一種空間葡萄球菌lct-h4的制作方法
【專利摘要】一種空間葡萄球菌LCT?H4，更具體的說(shuō)是一種太空微生物，運(yùn)用空間技術(shù)從“神舟九號(hào)”飛船返回艙內(nèi)部冷凝水分離獲得。其特征：化學(xué)異養(yǎng)革蘭陽(yáng)性菌，有菌毛，與琥珀葡萄球菌Staphylococcus succinus親緣關(guān)系最近，對(duì)環(huán)氧樹(shù)脂等5種高分子材料具有腐蝕能力。LCT?H4全基因組序列總長(zhǎng)2.78Mbp，具有2,562個(gè)蛋白編碼基因和27個(gè)RNA基因。其中334個(gè)蛋白注釋為 “一般功能預(yù)測(cè)”，260個(gè)蛋白為“氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝”，186個(gè)蛋白為“糖轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝”，176個(gè)蛋白為“無(wú)機(jī)鹽離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝”，167個(gè)蛋白為“轉(zhuǎn)錄”，145個(gè)蛋白為“翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和形成”，206個(gè)蛋白為“未知功能”。CGMCC No.1257220160601
【專利說(shuō)明】
一種空間葡萄球菌LCT-H4
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于微生物及生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種新的微生物菌株葡萄球菌LCT-H4以 及其生物學(xué)特性、基因組DNA序列，利用生物信息學(xué)技術(shù)進(jìn)行了組學(xué)分析，獲得其在基因組 的特性。
【背景技術(shù)】
[0002] 在隨著人類空間探索活動(dòng)的日益頻繁，宇宙空間成為了人類活動(dòng)的一個(gè)重要領(lǐng) 域。太空密閉艙中存在著特定的微生物群落。雖然每一件物品都經(jīng)過(guò)了嚴(yán)格消毒，微生物仍 會(huì)隨航天員身體、人體分泌物、航空部件等進(jìn)入太空，并在航天器密閉艙室內(nèi)形成特定微生 物群落，既包括無(wú)害微生物，也包括一些致病性和腐蝕性微生物。"和平"號(hào)運(yùn)行十余年來(lái)空 間站內(nèi)檢測(cè)到234種微生物。太空密閉艙內(nèi)的特殊環(huán)境因素，包括微重力、弱磁場(chǎng)和粒子輻 射等，使得微生物會(huì)產(chǎn)生變異，導(dǎo)致它們對(duì)生存環(huán)境的要求很低，更加容易生長(zhǎng)和繁殖，某 些微生物的腐蝕性會(huì)增強(qiáng)。太空密閉艙中腐蝕性微生物的大量繁殖，使得各種航天材料逐 漸產(chǎn) 生腐蝕，加速航天器件的降解耗損，將可能導(dǎo)致空間站內(nèi)的設(shè)備運(yùn)行失靈，影響航天器 的長(zhǎng)期正常運(yùn)行及其在軌使用壽命，甚至對(duì)飛行安全也會(huì)造成很大威脅。航天器服役條件 惡劣，在軌時(shí)間長(zhǎng)，而維修條件相對(duì)不足，一旦發(fā)生微生物腐蝕設(shè)備故障，損失不可估量。國(guó) 外載人航天器在軌經(jīng)驗(yàn)和國(guó)內(nèi)地面研究的初步結(jié)果表明，微生物會(huì)嚴(yán)重威脅航天設(shè)備安 全。開(kāi)展長(zhǎng)期太空密閉艙中微生物對(duì)航天器材腐蝕的機(jī)理及防控措施研究，深化對(duì)載人航 天器中微生物風(fēng)險(xiǎn)的認(rèn)識(shí)和加強(qiáng)相關(guān)技術(shù)儲(chǔ)備，探索更加有效的載人航天器微生物綜合控 制措施，為載人航天器的研制和運(yùn)營(yíng)提供技術(shù)支撐。
[0003] 針對(duì)空間環(huán)境下微生物材料腐蝕研究，目前尚無(wú)葡萄球菌的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 在本發(fā)明的目的在于提供一種空間葡萄球菌LCT-H4。對(duì)空間菌株進(jìn)行表型檢測(cè)， 然后對(duì)其進(jìn)行全基因組測(cè)序，闡明該細(xì)菌的特性及用途。
[0005] 本發(fā)明提供的菌株葡萄球菌LCT-H4,其保藏號(hào)為CGMCC 12572。
[0006] 所述的葡萄球菌LCT-H4,革蘭陽(yáng)性菌，具有菌毛，與琥珀葡萄球菌Staphylococcus succinus親緣關(guān)系最為相近。對(duì)環(huán)氧樹(shù)脂、酯類聚氨酯、醚類聚氨酯、硫化天然橡膠和 聚乙烯醇聚縮醛5種高分子材料具有腐蝕能力。
[0007] 所述的葡萄球菌LCT-H4，全基因組序列總長(zhǎng)度為2.78Mbp，GC含量為33.8%，具有2， 562個(gè)蛋白編碼基因和27個(gè)RNA基因。其中2302個(gè)蛋白被分類注釋為21類C0G家族，其中334 個(gè)蛋白注釋為"一般功能預(yù)測(cè)"，260個(gè)蛋白注釋為"氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝"，186個(gè)蛋白注釋為 "糖轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝"，176個(gè)蛋白注釋為"無(wú)機(jī)鹽離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝"，167個(gè)蛋白注釋為"轉(zhuǎn)錄"， 145個(gè)蛋白注釋為"翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和形成"，206個(gè)蛋白注釋為"未知功能"，以及其他。
【附圖說(shuō)明】
[0008] 圖1葡萄球菌LCT-H4的革蘭氏染色。
[0009] 圖2葡萄球菌LCT-H4進(jìn)化樹(shù)。
[0010] 圖3葡萄球菌LCT-H4在不同瓊脂濃度平板表面的菌落擴(kuò)散。
[0011] 圖4葡萄球菌LCT-H4在透射電鏡下的特殊結(jié)構(gòu)形態(tài)觀察。
[0012] 圖5葡萄球菌LCT-H4的biolog生化特征。
[0013] 圖6葡萄球菌LCT-H4在環(huán)氧樹(shù)脂為唯一碳源培養(yǎng)條件下增長(zhǎng)曲線。
[0014]圖7葡萄球菌LCT-H4對(duì)環(huán)氧樹(shù)脂腐蝕的SEM觀察。
[0015] 圖8葡萄球菌LCT-H4在酯類聚氨酯為唯一碳源培養(yǎng)條件下增長(zhǎng)曲線。
[0016] 圖9葡萄球菌LCT-H4對(duì)酯類聚氨酯腐蝕的SEM觀察。
[0017] 圖10葡萄球菌LCT-H4在醚類聚氨酯為唯一碳源培養(yǎng)條件下增長(zhǎng)曲線。
[0018] 圖11葡萄球菌LCT-H4對(duì)醚類聚氨酯腐蝕的SEM觀察。
[0019]圖12葡萄球菌LCT-H4在硫化天然橡膠為唯一碳源培養(yǎng)條件下增長(zhǎng)曲線。
[0020]圖13葡萄球菌LCT-H4對(duì)硫化天然橡膠腐蝕的SEM觀察。
[0021]圖14葡萄球菌LCT-H4在聚乙烯醇縮甲醛為唯一碳源培養(yǎng)條件下增長(zhǎng)曲線。
[0022] 圖15葡萄球菌LCT-H4對(duì)聚乙烯醇縮甲醛腐蝕的SEM觀察。
[0023] 圖16葡萄球菌LCT-H4的C0G功能分析和G0分析。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 下述實(shí)施實(shí)例中所用的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0025] 下述實(shí)施實(shí)例中所用的材料、試劑，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0026] 一、葡萄球菌LCT-H4的表型 1.菌株來(lái)源:對(duì)"神舟九號(hào)"飛船返回艙內(nèi)部的冷凝水進(jìn)行了微生物的采集，選用細(xì)菌 培養(yǎng)基對(duì)樣品進(jìn)行初篩，然后挑取菌落形態(tài)不同的單菌落進(jìn)行劃線培養(yǎng)，純化到單一菌株 后，使用生理鹽水加80%甘油保藏菌種。菌株命名為葡萄球菌LCT-H4,保存于中國(guó)普通微生 物菌種保藏中心，保藏號(hào)為CGMCC 12572。
[0027] 2.葡萄球菌LCT-H4菌株16s rDNA鑒定：16S rDNA是16S rRNA序列的基因，長(zhǎng)約 1.5kb。將已分純的單菌直接經(jīng)菌液PCR擴(kuò)增16S rDNA，部分通過(guò)菌液PCR較難擴(kuò)增的單菌經(jīng) 擴(kuò)大培養(yǎng)后提取基因組后擴(kuò)增，擴(kuò)增所用引物序列如下： SgF： AGAGTTTGATCATGGCTCAG SgR： TAGGGTTACCTTGTTACGACTT 16S rDNA PCR產(chǎn)物用96孔millpore純化系統(tǒng)純化后準(zhǔn)確定量，經(jīng)ABI 3730x1全自動(dòng)序 列分析儀測(cè)序，測(cè)序結(jié)果使用Sequence scanner、Seqman等序列分析軟件，將兩向測(cè)序結(jié)果 去掉首尾不可信序列后拼接，余下的約1350bp(雙向測(cè)序）即用于同源性分析。所得16S rDNA序列在Eztaxon server 2.1數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，確定菌株大致的分類地位。所有單菌 16S序列全部導(dǎo)入seqman，輸出single file(fasta)后，經(jīng)Mega 5 · 0軟件clusterW多重比 對(duì)，輸出meg文件重新導(dǎo)入構(gòu)建Neighbor-Joining tree。其中，phylogeny test method為 bootstrap參數(shù)設(shè)置為1000。16s rDNA鑒定結(jié)果顯示LCT-H4與琥珀葡萄球菌 Staphylococcus succinus的相似性為99%(圖2)。
[0028] 3.形態(tài)學(xué)及運(yùn)動(dòng)表型：LCT-H4樣品進(jìn)行稀釋涂布，進(jìn)行革蘭氏染色。葡萄球菌 LCT-H4為革蘭氏陽(yáng)性桿菌，菌體單個(gè)、成雙或成葡萄串狀排列（圖1)。將LCT-H4單菌落接種 至不同瓊脂濃度平板上觀察菌落的擴(kuò)散，并用透射電鏡觀察鞭毛、菌毛。葡萄球菌LCT-H4在 軟瓊脂上有明顯的擴(kuò)散(圖3);透射電鏡下H4觀察到菌毛（圖4)。
[0029] 4.生化代謝(Biolog)實(shí)驗(yàn):過(guò)夜培養(yǎng)葡萄球菌LCT-H4,離心收集菌體后，用接種 液(IF)懸浮菌體配成指定濃度的菌懸液。將菌懸液按每孔100μΙ的量加入Biolog96孔板中， 37°C孵育24h。孵育后，通過(guò)顯紫色孔所產(chǎn)生的表型指紋同Biolog數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較 (見(jiàn)圖5)。該菌株生化代謝如表1。
[0030] 表1葡萄球菌LCT-H4的biolog生化特征
注:+陽(yáng)性，表示LCT-H4可利用該底物生長(zhǎng);+/-弱陽(yáng)性，表示LCT-H4可部分利用該底 物生長(zhǎng)。
[0031] 5.腐蝕性實(shí)驗(yàn):選擇航天器已采用的5種高分子材料環(huán)氧樹(shù)脂、酯類聚氨酯、醚類 聚氨酯、硫化天然橡膠和聚乙烯醇聚縮醛為葡萄球菌LCT-H4腐蝕特性研究對(duì)象。
[0032]分別以這5種高分子材料為唯一碳源對(duì)菌株LCT-H4進(jìn)行培養(yǎng)，在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行 取樣并測(cè)定培養(yǎng)液在600 nm波長(zhǎng)下的吸光度(0D600)，以判斷細(xì)菌利用單一高分子材料作 為唯一碳源的生長(zhǎng)情況。具體操作如下：向100 mL無(wú)菌三角燒瓶中倒入40 mL無(wú)機(jī)鹽基礎(chǔ)培 養(yǎng)基，每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入10個(gè)高分子材料試樣，接種5 mL菌懸液，透氣膜封口，放入32 °C，相 對(duì)濕度為75%的恒溫培養(yǎng)箱中。每株菌和每個(gè)材料準(zhǔn)備3個(gè)平行樣品。設(shè)置4個(gè)時(shí)間點(diǎn)：1、3、 6、10周取樣。測(cè)定各個(gè)時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)液600 nm波長(zhǎng)下的吸光度，判斷細(xì)菌利用高分子材料作 為唯一碳源的生長(zhǎng)情況。結(jié)果（圖6、8、10、12、14)表明在1至10周內(nèi)，菌株^：1'-!14的00600均 大于對(duì)照菌株，具有明顯的增長(zhǎng)現(xiàn)象。
[0033]高分子材料表面微生物膜和腐蝕形態(tài)SEM觀察：將環(huán)氧樹(shù)脂膜加工成尺寸為10mm (直徑）X0.5mm(厚度)圓片;醚類聚氨酯、酯類聚氨酯泡沫和聚乙烯醇縮甲醛泡沫分別加工 成10 mm(長(zhǎng)）X 10 mm(寬）X5mm(厚度）的小方塊;硫化橡膠膜加工成尺寸為6mm(直徑）X 0.5mm(厚度）圓片;所有樣品用丙酮浸泡1天，5%乙醇/水溶液中15min滅菌，無(wú)菌水清洗至 中性。將培養(yǎng)的菌株LCT-H4分別接種至5種高分子材料膜表面，在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)高分子材料 膜表面用掃描電子顯微鏡（SEM)進(jìn)行觀察，如圖7、9、11、13、15所示，1至10周內(nèi)菌株LCT-H4 能在5種高分子材料膜表面形成微生物膜，說(shuō)明菌株LCT-H4具有降解和腐蝕5種高分子材料 的潛力。
[0034] 二、空間葡萄球菌LCT-H4全基因組測(cè)序 采用高通量Solexa測(cè)序技術(shù)對(duì)該樣品的DNA進(jìn)行Paired-End測(cè)序。首先提取細(xì)菌的基 因組DNA，離心方法收集葡萄球菌LCT-H4菌體，經(jīng)過(guò)重懸、裂解、酚氯仿抽提、異丙醇沉淀、 75%乙醇洗滌、RNase去除RNA和溶解基因組DNA等步驟獲得LCT-H4的基因組DNA，并檢測(cè)其純 度使之符合建庫(kù)指標(biāo)。采用超聲法Covaris將大片段基因組DNA隨機(jī)打斷并產(chǎn)生一系列DNA 片段；然后用T4 DNA Polymerase、Klenow DNA Polymerase和T4 PNK將打斷形成的粘性末 端修復(fù)成平末端，再通過(guò)3'端加堿基"A"，使得DNA片段能與3'端帶有"T"堿基的特殊接頭 連接，用電泳法選擇需回收的目的片段連接產(chǎn)物，再使用PCR技術(shù)擴(kuò)增兩端帶有接頭的DNA 片段;建立300bp的小片段文庫(kù)。對(duì)測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾及統(tǒng)計(jì);運(yùn)用SOAP denovo ￥1.05軟件和3(^?&1181^以8〇&?2軟件對(duì)處理后的^&(18數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝。并對(duì)基因組和基因 區(qū)覆蓋度進(jìn)行評(píng)價(jià);采用GlimmeU.O軟件從組裝結(jié)果中獲得基因序列并將基因的序列與各 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，得到對(duì)應(yīng)的功能注釋信息。LCT-H4的全基因組序列總長(zhǎng)度為2.78Mbp，GC 含量為33.8%，具有2,562個(gè)蛋白編碼基因和27個(gè)RNA基因。其所含蛋白中的2302個(gè)蛋白被分 類注釋為21類C0G家族，其中334個(gè)蛋白注釋為"一般功能預(yù)測(cè)"，260個(gè)蛋白注釋為"氨基酸 轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝"，186個(gè)蛋白注釋為"糖轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝"，176個(gè)蛋白注釋為"無(wú)機(jī)鹽離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代 謝"，167個(gè)蛋白注釋為"轉(zhuǎn)錄"，145個(gè)蛋白注釋為"翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和形成"，206個(gè)蛋白注 釋為"未知功能"，以及其他(圖16)。
[0035]本發(fā)明的特點(diǎn)和應(yīng)用價(jià)值:本研究是我國(guó)第一次利用自己研發(fā)的空間技術(shù)獲得對(duì) 常用航天高分子材料具有腐蝕性的太空艙定植葡萄球菌LCT-H4,為研究載人航天器微生物 腐蝕提供了寶貴的樣本。同時(shí)，我們對(duì)這一分離菌進(jìn)行了全基因組測(cè)序，其序列已經(jīng)測(cè)通， 從而為更好地揭示其腐蝕機(jī)制打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本研究有助于長(zhǎng)期太空密閉艙中微生物 對(duì)航天器材腐蝕的機(jī)理及防控措施研究，有助于深化對(duì)載人航天器中微生物風(fēng)險(xiǎn)的認(rèn)識(shí)和 加強(qiáng)相關(guān)技術(shù)儲(chǔ)備，有助于探索更加有效的載人航天器微生物綜合控制措施，從而為載人 航天器的研制和運(yùn)營(yíng)提供技術(shù)支撐。
[0036] 關(guān)于保藏的LCT-H4菌株說(shuō)明 A. 菌種的保藏單位名稱和地址 名稱：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心 地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所 B. 交機(jī)構(gòu)保藏的日期 2016年6月1日 C. 保藏機(jī)構(gòu)給予的保藏號(hào) CGMCC No.12572 D. 分類命名 葡萄球菌 Staphylococcus sp.〇
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種空間葡萄球菌LCT-H4，其特征在于:保藏號(hào)為CGMCC 12572。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的葡萄球菌LCT-H4，其特征在于:革蘭陽(yáng)性菌，具有菌毛，與琥珀 葡萄球菌Staphylococcus succinus親緣關(guān)系最為相近;對(duì)環(huán)氧樹(shù)脂、酯類聚氨酯、醚類聚 氨酯、硫化天然橡膠和聚乙烯醇聚縮醛5種高分子材料具有腐蝕能力。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的葡萄球菌LCT-H4,其特征在于：LCT-H4的全基因組序列總長(zhǎng) 度為2.78Mbp，GC含量為33.8%，具有2，562個(gè)蛋白編碼基因和27個(gè)RNA基因。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的葡萄球菌LCT-H4,其特征在于:其所含蛋白中的2302個(gè)蛋白被 分類注釋為21類COG家族，其中334個(gè)蛋白注釋為"一般功能預(yù)測(cè)"，260個(gè)蛋白注釋為"氨基 酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝"，186個(gè)蛋白注釋為"糖轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝"，176個(gè)蛋白注釋為"無(wú)機(jī)鹽離子轉(zhuǎn)運(yùn)和 代謝"，167個(gè)蛋白注釋為"轉(zhuǎn)錄"，145個(gè)蛋白注釋為"翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和形成"，206個(gè)蛋白 注釋為"未知功能"。
【文檔編號(hào)】C12R1/44GK105950515SQ201610456293
【公開(kāi)日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年6月22日
【發(fā)明人】劉長(zhǎng)庭, 張學(xué)林, 姜學(xué)革, 方向群, 郭英華, 王俊峰, 李天志, 周宏 , 潘磊, 徐綢, 黃兵, 余昳
【申請(qǐng)人】中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院