶液以0.8-lml/min的速度滴加到上述溶液中，待溶液顏色由黃 色變?yōu)榻咏该鞯幕疑珪r，停止滴加氯金酸，加熱攪拌回流10~20min后停止反應，得到金 納米籠。4. 根據(jù)權利要求1所述的具有熱療效應的基因載體的制備方法，其特征在于，所述的陽 離子聚合物的制備方法包括以下步驟： (1) 將4,4_二硫代二丁酸與1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺溶于N，N-二甲基甲 酰胺中，在冰浴中攪拌2_4h;然后加入N-羥基丁二酰亞胺，再在冰浴中攪拌2-4h;將聚乙烯 亞胺溶于DMF，與上述溶液混合，室溫下攪拌10h-30h，發(fā)生酰胺化反應，得到白色的不溶于 水的似凝膠材料;所制備的似凝膠材料懸浮于蒸餾水中，滴加數(shù)滴巰基乙醇，攪拌l_3h，得 到初級陽離子聚合物； (2) 將所得初級陽離子聚合物過濾，濾液在去離子水中透析3-72h，將所得濾液進行旋 蒸，除去大部分水分后，將剩余液體在冷凍干燥機中凍干，得到純凈的巰基化修飾的陽離子 聚合物。5. 根據(jù)權利要求4所述的具有熱療效應的基因載體的制備方法，其特征在于，所述的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺與4,4_二硫代二丁酸的摩爾比為1:1~4:1，N-羥基丁 二酰亞胺與4,4_二硫代二丁酸的摩爾比為1:1~5:1，聚乙烯亞胺(PEI)與4,4_二硫代二丁 酸的摩爾比為0.03:1~3:1。6. 根據(jù)權利要求5所述的具有熱療效應的基因載體的制備方法，其特征在于，所述的聚 乙烯亞胺的分子結構帶有支鏈，平均分子量為1000-30000。7. 根據(jù)權利要求1所述的具有熱療效應的基因載體的制備方法，其特征在于，所述的金 納米籠與陽離子聚合物的摩爾比為1:1~30:1。8. 根據(jù)權利要求1所述的具有熱療效應的基因載體的制備方法，其特征在于，采用超聲 方法進行金納米籠的表面修飾，反應時間為l-3h，反應體系溫度為20-50°C，超聲頻率為 3000-300000HZ。9. 根據(jù)權利要求1所述的具有熱療效應的基因載體的制備方法，其特征在于，在表面修 飾完成后，通過離心收集基因載體，所述離心的轉速為50_6000rpm，離心時間為5_60min。10. 根據(jù)權利要求9所述的具有熱療效應的基因載體的制備方法，其特征在于，離心后 收集的基因載體再采用透析方法進行清洗，透析次數(shù)為1-10次，每次10-30分鐘，即可得到 純凈的基因載體。
【文檔編號】C08G83/00GK105936670SQ201610483719
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2016年6月27日
【發(fā)明人】韓璐, 趙玉霞, 董世磊, 李路海, 危巖
【申請人】北京印刷學院