一種表皮細(xì)胞的擴(kuò)增制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種表皮細(xì)胞的擴(kuò)增制備方法，按照如下步驟進(jìn)行：無菌條件下將包皮環(huán)切手術(shù)切下的包皮洗滌并剪碎，去除皮下組織后，將表皮和真皮分離，之后加入胰蛋白酶?EDTA溶液中消化一定時間后，離心并棄上清液，并將得到的表皮細(xì)胞群接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；接種3d后第一次換液，以后每隔2d換液一次，12?14d后終止培養(yǎng)。通過在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白，生長激素與視黃酸，其中，胰島素可以促進(jìn)表皮組織中DNA的合成，轉(zhuǎn)鐵蛋白可以控制體液中自由鐵的平衡，視黃酸有控制表皮細(xì)胞正常生長分化的能力，并可抑制多種致癌因素誘發(fā)的體外培養(yǎng)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，所配置的培養(yǎng)液對表皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)具有促進(jìn)作用。
【專利說明】
_種表皮細(xì)胞的擴(kuò)増制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種表皮細(xì)胞的擴(kuò)增制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]皮膚由表皮、真皮和皮下組織組成，是人體最大最復(fù)雜的器官，具有保護(hù)、分泌、感知和代謝功能。皮膚缺損是一種常見的組織損傷性疾病。對于大面積深度燒傷的治療一直以自體皮移植為首選方案，然而自體供皮不足是臨床遇到的主要問題。雖可應(yīng)用異體皮、異種皮移植物，但只能作為一種臨時性創(chuàng)面覆蓋物。因此人們一直在尋找一種永久性皮膚替代物，而永久性皮膚替代物仍依賴于有活性的種子細(xì)胞(表皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞)。至今，成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)日臻完善，但表皮細(xì)胞的培養(yǎng)仍然是一個難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種表皮細(xì)胞的擴(kuò)增制備方法，通過在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白，生長激素與視黃酸，確定了一種無血清培養(yǎng)表皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法。
[0004]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:
[0005]—種表皮細(xì)胞的擴(kuò)增制備方法，按照如下步驟進(jìn)行:
[0006]步驟(I)、配置表皮細(xì)胞培養(yǎng)液；
[0007]步驟(2)、無菌條件下將包皮環(huán)切手術(shù)切下的包皮洗滌并剪碎；
[0008]步驟(3)、將所述步驟(2)中剪碎的包皮組織塊修剪去除皮下組織后，剪碎并將表皮和真皮分離;將分離后的表皮組織加入胰蛋白酶-EDTA溶液中消化20-30min后，加入步驟
(I)中配置的表皮細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化；
[0009]步驟(4)、將所述步驟(3)中的得到的表皮組織懸液離心，棄上清液，得到表皮組織細(xì)胞群；
[0010]步驟(5)、于培養(yǎng)瓶中加入2mL所述步驟(I)中配置的表皮細(xì)胞培養(yǎng)液，將所述步驟
(4)中得到的表皮組織細(xì)胞群以I X 15個/mL接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，靜置30-60min后置于37°C、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);接種3d后第一次換液，以后每隔2d換液一次，12-14d后終止培養(yǎng)。
[0011]進(jìn)一步地，所述步驟(I)中表皮細(xì)胞培養(yǎng)液包括基礎(chǔ)培養(yǎng)液以及胰島素8-12yg/mL，轉(zhuǎn)鐵蛋白 0.5_lyg/mL，生長激素 5yg/mL，抗生素 50_100yg/mL，視黃酸 5 X 10—7mol/L。
[0012]進(jìn)一步地，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液為無血清培養(yǎng)液D-KSFM或KSFM中的一種。
[0013]進(jìn)一步地，所述抗生素為氯霉素、新霉素中的一種或兩種混合。
[0014]進(jìn)一步地，所述步驟(2)中將包皮環(huán)切手術(shù)切下的包皮用0.lmol/L磷酸緩沖溶液洗滌3-5次后剪碎至體積為0.5-1 cm3 ο
[0015]進(jìn)一步地，所述步驟(3)中將包皮組織剪碎成體積為2-3_3的皮片。
[0016]進(jìn)一步地，步驟(3)中所述胰蛋白酶-EDTA溶液中胰蛋白酶濃度為2.5g/L，EDTA體積分?jǐn)?shù)為0.02 %。
[0017]進(jìn)一步地，所述步驟(4)中離心速率為800-1500r/min，離心時間為30min。
[0018]本發(fā)明具有以下有益效果:
[0019 ]本發(fā)明中提出的一種表皮細(xì)胞的擴(kuò)增制備方法，在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白，生長激素與視黃酸，其中，胰島素可以提高體外培養(yǎng)的核分裂率，還能促進(jìn)表皮組織中DNA的合成，轉(zhuǎn)鐵蛋白可以結(jié)合、運(yùn)輸三價鐵離子，從而控制體液中自由鐵的平衡，視黃酸是維生素A中活性最強(qiáng)的衍生物，有控制表皮細(xì)胞正常生長分化的能力，并可抑制多種致癌因素誘發(fā)的體外培養(yǎng)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，所配置的培養(yǎng)液對表皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)具有促進(jìn)作用。
[0020]當(dāng)然，實施本發(fā)明的任一產(chǎn)品并不一定需要同時達(dá)到以上所述的所有優(yōu)點(diǎn)。
【具體實施方式】
[0021]本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其它實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0022]本發(fā)明為一種表皮細(xì)胞的擴(kuò)增制備方法，該方法具體步驟如下:
[0023]實施例1
[0024]步驟(1)、在D-KSFM培養(yǎng)液中加入胰島素8yg/mL，轉(zhuǎn)鐵蛋白0.5yg/mL，生長激素5μg/mL，氯霉素50yg/mL，視黃酸5 X I O—7mo 1/L，配置成表皮細(xì)胞培養(yǎng)液；
[0025]步驟(2)、無菌條件下將包皮環(huán)切手術(shù)切下的包皮經(jīng)0.lmol/L磷酸緩沖溶液洗滌3次，將洗滌后的包皮組織剪碎至體積為0.5cm3;
[0026]步驟(3)、用無菌鑷和剪刀將步驟(2)中剪碎的包皮組織塊修剪去除皮下組織后，剪碎成體積為2mm3的皮片；
[0027]用無菌鑷和剪刀將皮片中的表皮和真皮分離，37°C條件下將分離后的表皮組織加入到胰蛋白酶-EDTA溶液中消化20min，其中，胰蛋白酶濃度為2.5g/L，EDTA體積分?jǐn)?shù)為
0.02% ；
[0028]在表皮組織懸液中加入步驟(I)中配置的表皮細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化；
[0029]步驟(4)、將步驟(3)中的得到的表皮組織懸液以800r/min離心30min，棄上清液，得到表皮組織細(xì)胞群；
[0030]步驟(5)、于培養(yǎng)瓶中加入2mL步驟(I)中配置的表皮細(xì)胞培養(yǎng)液，將步驟(4)中得到的表皮組織細(xì)胞群以I X 15個/mL接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，靜置30min后置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0031]接種3d后第一次換液，以后每隔2d換液一次，12d后終止培養(yǎng)。
[0032]實施例2
[0033]步驟(I)、在KSFM培養(yǎng)液中加入胰島素12yg/mL，轉(zhuǎn)鐵蛋白lyg/mL，生長激素5yg/mL，新霉素100yg/mL，視黃酸5 X I O^mo I/L，配置成表皮細(xì)胞培養(yǎng)液；
[0034]步驟(2)、無菌條件下將包皮環(huán)切手術(shù)切下的包皮經(jīng)0.lmol/L磷酸緩沖溶液洗滌5次，將洗滌后的包皮組織剪碎至體積為Icm3;
[0035]步驟(3)、用無菌鑷和剪刀將步驟(2)中剪碎的包皮組織塊修剪去除皮下組織后，剪碎成體積為3mm3的皮片；
[0036]用無菌鑷和剪刀將皮片中的表皮和真皮分離，37°C條件下將分離后的表皮組織加入到胰蛋白酶-EDTA溶液中消化30min，其中，胰蛋白酶濃度為2.5g/L，EDTA體積分?jǐn)?shù)為
0.02% ；
[0037]在表皮組織懸液中加入步驟(I)中配置的表皮細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化；
[0038]步驟(4)、將步驟(3)中的得到的表皮組織懸液以1500r/min離心30min，棄上清液，得到表皮組織細(xì)胞群；
[0039]步驟(5)、于培養(yǎng)瓶中加入2mL步驟(I)中配置的表皮細(xì)胞培養(yǎng)液，將步驟(4)中得到的表皮組織細(xì)胞群以I X 15個/mL接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，靜置60min后置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0040]接種3d后第一次換液，以后每隔2d換液一次，14d后終止培養(yǎng)。
[0041 ] 實施例3
[0042]步驟(I)、在KSFM培養(yǎng)液中加入胰島素10yg/mL，轉(zhuǎn)鐵蛋白0.7yg/mL，生長激素5yg/mL，鏈霉素50yg/mL，新霉素50yg/mL，視黃酸5 X lO^mol/L，配置成表皮細(xì)胞培養(yǎng)液；
[0043]步驟(2)、無菌條件下將包皮環(huán)切手術(shù)切下的包皮經(jīng)0.lmol/L磷酸緩沖溶液洗滌4次，將洗滌后的包皮組織剪碎至體積為0.7cm3;
[0044]步驟(3)、用無菌鑷和剪刀將步驟(2)中剪碎的包皮組織塊修剪去除皮下組織后，剪碎成體積為2.5mm3的皮片；
[0045]用無菌鑷和剪刀將皮片中的表皮和真皮分離，37°C條件下將分離后的表皮組織加入到胰蛋白酶-EDTA溶液中消化25min，其中，胰蛋白酶濃度為2.5g/L，EDTA體積分?jǐn)?shù)為
0.02% ；
[0046]在表皮組織懸液中加入步驟(I)中配置的表皮細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化；
[0047]步驟(4)、將步驟(3)中的得到的表皮組織懸液以1200r/min離心30min，棄上清液，得到表皮組織細(xì)胞群；
[0048]步驟(5)、于培養(yǎng)瓶中加入2mL步驟(I)中配置的表皮細(xì)胞培養(yǎng)液，將步驟(4)中得到的表皮組織細(xì)胞群以I X 15個/mL接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，靜置30-60min后置于37°C、5%⑶2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0049]接種3d后第一次換液，以后每隔2d換液一次，13d后終止培養(yǎng)。
[0050]本發(fā)明中提出的一種表皮細(xì)胞的擴(kuò)增制備方法，在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白，生長激素與視黃酸，胰島素可以提高體外培養(yǎng)的核分裂率，還能促進(jìn)表皮組織中DNA的合成，轉(zhuǎn)鐵蛋白可以結(jié)合、運(yùn)輸三價鐵離子，從而控制體液中自由鐵的平衡，視黃酸是維生素A中活性最強(qiáng)的衍生物，有控制表皮細(xì)胞正常生長分化的能力，并可抑制多種致癌因素誘發(fā)的體外培養(yǎng)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，所配置的培養(yǎng)液對表皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)具有促進(jìn)作用。
[0051]以上內(nèi)容僅僅是對本發(fā)明所作的舉例和說明，所屬本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對所描述的具體實施例做各種各樣的修改或補(bǔ)充或采用類似的方式替代，只要不偏離發(fā)明或者超越本權(quán)利要求書所定義的范圍，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項】
1.一種表皮細(xì)胞的擴(kuò)增制備方法，其特征在于按照如下步驟進(jìn)行: 步驟(I)、配置表皮細(xì)胞培養(yǎng)液； 步驟(2)、無菌條件下將包皮環(huán)切手術(shù)切下的包皮洗滌并剪碎； 步驟(3)、將所述步驟(2)中剪碎的包皮組織塊修剪去除皮下組織后，剪碎并將表皮和真皮分離;將分離后的表皮組織加入胰蛋白酶-EDTA溶液中消化20-30min后，加入步驟(I)中配置的表皮細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化； 步驟(4)、將所述步驟(3)中的得到的表皮組織懸液離心，棄上清液，得到表皮組織細(xì)胞群； 步驟(5)、于培養(yǎng)瓶中加入2mL所述步驟(I)中配置的表皮細(xì)胞培養(yǎng)液，將所述步驟(4)中得到的表皮組織細(xì)胞群以I X 15個/mL接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，靜置30-60min后置于37°C、5 %CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);接種3d后第一次換液，以后每隔2d換液一次，12-14d后終止培養(yǎng)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表皮細(xì)胞的擴(kuò)增制備方法，其特征在于:所述步驟(I)中表皮細(xì)胞培養(yǎng)液包括基礎(chǔ)培養(yǎng)液以及胰島素8-12yg/mL，轉(zhuǎn)鐵蛋白0.5-lyg/mL，生長激素5μg/mL，抗生素 50_100yg/mL，視黃酸 5 X 10—7mol/L。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種表皮細(xì)胞的擴(kuò)增制備方法，其特征在于:所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液為無血清培養(yǎng)液D-KSFM或KSFM中的一種。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種表皮細(xì)胞的擴(kuò)增制備方法，其特征在于:所述抗生素為氯霉素、新霉素中的一種或兩種混合。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表皮細(xì)胞的擴(kuò)增制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中將包皮環(huán)切手術(shù)切下的包皮用0.lmol/L磷酸緩沖溶液洗滌3-5次后剪碎至體積為0.5-1cm306.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表皮細(xì)胞的擴(kuò)增制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中將包皮組織剪碎成體積為2-3_3的皮片。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表皮細(xì)胞的擴(kuò)增制備方法，其特征在于:步驟(3)中所述胰蛋白酶-EDTA溶液中胰蛋白酶濃度為2.5g/L，EDTA體積分?jǐn)?shù)為0.02 %。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表皮細(xì)胞的擴(kuò)增制備方法，其特征在于:所述步驟(4)中離心速率為800-1500r/min，離心時間為30min。
【文檔編號】C12N5/071GK105950543SQ201610569865
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年7月19日
【發(fā)明人】張正亮
【申請人】安徽惠恩生物科技股份有限公司