一種油茶原生質(zhì)體的制備和純化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種油茶原生質(zhì)體的制備和純化方法，屬于植物原生質(zhì)體技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的油茶原生質(zhì)體的制備和純化方法與酶法制備原生質(zhì)體相比，本發(fā)明制備的原生質(zhì)體不會(huì)受酶等化學(xué)試劑的傷害，所需時(shí)間短，費(fèi)用低。本發(fā)明的油茶原生質(zhì)體的制備和純化方法能夠?yàn)橛筒柙|(zhì)體的培養(yǎng)、融合和基因轉(zhuǎn)化等原生質(zhì)體下游實(shí)驗(yàn)提供大量材料。
【專利說明】
一種油茶原生質(zhì)體的制備和純化方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及植物原生質(zhì)體技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種油茶原生質(zhì)體的制備和純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]油茶屬常綠小喬木。因其種子可榨油(茶油)供食用，故名。茶油色清味香，營養(yǎng)豐富，耐貯藏，是優(yōu)質(zhì)食用油;也可作為潤(rùn)滑油、防銹油用于工業(yè)。茶餅既是農(nóng)藥，又是肥料，可提高農(nóng)田蓄水能力和防治稻田害蟲。果皮是提制栲膠的原料。
[0003]油茶喜溫暖，怕寒冷，要求年平均氣溫16?18°C，花期平均氣溫為12?13°C。突然的低溫或晚霜會(huì)造成落花、落果。要求有較充足的陽光，否則只長(zhǎng)枝葉，結(jié)果少，含油率低。要求水分充足，年降水量一般在1000毫米以上，但花期連續(xù)降雨，影響授粉。要求在坡度和緩、侵蝕作用弱的地方栽植，對(duì)土壤要求不甚嚴(yán)格，一般適宜土層深厚的酸性土，而不適于石塊多和土質(zhì)堅(jiān)硬的地方。
[0004]原生質(zhì)體(protoplast):脫去細(xì)胞壁的細(xì)胞叫原生質(zhì)體，是一生物工程學(xué)的概念。原生質(zhì)體一詞來源于原生質(zhì)(protoplasm)。原生質(zhì)指組成細(xì)胞的有生命物質(zhì)的總稱，是物質(zhì)的概念。原生質(zhì)體是組成細(xì)胞的一個(gè)形態(tài)結(jié)構(gòu)單位。在細(xì)胞學(xué)歷史上，〃細(xì)胞"(cell)—詞是由Hooke提出的，意為〃小室〃。后來發(fā)現(xiàn)了原生質(zhì)，對(duì)細(xì)胞的認(rèn)識(shí)與Hooke時(shí)期不同了，1880年Hanstein提出〃原生質(zhì)體〃一詞。由于細(xì)胞一詞的出現(xiàn)較原生質(zhì)體早，故沿用至今。
[0005]植物原生質(zhì)體在科學(xué)研究中具有重要作用，在研究細(xì)胞壁再生機(jī)理、細(xì)胞對(duì)激素的作用機(jī)理、體細(xì)胞雜種的培育、轉(zhuǎn)入外源基因培育轉(zhuǎn)基因植株等方面都有應(yīng)用。一般制備原生質(zhì)體的方法有機(jī)械法和酶法。酶法由于操作簡(jiǎn)單，獲得的細(xì)胞數(shù)目多，目前應(yīng)用廣泛，但是酶等化學(xué)試劑會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不良影響，影響原生質(zhì)體的下游實(shí)驗(yàn)。機(jī)械法由于制備原生質(zhì)體的數(shù)量少?zèng)]有受到重視。機(jī)械法不受酶等試劑的影響，制備的原生質(zhì)體形態(tài)完整并且有活性，所需時(shí)間短，費(fèi)用低，是一種很有發(fā)展前景的方法。目前，油茶原生質(zhì)體的制備研究報(bào)道很少，用機(jī)械法制備油茶原生質(zhì)體的研究還沒有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供了一種油茶原生質(zhì)體的制備和純化方法。
[0007]本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0008]本發(fā)明的油茶原生質(zhì)體的制備和純化方法的具體步驟如下:
[0009]A制備方法:
[0010]Al從室外切取油茶一年生枝條，帶回水培1-2天；
[0011]A2取6片成熟葉，用刀片切去葉片的邊緣和葉片主脈，并在葉片每隔0.5-lcm的位置切上一些縫隙，但不要切斷葉片；
[0012]A3將帶有縫隙的葉塊浸入蔗糖溶液中進(jìn)行質(zhì)壁分離0.5-lh，期間用鑷子將上浮葉塊壓入蔗糖溶液中；[〇〇13] A4取出葉塊，用鋒利的刀片與葉塊成45°把葉塊切成細(xì)長(zhǎng)條，越細(xì)越好；[〇〇14] A5將細(xì)葉條轉(zhuǎn)移到盛有3ml葉條洗滌液的容器中，放置30s-lmin;6片葉可以分3-4 批來切條加入到洗滌液中，以材料在溶液中不擁擠為限度；[〇〇15] A6用鑷子將每次洗滌過的葉條取出，放入2ml 13%甘露醇CPW溶液中，放置5-15min; 3-4批細(xì)葉條的原生質(zhì)體依次收集在同一管溶液中；
[0016]A7用鑷子去掉葉條，得到油茶原生質(zhì)體溶液。
[0017]2原生質(zhì)體純化:
[0018]B1在油茶原生質(zhì)體溶液的底部加入蔗糖溶液，原生質(zhì)體溶液與蔗糖溶液的體積比是1:1，漂洗原生質(zhì)體l_5min;[〇〇19] B2轉(zhuǎn)移上層原生質(zhì)體溶液到離心管中，進(jìn)行離心，去掉上清液；[〇〇2〇] B3沉淀用等量蔗糖溶液懸浮，再離心，去掉上清液；[0021 ] B4沉淀用等量蔗糖溶液懸浮，再離心，留下上清液，去掉沉淀；[〇〇22] B5上清液經(jīng)再次離心，去掉上清液，沉淀用少量的質(zhì)量-體積百分比濃度是18 %蔗糖溶液懸浮并轉(zhuǎn)移到新離心管中；[〇〇23] B6將原生質(zhì)體懸浮液加在蔗糖溶液上漂洗l-5min，取出上層液即為純化的原生質(zhì)體溶液。[〇〇24]步驟A3和B1中，蔗糖溶液的質(zhì)量-體積百分比濃度為35%。[〇〇25]步驟A5中，所述的葉條洗滌液的成分是含有0.03%CaCl2、0.1 %NaCl和0.075%MgCl2的35 %蔗糖溶液，其中，各種成分的濃度均為質(zhì)量-體積百分濃度，單位為g/ml。[〇〇26]步驟A6中，所述的13 %甘露醇CPW溶液的成分為:10A0mg/L硝酸鉀，27.2mg/L碳酸二氫鉀，1480 ? Omg/L二水氯化鈣，264 ? Omg/L七水硫酸鎂，0 ? 16mg/L碘化鉀，0 ? 025mg/L五水硫酸銅，13 % W/V甘露醇。
[0027]步驟B2中，離心的速率為1500rpm，時(shí)間為8min。
[0028]步驟B3中，離心的速率為lOOOrpm，時(shí)間為8min
[0029]步驟B4中，離心的速率為lOOrprn，時(shí)間為l-2min。[〇〇3〇]步驟B2和B3中，所述的蔗糖溶液的質(zhì)量-體積百分比濃度為18%。[〇〇31]步驟B5中，離心的速率為500rpm，時(shí)間為12min。[〇〇32]步驟B6中，所述的蔗糖溶液的質(zhì)量-體積百分比濃度為25%。[〇〇33]本發(fā)明的積極效果如下:
[0034]本發(fā)明的油茶原生質(zhì)體的制備和純化方法與酶法制備原生質(zhì)體相比，本發(fā)明制備的原生質(zhì)體不會(huì)受酶等化學(xué)試劑的傷害，所需時(shí)間短，費(fèi)用低。本發(fā)明的油茶原生質(zhì)體的制備和純化方法能夠?yàn)橛筒柙|(zhì)體的培養(yǎng)、融合和基因轉(zhuǎn)化等原生質(zhì)體下游實(shí)驗(yàn)提供大量材料?！靖綀D說明】[〇〇35]圖1是機(jī)械法制備的原生質(zhì)體的顯微鏡圖。[〇〇36]①原生質(zhì)體，②雜質(zhì)。
[0037]取一年生的油茶枝條帶入室內(nèi)水培1-2天，能夠促使葉片細(xì)胞中淀粉轉(zhuǎn)化成可溶性糖，增加細(xì)胞對(duì)逆境的抵抗力，有利于葉片細(xì)胞在質(zhì)量-體積百分比為35%蔗糖溶液中進(jìn)行質(zhì)壁分離的條件下保持細(xì)胞的活性。把經(jīng)過質(zhì)壁分離的成熟油茶葉片切條后放入洗滌液中30s-lmin，能夠除去細(xì)胞中大量的果膠、多糖、蛋白質(zhì)和單寧等物質(zhì)和葉片碎塊；同時(shí)洗滌液中含有較高濃度的Na+能夠減少細(xì)胞壁中果膠和多糖等物質(zhì)與原生質(zhì)體的相互作用，Ca2+和Mg2+能夠保持原生質(zhì)膜的穩(wěn)定性并且能夠使果膠等物質(zhì)聚集，使個(gè)得細(xì)葉條從洗滌液轉(zhuǎn)移到13 %甘露醇CPW溶液中進(jìn)行質(zhì)壁分離復(fù)員的時(shí)候，從葉片的切口處順利流出原生質(zhì)體干凈得多了。另外一方面，質(zhì)壁分離后的細(xì)葉條分批次地轉(zhuǎn)移到少量的13%甘露醇CPW溶液(2ml)中通過質(zhì)壁分離復(fù)員方法可以收集到6片油茶葉(1.2g左右)的原生質(zhì)體，這樣可以減少細(xì)葉條中果膠和多糖等物質(zhì)的流出，但不影響細(xì)胞的流出。所以，用這種方法制備的原生質(zhì)體溶液中細(xì)胞數(shù)量多并且形態(tài)清晰(圖1)，雜質(zhì)相對(duì)較少，有利于原生質(zhì)體的純化。
[0038]圖2是本發(fā)明實(shí)施例3制備、純化的原生質(zhì)體的顯微鏡圖。
[0039]①原生質(zhì)體，②雜質(zhì)
[0040]用13%甘露醇C P W溶液收集到的原生質(zhì)體溶液(2 m I )，體積較大并且還存在雜質(zhì)多。在純化過程中，這種溶液經(jīng)過3次降速離心和2次降低濃度的蔗糖溶液漂浮去掉了大量的雜質(zhì)，獲得了較純的原生質(zhì)體。原生質(zhì)體溶液的體積由純化前的2ml降低到了 200yL，使得在溶液中的原生質(zhì)體的密度大大地提高了(圖2)，密度為3.1 XlOVml，雜質(zhì)少了。純化后的原生質(zhì)體的形態(tài)完整，細(xì)胞膜邊緣干凈。用這種方法制備的原生質(zhì)體的數(shù)量能夠達(dá)到5.1 X15個(gè)/g.FW，因此.用這種方法制備原生質(zhì)體具有應(yīng)用價(jià)值。
[0041]圖3是經(jīng)苔盼藍(lán)染色的原生質(zhì)體的顯微鏡圖。
[0042]①原生質(zhì)體
[0043]用苔盼藍(lán)染色原生質(zhì)體的的方法:取含質(zhì)量-體積百分?jǐn)?shù)為18%蔗糖的原生質(zhì)體溶液I滴，滴在載玻片上。用濃度為0.4 %的苔盼藍(lán)溶液染色，使染色的終濃度達(dá)到0.04%。染色3-5min。時(shí)間不能過長(zhǎng)，否則活細(xì)胞也會(huì)被染色。放在顯微鏡下觀察，染上藍(lán)色的為死細(xì)胞，沒有染上顏色的為活細(xì)胞。圖3顯示，原生質(zhì)體沒有變藍(lán)色，說明用這種方法制備的原生質(zhì)體是有活力的。
[0044]圖4是融合的原生質(zhì)體的顯微鏡圖。
[0045]①2個(gè)細(xì)胞正在融合的原生質(zhì)體
[0046]用PEG結(jié)合高Ca2+-高pH的誘導(dǎo)融合法來融合油茶葉片的原生質(zhì)體。步驟是:①用膠頭滴管取原生質(zhì)體溶液，滴2滴在一塊干凈的載玻片上靜置8-10min，使原生質(zhì)體在載玻片上形成一薄層。②將2滴PEG融合液滴在原生質(zhì)體上，靜置10-15min，使原生質(zhì)體之間粘連在一起。③每隔5min滴2滴高Ca2+-高pH溶液在原生質(zhì)體上，進(jìn)行3次共6滴。④蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去多余的溶液，置于顯微鏡下觀察細(xì)胞融合情況(圖4)?？梢杂^察到2個(gè)細(xì)胞融合的百分?jǐn)?shù)是11%，說明用這種方法制備的原生質(zhì)體是有活性的。原生質(zhì)體經(jīng)過苔盼藍(lán)染色和細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)，結(jié)果都表明用這種方法制備的原生質(zhì)體是有活性的，因此，用這種機(jī)械法制備的原生質(zhì)體可以用于細(xì)胞培養(yǎng)、融合和轉(zhuǎn)基因等原生質(zhì)體的下游實(shí)驗(yàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0047]下面的實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0048]實(shí)施例1
[0049]本發(fā)明的油茶原生質(zhì)體的制備和純化方法的具體步驟如下:
[0050]1制備方法:[0051 ]A1從室外切取油茶一年生枝條，帶回水培1-2天；
[0052]A2取6片成熟葉，用刀片切去葉片的邊緣和葉片主脈，并在葉片每隔0.5cm的位置切上一些縫隙，但不要切斷葉片；[〇〇53]A3將帶有縫隙的葉塊浸入蔗糖溶液中進(jìn)行質(zhì)壁分離0.5h，期間用鑷子將上浮葉塊壓入蔗糖溶液中；
[0054]A4取出葉塊，用鋒利的刀片與葉塊成45°把葉塊切成細(xì)長(zhǎng)條，越細(xì)越好；[〇〇55]A5將細(xì)葉條轉(zhuǎn)移到盛有葉條洗滌液的容器中，放置30s左右;6片葉可以分3-4批加入到洗滌液中，以材料在溶液中不擁擠為限度；[〇〇56]A6用鑷子將每次洗滌過的葉條取出，放入13%甘露醇CPW溶液中，放置5min; 3-4批細(xì)葉條的原生質(zhì)體依次收集在同一管溶液中；[〇〇57]A7用鑷子去掉葉條，得到油茶原生質(zhì)體溶液；[〇〇58]2原生質(zhì)體純化:
[0059]B1在油茶原生質(zhì)體溶液的底部加入蔗糖溶液，原生質(zhì)體溶液與蔗糖溶液的體積比是1:1，漂洗原生質(zhì)體lmin;
[0060]B2轉(zhuǎn)移上層原生質(zhì)體溶液到離心管中，進(jìn)行離心，去掉上清液；[0061 ]B3沉淀用等量蔗糖溶液懸浮，再離心，去掉上清液；
[0062]B4沉淀用等量蔗糖溶液懸浮，再離心，留下上清液，去掉沉淀；[〇〇63]B5上清液經(jīng)再次離心，去掉上清液，沉淀用少量的質(zhì)量-體積百分比濃度為18 %蔗糖溶液懸浮原生質(zhì)體并轉(zhuǎn)移到離心管中；[〇〇64]B6將原生質(zhì)體懸浮液加在蔗糖溶液上漂洗l-5min，取出上層液即為純化的原生質(zhì)體溶液。[〇〇65]步驟A3和B1中，蔗糖溶液的質(zhì)量-體積百分比濃度為35%。[〇〇66]步驟A5中，所述的葉條洗滌液的成分是含有0.03%CaCl2、0.1 %NaCl和0.075%MgCl2的35 %蔗糖溶液，其中，各種成分的濃度均為質(zhì)量-體積百分比濃度，單位為g/ml。 [〇〇67]步驟A6中，所述的13 %甘露醇CPW溶液的成分為:10A0mg/L硝酸鉀，27.2mg/L碳酸二氫鉀，1480 ? Omg/L二水氯化鈣，264 ? Omg/L七水硫酸鎂，0 ? 16mg/L碘化鉀，0 ? 025mg/L五水硫酸銅，13 % W/V甘露醇。
[0068]步驟B2中，離心的速率為1500rpm，時(shí)間為8min。
[0069]步驟B3中，離心的速率為lOOOrpm，時(shí)間為8min。[〇〇7〇]步驟B4中，離心的速率為lOOrprn，時(shí)間為l-2min。[〇〇71]步驟B2和B3中，所述的蔗糖溶液的質(zhì)量-體積百分比濃度為18%。
[0072]步驟B5中，離心的速率為500rpm，時(shí)間為12min。[〇〇73]步驟B6中，所述的蔗糖溶液的質(zhì)量-體積百分比濃度為25%。
[0074]實(shí)施例2
[0075]本發(fā)明的油茶原生質(zhì)體的制備和純化方法的具體步驟如下:
[0076]1制備方法:
[0077]A1從室外切取油茶一年生枝條，帶回水培1-2天；
[0078]A2取6片葉，用刀片切去葉片的邊緣和葉片主脈，并將葉片每隔lcm的位置切上一些縫隙，但不要切斷葉片；
[0079]A3將帶有縫隙的葉塊浸入蔗糖溶液中進(jìn)行質(zhì)壁分離lh，期間用鑷子將上浮葉塊壓入蔗糖溶液中；
[0080]A4取出葉塊，用鋒利的刀片與葉塊成45ο把葉塊切成細(xì)長(zhǎng)條；
[0081]Α5將細(xì)葉條轉(zhuǎn)移到盛有葉條洗滌液的容器中，放置Imin;6片葉可以分3-4批加入到洗滌液中，以材料在溶液中不擁擠為限度；
[0082]Α6用鑷子將每次洗滌過的葉條取出，放入13%甘露醇CPW溶液中，放置15min;3-4批細(xì)葉條的原生質(zhì)體依次收集在同一管溶液中；
[0083]A7用鑷子去掉葉條，得到油茶原生質(zhì)體溶液；
[0084]2原生質(zhì)體純化:
[0085]BI在油茶原生質(zhì)體溶液的底部加入蔗糖溶液，原生質(zhì)體溶液與蔗糖溶液的體積比是1:1，漂洗原生質(zhì)體5min;
[0086]B2轉(zhuǎn)移上層原生質(zhì)體溶液到離心管中，進(jìn)行離心，去掉上清液；
[0087]B3沉淀用等量蔗糖溶液懸浮，再離心，去掉上清液；
[0088]B4沉淀用等量蔗糖溶液懸浮，再離心，留下上清液，去掉沉淀；
[0089]B5上清液經(jīng)再次離心，去掉上清液，沉淀用少量的質(zhì)量-體積百分比濃度是18 %的蔗糖溶液懸浮原生質(zhì)體并轉(zhuǎn)移到離心管中；
[0090]B6將原生質(zhì)體懸浮液加在蔗糖溶液上漂洗5min，取出上層液即為純化的原生質(zhì)體溶液。
[0091 ]步驟A3和BI中，蔗糖溶液的質(zhì)量-體積百分比濃度為35%。
[0092]步驟A5中，所述的葉條洗滌液的成分是含有0.03%CaCl2、0.1 %NaCl和0.075%MgCl2的35 %蔗糖溶液，其中，各種成分的濃度均為質(zhì)量-體積百分比濃度，單位為g/ml。
[0093]步驟A6中，所述的13 %甘露醇CPW溶液的成分為:10A0mg/L硝酸鉀，27.2mg//L碳酸二氫鉀，1480.0mg/L 二水氯化鈣，264.0mg/L七水硫酸鎂，0.16mg/L碘化鉀，0.025mg/L五水硫酸銅，13% W/V甘露醇。
[0094]步驟B2中，離心的速率為1500rpm，時(shí)間為8min。
[0095]步驟B3中，離心的速率為lOOOrpm，時(shí)間為8min。
[0096]步驟B4中，離心的速率為lOOrpm，時(shí)間為l_2min。
[0097]步驟B2和B3中，所述的蔗糖溶液的質(zhì)量-體積百分比濃度為18%。
[0098]步驟B5中，離心的速率為500rpm，時(shí)間為12min。
[0099]步驟B6中，所述的蔗糖溶液的質(zhì)量-體積百分比濃度為25%。
[0100]實(shí)施例3
[0101 ]本發(fā)明的油茶原生質(zhì)體的制備和純化方法的具體步驟如下:
[0102]制備方法；
[0103]A從室外切取油茶一年生枝條，帶回實(shí)驗(yàn)室水培1-2天，B取6片葉，用刀片切去葉片的邊緣和葉片主脈，并將葉片每隔0.5-1CM的位置切上一些縫隙，但不要切斷葉片。
[0104]3.將帶有縫隙的葉塊浸入35%蔗糖溶液中進(jìn)行質(zhì)壁分離0.5-lh左右，期間用鑷子將上浮葉塊壓入蔗糖溶液中。
[0105]4.取出葉塊放在載玻片上，用鋒利的刀片與葉塊成45°把葉塊切成0.5mm寬的長(zhǎng)條，越細(xì)越好。
[0106]5.將細(xì)葉條轉(zhuǎn)移到盛有3ml葉條洗滌液的試管中，放置30s-lmin左右。6片葉可以分3-4批加入到洗滌液中，以材料在溶液中不擁擠為限度。[〇1〇7]6.用鑷子將每次洗滌過的葉條取出，放入2ml的13 %甘露醇CPW溶液中，放置lOmin左右。3-4批細(xì)葉條的原生質(zhì)體依次收集在同一管溶液中；
[0108]7.用鑷子去掉葉條，得到油茶原生質(zhì)體溶液。
[0109]原生質(zhì)體純化方法:
[0110]A用移液槍在油茶原生質(zhì)體溶液的試管底部放入2ml 35%蔗糖溶液，漂洗原生質(zhì)體3min左右。
[0111]B轉(zhuǎn)移上層原生質(zhì)體溶液到離心管中，1500rpm離心8min，去掉上清液。
[0112]3.沉淀用2ml 18%蔗糖溶液懸浮，lOOOrpm離心8min，去掉上清液。
[0113]4.沉淀用2ml 18 %蔗糖溶液懸浮，lOOrpm離心l-2min，留下上清液，去掉沉淀。
[0114]5.上清液經(jīng)500rpm離心12min，去掉上清液，沉淀用200yL質(zhì)量-體積百分比濃度為 18 %蔗糖溶液懸浮原生質(zhì)體并轉(zhuǎn)移到A5ml的離心管中。
[0115]6.將原生質(zhì)體懸浮液加在質(zhì)量-體積百分比濃度為25 %蔗糖溶液上漂洗3min左右，取出上清液即為純化的原生質(zhì)體溶液。
[0116]盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以理解在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求及其等同物限定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種油茶原生質(zhì)體的制備和純化方法，其特征在于:所述方法的具體步驟如下: A制備方法: Al從室外切取油茶一年生枝條，帶回水培1-2天； A2取6片成熟葉，用刀片切去葉片的邊緣和葉片主脈，并在葉片每隔0.5-lcm的位置切上一些縫隙，但不要切斷葉片； A3將帶有縫隙的葉塊浸入蔗糖溶液中進(jìn)行質(zhì)壁分離0.5-lh，期間用鑷子將上浮葉塊壓入蔗糖溶液中； A4取出葉塊，用刀片與葉塊成45°把葉塊切成細(xì)長(zhǎng)條，越細(xì)越好； A5將細(xì)葉條轉(zhuǎn)移到盛有葉條洗滌液的容器中，放置30s-lmin;6片葉可以分3-4批來切條加入到洗滌液中，以材料在洗滌液中不擁擠為限度； A6用鑷子將每次洗滌過的葉條取出，放入13%甘露醇CPW溶液中，放置5-15min;3-4批細(xì)葉條的原生質(zhì)體依次收集在同一管溶液中； A7用鑷子去掉葉條，得到油茶原生質(zhì)體溶液； B原生質(zhì)體純化: BI在油茶原生質(zhì)體溶液的底層加入蔗糖溶液，原生質(zhì)體溶液與蔗糖溶液的體積比是1:1，漂洗原生質(zhì)體l_5min; B2轉(zhuǎn)移上層原生質(zhì)體溶液到離心管中，進(jìn)行離心，去掉上清液； B3沉淀用等量蔗糖溶液懸浮，再離心，去掉上清液； B4沉淀用等量蔗糖溶液懸浮，再離心，留下上清液，去掉沉淀； B5上清液經(jīng)再次離心，去掉上清液，沉淀用200yL質(zhì)量-體積百分比濃度為18%蔗糖溶液懸浮原生質(zhì)體并轉(zhuǎn)移到離心管中； B6將原生質(zhì)體懸浮液加在蔗糖溶液上漂洗l-5min，取出上層液即為純化的原生質(zhì)體溶液。2.如權(quán)利要求1所述的油茶原生質(zhì)體的制備和純化方法，其特征在于:步驟A3和BI中，蔗糖溶液的質(zhì)量-體積百分比濃度為35%。3.如權(quán)利要求1所述的油茶原生質(zhì)體的制備和純化方法，其特征在于:步驟A5中，所述的葉條洗滌液的成分是含有0.03%CaCl2、0.1 %NaCl和0.075%MgCl2的35%蔗糖溶液，其中，各種成分的濃度均為質(zhì)量-體積百分比濃度，單位為g/ml。4.如權(quán)利要求1所述的油茶原生質(zhì)體的制備和純化方法，其特征在于:步驟A6中，所述的13 %甘露醇CPW溶液的成分為:101.0mg/L硝酸鉀，27.2mg/L碳酸二氫鉀，1480.0mg/L 二水氯化鈣，264.0mg/L七水硫酸鎂，0.16mg/L碘化鉀，0.025mg/L五水硫酸銅，13 % W/V甘露醇。5.如權(quán)利要求1所述的油茶原生質(zhì)體的制備和純化方法，其特征在于:步驟B2中，離心的速率為1500rpm，時(shí)間為8min;步驟B3中，離心的速率為100rpm，時(shí)間為8min。6.如權(quán)利要求1所述的油茶原生質(zhì)體的制備和純化方法，其特征在于:步驟B4中，離心的速率為10rpm，時(shí)間為l_2min。7.如權(quán)利要求1所述的油茶原生質(zhì)體的制備和純化方法，其特征在于:步驟B2和B3中，所述的蔗糖溶液的質(zhì)量-體積百分比濃度為18%。8.如權(quán)利要求1所述的油茶原生質(zhì)體的制備和純化方法，其特征在于:步驟B5中，離心的速率為500rpm，時(shí)間為12min。9.如權(quán)利要求1所述的油茶原生質(zhì)體的制備和純化方法，其特征在于:步驟B6中，所述 的蔗糖溶液的質(zhì)量-體積百分比濃度為25%。
【文檔編號(hào)】C12N5/04GK105969718SQ201610559094
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年7月15日
【發(fā)明人】黃國文
【申請(qǐng)人】湖南科技學(xué)院