一種嵌合抗原受體、以及快速構(gòu)建嵌合抗原受體的方法及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種嵌合抗原受體、以及快速構(gòu)建嵌合抗原受體的方法及應(yīng)用，使用本發(fā)明的方法可以快速構(gòu)建針對(duì)不同腫瘤抗原的新一代CAR(嵌合抗原受體)載體。利用本發(fā)明制備的針對(duì)CD19分子的新一代CAR?T細(xì)胞對(duì)CD19陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞顯現(xiàn)出明顯的殺傷效果。
【專利說(shuō)明】
一種嵌合抗原受體、以及快速構(gòu)建嵌合抗原受體的方法及 應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種嵌合抗原受體、以及快速構(gòu) 建嵌合抗原受體的方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在國(guó)際上，一種新型的過(guò)繼細(xì)胞免疫治療技術(shù)異軍突起，這就是應(yīng)用嵌合抗原受 體基因修飾的T細(xì)胞過(guò)繼性地靶向性治療腫瘤的研究，該研究在臨床上取得了非常顯著的 進(jìn)展。
[0003] 嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor, CAR)基因修飾的T淋巴細(xì)胞（以下 簡(jiǎn)稱CAR-T細(xì)胞）技術(shù)是一種非常有前景的新的ACI (基于T細(xì)胞的過(guò)繼性細(xì)胞免疫治療， adoptive cellular immunotherapy),其突出特點(diǎn)是高度特異性、非組織相容性抗原（MHC) 限制性及強(qiáng)烈而持久的殺瘤效應(yīng)。多種腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)特異性抗原，這也就為CAR-T細(xì) 胞技術(shù)提供了良好的免疫治療靶點(diǎn)。
[0004] CAR的結(jié)構(gòu)分為胞外抗原接合區(qū)、絞鏈區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)區(qū)，其抗腫瘤效應(yīng)依 賴于胞外抗原結(jié)合區(qū)的靶向性、絞鏈區(qū)的靈活性、胞內(nèi)信號(hào)區(qū)供刺激分子及T細(xì)胞活化序 列的協(xié)同作用。由于CAR的抗腫瘤效應(yīng)受到多方面的限制，因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員致力于開(kāi) 發(fā)新型的具有更強(qiáng)的殺傷效果的CAR-T技術(shù)，以用于腫瘤等疾病的治療和預(yù)防。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供嵌合抗原受體、以及快速構(gòu)建嵌合抗原受體載體的方法及 應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種嵌合抗原受體（CAR)，所述嵌合抗原受體具有式 la、或式lb所述結(jié)構(gòu)：
[0007] A-B-C-D(Ia)，或
[0008] A-C-B-D(Ib),
[0009] 其中，
[0010] A為Fc來(lái)源的多肽元件；
[0011] B為⑶28來(lái)源的多肽元件；
[0012] C為⑶137來(lái)源的多肽元件；
[0013] D為⑶3 δ來(lái)源的多肽元件；
[0014] " "表示連接上述各元件的肽鍵或肽接頭。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述多肽元件Α選自下組：
[0016] ㈧具有SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的多肽；
[0017] (B)具有與SEQ ID N0:2中任一所示氨基酸序列彡80 %同源性（優(yōu)選地，彡90% 的同源性；等優(yōu)選地彡95%的同源性；最優(yōu)選地，彡97%的同源性）的多肽；
[0018] (C)將SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列經(jīng)過(guò)1-5個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加 而形成的衍生多肽。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述多肽元件B選自下組：
[0020] ㈧具有SEQ ID N0:4所示氨基酸序列的多肽；
[0021] (B)具有與SEQ ID N0:4中任一所示氨基酸序列彡80 %同源性（優(yōu)選地，彡90% 的同源性；等優(yōu)選地彡95%的同源性；最優(yōu)選地，彡97%的同源性）的多肽；
[0022] (C)將SEQ ID N0:4中任一所示氨基酸序列經(jīng)過(guò)1-5個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或 添加而形成的衍生多肽。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述多肽元件C選自下組：
[0024] (A)具有SEQ ID N0:6所示氨基酸序列的多肽；
[0025] (B)具有與SEQ ID N0:6所示氨基酸序列彡80 %同源性（優(yōu)選地，彡90 %的同源 性；等優(yōu)選地彡95%的同源性；最優(yōu)選地，彡97%的同源性）的多肽；
[0026] (C)將SEQ ID N0:6中所示氨基酸序列經(jīng)過(guò)1-5個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加 而形成的衍生多肽。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述多肽元件C的長(zhǎng)度為30-50個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選為42個(gè)氨 基酸。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述多肽元件D選自下組：
[0029] (A)具有SEQ ID N0:8所示氨基酸序列的多肽；
[0030] (B)具有與SEQ ID N0:8所示氨基酸序列彡80 %同源性（優(yōu)選地，彡90 %的同源 性；等優(yōu)選地彡95%的同源性；最優(yōu)選地，彡97%的同源性）的多肽；
[0031] (C)將SEQ ID N0:8所示氨基酸序列經(jīng)過(guò)1-5個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而 形成的衍生多肽。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述多肽元件D的長(zhǎng)度為80-120個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選為112個(gè) 氣基酸殘基。
[0033] 在另一優(yōu)選例中，所述嵌合抗原受體的氨基酸序列如SEQ ID N0. : 10所示。
[0034] 在另一優(yōu)選例中，將所述嵌合抗原受體表達(dá)于T細(xì)胞時(shí)，所述T細(xì)胞具有以下特 性：
[0035] a)具有特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的能力；
[0036] b)誘導(dǎo)殺傷性細(xì)胞因子產(chǎn)生的能力；
[0037] c)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷不依賴于MHC的表達(dá)；和/或
[0038] d)具有較長(zhǎng)的體內(nèi)存活時(shí)間。
[0039] 在另一優(yōu)選例中，所述多肽元件A的外側(cè)連接有單克隆抗體。
[0040] 在另一優(yōu)選例中，所述單克隆抗體特異性的識(shí)別腫瘤標(biāo)志性抗原。
[0041] 在另一優(yōu)選例中，所述單克隆抗體為單鏈抗體（seFv)。
[0042] 在另一優(yōu)選例中，所述單克隆抗體為抗CD19單克隆抗體。
[0043] 在另一優(yōu)選例中，所述多肽元件A和所述單克隆抗體之間由肽接頭連接，優(yōu)選地， 所述肽接頭長(zhǎng)度為2-5個(gè)氨基酸。
[0044] 本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸編碼本發(fā)明第一 方面所述的嵌合抗原受體。
[0045] 在另一優(yōu)選例中，所述多核苷酸選自下組：
[0046] (a)編碼如SEQ ID N0. : 10所示多肽的多核苷酸；
[0047] (b)序列如SEQ ID N0. : 9所示的多核苷酸；
[0048] (c)核苷酸序列與（b)所示序列的同源性彡95% (較佳地彡98% )的多核苷酸；
[0049] (d)如（b)所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短或添加1-60個(gè)（較佳地1-30， 更佳地卜1〇個(gè)）核苷酸的多核苷酸；
[0050] (e)與（a)-(d)任一所述的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
[0051] 在另一優(yōu)選例中，所述的多核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示。
[0052] 本發(fā)明的第三方面，提供了一種載體，所述載體包括本發(fā)明第二方面所述的多核 苷酸。
[0053] 在另一優(yōu)選例中，所述載體選自：慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、和睡美人表達(dá)系 統(tǒng)。
[0054] 在另一優(yōu)選例中，所述載體以cdh-cmv-efl-copgfp慢病毒載體為骨架。
[0055] 本發(fā)明的第四方面，提供了一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞表達(dá)本發(fā)明第一方面所 述的嵌合抗原受體；和/或
[0056] 所述宿主細(xì)胞基因組中整合有本發(fā)明第二方面所述的多核苷酸；和/或
[0057] 所述宿主細(xì)胞含有本發(fā)明第三方面所述的載體。
[0058] 在另一優(yōu)選例中，所述宿主細(xì)胞為T(mén)細(xì)胞，或含有T細(xì)胞的細(xì)胞群。
[0059] 本發(fā)明的第五方面，提供了一種制備嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞的方法，包括步 驟：
[0060] 在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明第四方面所述的宿主細(xì)胞，從而制備出嵌合抗 原受體修飾的τ細(xì)胞。
[0061] 在另一優(yōu)選例中，所述方法包括步驟：
[0062] (1)構(gòu)建慢病毒載體
[0063] 所述慢病毒載體包含式II所示的核苷酸序列：
[0064] e-i II
[0065] i為編碼本發(fā)明第一方面所述的CAR的核苷酸序列，
[0066] e為編碼抗體的核苷酸序列，
[0067] e連接于多肽元件A的編碼序列的外側(cè)；
[0068] (2)慢病毒包裝
[0069] 將步驟（1)的慢病毒載體,用慢病毒包裝系統(tǒng)和293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝，收獲 病毒液，
[0070] 所述慢病毒包裝系統(tǒng)包括質(zhì)粒：Rev質(zhì)粒、VSV-G質(zhì)粒、和Λ R質(zhì)粒；
[0071] (3) Τ細(xì)胞轉(zhuǎn)染
[0072] 將步驟（2)獲得病毒液濃縮后轉(zhuǎn)染Τ細(xì)胞，即獲得所述嵌合抗原受體修飾的Τ細(xì) 胞。
[0073] 在另一優(yōu)選例中，所述抗體為單鏈抗體。
[0074] 在另一優(yōu)選例中，所述單鏈抗體為特異性識(shí)別腫瘤抗原的抗體。
[0075] 在另一優(yōu)選例中，所述抗原為⑶19。
[0076] 在另一優(yōu)選例中，e具有SEQ ID NO. : 11所不的核苷酸序列。
[0077] 在另一優(yōu)選例中，i具有SEQ ID N0. :9所示的核苷酸序列。
[0078] 本發(fā)明的第六方面，提供了一種藥物組合物，所述組合物包含：本發(fā)明第一方面所 述的嵌合抗原受體、本發(fā)明第二方面所述的多核苷酸、本發(fā)明第三方面所述的載體、或者本 發(fā)明第四方面所述的宿主細(xì)胞，以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
[0079] 本發(fā)明的第七方面，提供了本發(fā)明第一方面所述的嵌合抗原受體、本發(fā)明
[0080] 第二方面所述的分離的多核苷酸的用途，
[0081] (1)用于制備治療腫瘤的藥物；和/或
[0082] (2)用于制備嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞。
[0083] 在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤選自下組：胃癌、肝癌、白血病、腎臟腫瘤、肺癌、小 腸癌、骨癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、大腸癌、前列腺癌、宮頸癌、腎上腺腫瘤、或膀胱腫 瘤。
[0084] 本發(fā)明的第九方面，提供了一種治療腫瘤的方法，包括步驟：給需要的對(duì)象施用本 發(fā)明第四方面所述的宿主細(xì)胞。
[0085] 在另一優(yōu)選例中，所述的對(duì)象是人。
[0086] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說(shuō)明】
[0087] 圖 1 為 Fc-CD28-CD137_CD3 δ 片段和 cdh-cmv-efl-copgfp 載體酶切圖（Ecorl/ Notl雙酶切）。
[0088] 其中泳道1和2代表Fc-⑶28-⑶137-⑶3 δ片段從T載體上切下來(lái)的酶切圖，泳 道3和4代表cdh-cmv-efl-copgfp載體的酶切圖。
[0089] 圖 2 為 Fc-CD28-CD137_CD3 δ 片段連接到 cdh-cmv-efl-copgfp 載體上的菌檢圖。 共挑了 10個(gè)克隆菌檢，菌檢到6個(gè)陽(yáng)性克隆，送公司測(cè)序，測(cè)序正確。Fc-⑶28-⑶137-⑶3 δ -cdh-cmv-efl-copgfp慢病毒載體構(gòu)建成功。
[0090] 圖3為用overlap PCR擴(kuò)增得到的⑶19單鏈抗體序列（VH-1 inker-VL)。
[0091] 圖 4 為 CD19 單鏈抗體序列插入到 Fc_CD28-CD137_CD3 δ -cdh-cmv-efl-copgfp 慢 病毒載體的菌檢圖。挑了 18個(gè)克隆菌檢，共檢測(cè)到9個(gè)陽(yáng)性克隆，挑取三個(gè)送公司測(cè)序，測(cè) 序正確，新一代⑶19-CAR載體構(gòu)建成功。
[0092] 圖5為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的利用本發(fā)明構(gòu)建的新一代CD19-CAR載體在T細(xì)胞表面 上的表達(dá)情況。結(jié)果顯示有30%的細(xì)胞是Fc與GFP(慢病毒載體本身表達(dá)GFP蛋白）雙陽(yáng) 性，說(shuō)明利用本發(fā)明構(gòu)建的新一代⑶19-CAR能夠在T細(xì)胞表面表達(dá)，且轉(zhuǎn)染效率為30%。
[0093] 圖6所示為我們構(gòu)建的新一代（三代）⑶19-CAR-T細(xì)胞對(duì)⑶19陽(yáng)性套式淋巴瘤 細(xì)胞的殺傷結(jié)果。結(jié)果顯示未被基因修飾的T細(xì)胞對(duì)Jeko-Ι和Maver-Ι細(xì)胞的殺傷效率 分別為30%和32%，第二代⑶19-CAR-T細(xì)胞（只含有⑶28 -個(gè)共刺激因子，沒(méi)有⑶137 共刺激因子）對(duì)上述2種腫瘤細(xì)胞的殺傷效率分別為50%和60%，而我們構(gòu)建的新一代 ⑶19-CAR-T細(xì)胞對(duì)上述2種腫瘤細(xì)胞的殺傷效率分別高達(dá)78%和75%。而未被基因修飾 的T細(xì)胞與第二代⑶19-CAR-T細(xì)胞及新一代⑶19-CAR-T細(xì)胞對(duì)293T細(xì)胞（⑶19陰性細(xì) 胞系）的殺傷效率沒(méi)有顯著差別（13%，25%，24%)。結(jié)果顯示利用本發(fā)明構(gòu)建的新一代 ⑶19-CAR-T細(xì)胞比第二代⑶19-CAR-T細(xì)胞對(duì)⑶19陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺傷效果。
【具體實(shí)施方式】
[0094] 本發(fā)明人通過(guò)廣泛而深入的研究，獲得一種具有較高殺傷能力的新一代嵌合抗原 受體（CAR)，表達(dá)該嵌合抗原受體的T細(xì)胞其具有顯著的抗腫瘤效應(yīng)。本發(fā)明還提供了一種 速構(gòu)建該新一代CAR的方法。
[0095] 嵌合抗原受體（CAR)
[0096] 過(guò)繼細(xì)胞免疫治療技術(shù)（adoptive cellular immunotherapy)是應(yīng)用嵌合抗原受 體基因修飾的T細(xì)胞過(guò)繼性地靶向性治療腫瘤的技術(shù)。該技術(shù)在臨床上取得了非常顯著的 進(jìn)展。最為代表性的是以⑶19為靶向的CAR-T細(xì)胞治療⑶19陽(yáng)性的B細(xì)胞白血病和淋巴 瘤的基礎(chǔ)和臨床研究。
[0097] CAR-T細(xì)胞治療的關(guān)鍵在于構(gòu)建能夠靶向腫瘤相關(guān)抗原的嵌合抗原受體（CAR)， 該嵌合抗原受體主要由識(shí)別靶向分子的膜外片段，連接片段，和胞內(nèi)傳遞信號(hào)及效應(yīng)分子 的膜內(nèi)片段組成。膜外片段主要來(lái)源于抗原特異性的抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)片段由中間連 接分子相連組成的單鏈抗體（scFV)組成，中間片段是由Fc來(lái)源的連接和穿膜片段組成，膜 內(nèi)片段由傳遞信號(hào)及效應(yīng)分子主要如CD3 δ組成。
[0098] 一方面，本發(fā)明提供了一種嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體具有式la、或式lb 所述結(jié)構(gòu)：
[0099] A-B-C-D(Ia)，或
[0100] A-C-B-D(Ib),
[0101] 其中，
[0102] A為Fc來(lái)源的多肽元件；
[0103] B為⑶28來(lái)源的多肽元件；
[0104] C為⑶137來(lái)源的多肽元件；
[0105] D為⑶3 δ來(lái)源的多肽元件；
[0106] " "表示連接上述各元件的肽鍵或肽接頭。
[0107] 在優(yōu)選地實(shí)施方式中，多肽元件Α為Fc胞外區(qū)序列，其氨基酸序列為：
[0109] 其編碼核苷酸序列為：


[0111] 在優(yōu)選地實(shí)施方式中，多肽元件B為CD28跨膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)序列，其氨基酸序列 為：
[0113] 其編碼核苷酸序列為：
[0115] 在優(yōu)選地實(shí)施方式中，多肽元件C為CD137胞內(nèi)區(qū)序列，其氨基酸序列為：
[0117] 其編碼核苷酸序列為：
[0119] 在優(yōu)選地實(shí)施方式中，多肽元件D為⑶3 δ胞內(nèi)區(qū)序列，其氨基酸序列為：
[0121] 其編碼核苷酸序列為：
[0123] 在優(yōu)選地實(shí)施方式中，所述嵌合抗原受體的氨基酸序列（新一代CAR完整序列） 為：
[0125] 其編碼核苷酸序列為：

[0127] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"嵌合抗原受體"還包括具有上述活性的、SEQ ID NO :10序列的 變異形式。這些變異形式包括（但并不限于）：1-3個(gè)（通常為1-2個(gè)，更佳地1個(gè)）氨基 酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一個(gè)或數(shù)個(gè)（通常為3 個(gè)以內(nèi)，較佳地為2個(gè)以內(nèi)，更佳地為1個(gè)以內(nèi)）氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或 相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添 加或缺失一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。此外，所述術(shù)語(yǔ)還包括 單體和多聚體形式的本發(fā)明多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括線性以及非線性的多肽（如環(huán)肽）。
[0128] 本發(fā)明還包括上述嵌合抗原受體的活性片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語(yǔ) "片段"、"衍生物"和"類似物"是指基本上保持本發(fā)明嵌合抗原受體的功能或活性的多肽。 本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是（i)有一個(gè)或幾個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基 (優(yōu)選保守性氨基酸殘基）被取代的多肽，或（i i)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基 團(tuán)的多肽，或（i i i)抗原肽與另一個(gè)化合物（比如延長(zhǎng)多肽半衰期的化合物，例如聚乙二 醇）融合所形成的多肽，或（iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽（與前 導(dǎo)序列、分泌序列或6His等標(biāo)簽序列融合而形成的嵌合抗原受體）。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些 片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
[0129] 一類優(yōu)選的活性衍生物指與式I的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多5 個(gè)，更佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變 異多肽最好根據(jù)表A進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
[0130] 表 A
[0131]
[0133] 本發(fā)明還提供本發(fā)明嵌合抗原受體的類似物。這些類似物與SEQ ID NO: 10所示 的多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或 者兼而有之。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基（如D-氨基酸）的類似物， 以及具有非天然存在的或合成的氨基酸（如β、Y-氨基酸）的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的 多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽，這些而多肽均落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍之 內(nèi)。
[0134] 修飾（通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu)）形式包括：體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙 ?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn) 行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過(guò)將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶（如哺乳動(dòng) 物的糖基化酶或去糖基化酶）而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基（如磷酸酪 氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸）的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu) 化了溶解性能的多肽。
[0135] 另一方面，本發(fā)明提供了一種可以快速構(gòu)建針對(duì)不同腫瘤抗原的CAR載體，包括 步驟：將本發(fā)明的嵌合抗原受體（Fc-CD28-CD137-CD3 δ )片段克隆到cdh-cmv-efl-copgfp 慢病毒載體上。當(dāng)需要構(gòu)建針對(duì)不同腫瘤抗原的CAR載體時(shí)，只需把靶向腫瘤抗原的相應(yīng) 單鏈抗體序列插入這個(gè)載體就可以了，不需要再?gòu)念^開(kāi)始繁瑣的一步步克隆，能大大的節(jié) 約時(shí)間和實(shí)驗(yàn)成本。
[0136] 如本文所用，"分離的"是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(lái)（如果是天然的物質(zhì)， 原始環(huán)境即是天然環(huán)境）。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多核苷酸和多肽是沒(méi)有分離純化 的，但同樣的多核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開(kāi)，則為分離純化的。
[0137] 本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA 或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。
[0138] 本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的蛋 白質(zhì)片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然 發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域 所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失 或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼多肽的功能。
[0139] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"引物"指的是在與模板配對(duì)，在DNA聚合酶的作用下能以其為 起點(diǎn)進(jìn)行合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈的寡居核苷酸的總稱。引物可以是天然的RNA、DNA，也可 以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物"大 致上"（或"基本上"）與模板上一條鏈上的一個(gè)特殊的序列互補(bǔ)。引物必須與模板上的一 條鏈充分互補(bǔ)才能開(kāi)始延伸，但引物的序列不必與模板的序列完全互補(bǔ)。比如，在一個(gè)3' 端與模板互補(bǔ)的引物的5'端加上一段與模板不互補(bǔ)的序列，這樣的引物仍大致上與模板 互補(bǔ)。只要有足夠長(zhǎng)的引物能與模板充分的結(jié)合，非完全互補(bǔ)的引物也可以與模板形成引 物-模板復(fù)合物，從而進(jìn)行擴(kuò)增。
[0140] 本發(fā)明嵌合抗原受體或其元件的核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增 法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)已公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤 其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方 法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多 次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
[0141] 一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將 其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
[0142] 此外，還可用人工合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常，通 過(guò)先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。
[0143] 應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。用于PCR的引 物可根據(jù)本文所公開(kāi)的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方 法如通過(guò)凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。
[0144] 本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或嵌合抗原受 體編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述蛋白質(zhì)的方法。
[0145] 通過(guò)常規(guī)的重組DNA技術(shù)，可利用本發(fā)明的多核苷酸序列可用來(lái)表達(dá)或生產(chǎn)重組 蛋白。一般來(lái)說(shuō)有以下步驟：
[0146] (1).用本發(fā)明的編碼本發(fā)明蛋白的多核苷酸（或變異體），或用含有該多核苷酸 的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；
[0147] (2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；
[0148] (3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
[0149] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含本發(fā)明蛋白的編碼DNA序列和合適 的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi) 重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。 表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。
[0150] 此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的 宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋 白（GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
[0151] 包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適 當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
[0152] 宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高 等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選為T(mén)細(xì)胞。代表性例子有：大腸桿菌，鏈霉菌屬的細(xì)菌細(xì) 胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲(chóng)細(xì)胞；CHO、NSO、C0S7、或293細(xì)胞的 動(dòng)物細(xì)胞等。
[0153] 用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原 核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用0 &(：12法處理， 所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的 方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法：磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方 法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
[0154] 獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用 的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下 進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法（如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo)） 誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
[0155] 在上面的方法中的蛋白質(zhì)可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果 需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過(guò)各種分離方法分離和純化蛋白。這些方法是 本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于：常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀 劑處理（鹽析方法）、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析（凝膠過(guò)濾）、吸附層析、 離子交換層析、高效液相層析（HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
[0156] 抗體
[0157] 本發(fā)明中，"抗體"可互換使用，是指對(duì)本發(fā)明蛋白具有特異性的多克隆抗體和單 克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，"特異性"是指抗體能分別結(jié)合于本發(fā)明蛋白或其片 段。較佳地，指那些能與本發(fā)明蛋白或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的 抗體。本發(fā)明的抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。
[0158] 本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片 段，如Fab'或（Fab) 2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗 體。
[0159] 膚接頭
[0160] 本發(fā)明提供了一種嵌合抗原受體，它可任選地含有肽接頭。肽接頭大小和復(fù)雜性 可能會(huì)影響蛋白的活性。通常，肽接頭應(yīng)當(dāng)具有足夠的長(zhǎng)度和柔韌性，以保證連接的兩個(gè)蛋 白在空間上有足夠的自由度以發(fā)揮其功能。同時(shí)避免肽接頭中形成α螺旋或β折疊等對(duì) 嵌合抗原受體的穩(wěn)定性的影響。
[0161] 連接肽的長(zhǎng)度一般為0-10個(gè)氨基酸,較佳地1-5個(gè)氨基酸。
[0162] 藥物組合物及施用方法
[0163] 本發(fā)明還提供了一種組合物，它含有有效量的本發(fā)明的嵌合抗原受體或表達(dá)該嵌 合抗原受體的宿主細(xì)胞，以及藥學(xué)上可接受的載體。通常，可將本發(fā)明的嵌合抗原受體或表 達(dá)該嵌合抗原受體的宿主細(xì)胞配制于無(wú)毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中， 其中pH通常約為5-8,較佳地，pH約為6-8。
[0164] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"有效量"或"有效劑量"是指可對(duì)人和/或動(dòng)物產(chǎn)生功能或 活性的且可被人和/或動(dòng)物所接受的量，如0. 〇〇l-99wt% ;較佳的0. 01-95wt% ;更佳的， 0. l-90wt%。
[0165] 如本文所用，"藥學(xué)上可接受的"的成分是適用于人和/或哺乳動(dòng)物而無(wú)過(guò)度不良 副反應(yīng)（如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng)）的，即具有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)上 可接受的載體"指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。
[0166] 本發(fā)明的藥物組合物含有安全有效量的本發(fā)明的嵌合抗原受體或表達(dá)該嵌合抗 原受體的宿主細(xì)胞以及藥學(xué)上可接受的載體。這類載體包括（但并不限于）：鹽水、緩沖液、 葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。通常藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配，本發(fā)明的藥物組合 物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過(guò)常規(guī)方法 進(jìn)行制備。所述的藥物組合物宜在無(wú)菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量。本 發(fā)明的藥物制劑還可制成緩釋制劑。
[0167] 本發(fā)明嵌合抗原受體或表達(dá)該嵌合抗原受體的宿主細(xì)胞的有效量可隨給藥的模 式和待治療的疾病的嚴(yán)重程度等而變化。優(yōu)選的有效量的選擇可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人 員根據(jù)各種因素來(lái)確定（例如通過(guò)臨床試驗(yàn)）。所述的因素包括但不限于：本發(fā)明嵌合抗 原受體或表達(dá)該嵌合抗原受體的宿主細(xì)胞的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)例如生物利用率、代謝、半衰 期等；患者所要治療的疾病的嚴(yán)重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。針 對(duì)腫瘤患者，通常，當(dāng)本發(fā)明的嵌合抗原受體或表達(dá)該嵌合抗原受體的宿主細(xì)胞每天以約 0. 5mg-5mg/kg動(dòng)物體重（較佳的2mg-4mg/kg動(dòng)物體重）的劑量給予，能得到令人滿意的效 果。例如，由治療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開(kāi)的劑量，或?qū)┝堪幢壤販p少。
[0168] 本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于：
[0169] 1.本發(fā)明提供了一種新一代的CAR，表達(dá)該CAR的CAR-T細(xì)胞，具有較高細(xì)胞殺傷 能力。
[0170] 2.本發(fā)明提供了能夠快速構(gòu)建新一代CAR的載體，以及能夠快速構(gòu)建新一代CAR 的方法。
[0171] 3.利用本發(fā)明能快速制備靶向特定腫瘤抗原的新一代CAR-T細(xì)胞，使用本發(fā)明的 CAR載體在T細(xì)胞表面進(jìn)行表達(dá)，轉(zhuǎn)染效率高達(dá)30 %。
[0172] 4.利用本發(fā)明制備的新一代⑶19-CAR-T細(xì)胞對(duì)⑶19陽(yáng)性淋巴瘤細(xì)胞具有明顯的 殺傷作用。
[0173] 5.本發(fā)明構(gòu)建的新一代CAR載體除了可以在慢病毒載體上表達(dá)，還可以構(gòu)建到逆 轉(zhuǎn)錄病毒載體及睡美人表達(dá)系統(tǒng)中。
[0174] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步詳陳本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明詳細(xì)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和 份數(shù)按重量計(jì)算。以下實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料和試劑如無(wú)特別說(shuō)明均可從市售渠道獲 得。
[0175] 材料和方法
[0176] 1.酶切方法：
[0177] 按表1配成50ul反應(yīng)體系，37°C酶切3至6小時(shí)，酶切后跑瓊脂糖凝膠電泳，用 AXYGEN的DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化。
[0178] 表 1
[0179]
[0180] 2.連接方法：
[0181] 按表2配成20ul反應(yīng)體系，16°C連接8小時(shí)后，將連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
[0182] 表 2
[0183]

[0184] 3.轉(zhuǎn)化方法：
[0185] ⑴分別在1管100 μ 1的DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中加入l_2ul質(zhì)粒，輕輕旋轉(zhuǎn) 以混勻內(nèi)溶物，冰浴30min ;
[0186] ⑵將離心管放至42°C的循環(huán)水浴中熱激90s ;
[0187] ⑶快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻至室溫；
[0188] ⑷每管加800 μ 1 LB液體培養(yǎng)基，37°C搖床中200r/min搖45min ;
[0189] (5)取200ul轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)移到含相應(yīng)抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，用 一無(wú)菌的彎頭玻璃棒將菌液涂滿整個(gè)平板表面；
[0190] (6)將平板置于超凈臺(tái)中直至平板表面菌液被吸收；
[0191] (7)封好平皿，倒置于37°C培養(yǎng)，12_16h。
[0192] 4.菌檢方法：
[0193] 用槍頭從轉(zhuǎn)化好的平板中挑取單克隆于10ul的LB培養(yǎng)基中混勻，每個(gè)平板可以 挑取6-10個(gè)克隆。以挑取的單克隆為模板進(jìn)行PCR，菌檢PCR體系（25ul體系）如下：
[0194]
[0195] 反應(yīng)條件：95°C 5min，25 個(gè)循環(huán)（95°C 30sec，50°C 30sec，72°C lmin)，最后 72°C 孵育7min。
[0196] 將菌檢是陽(yáng)性的克隆的菌液或質(zhì)粒送公司測(cè)序。
[0197] cdh-cmv-ef 1-copgfp慢病毒載體菌檢引物：
[0198] 引物 1 序列為：5' -ACGGTGGGAGGTCTATATAAGCA-3' (SEQ ID NO. :11);
[0199] 引物 2 序列為：5' -GCCGACCCCTCCCCCCAACTTCT-3' （SEQ ID NO. :12)。
[0200] 5、T細(xì)胞制備及激活方法：
[0201] 抽取健康人外周血，用Ficoll-Paque Plus試劑從外周血中分離得到淋巴細(xì)胞。將 lX106/ml淋巴細(xì)胞置于10% FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，每7天加入100ul的人類 淋巴細(xì)胞激活擴(kuò)增試劑（由博生吉醫(yī)藥科技（蘇州）有限公司提供），每2天加入100IU/ ml幾-2,5%0)2,371：條件下培養(yǎng)。刺激3天后，可以看到細(xì)胞成聚團(tuán)現(xiàn)象，顯示細(xì)胞已經(jīng) 被活化，活化的細(xì)胞可以用來(lái)進(jìn)行慢病毒的轉(zhuǎn)染。
[0202] 6、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)方法：
[0203] 選用兩組細(xì)胞，一組為⑶19陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞：Maver-l、Jeko-Ι，一組為⑶19陰性腫 瘤細(xì)胞：293T細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞分別為CAR-T細(xì)胞和未被基因修飾的T細(xì)胞。設(shè)置效靶比 5:1，殺傷時(shí)間為12h。用CFSE(購(gòu)自Life technologies公司）標(biāo)記上述4種腫瘤細(xì)胞，向 每孔中分別加入效應(yīng)T細(xì)胞。12h后，收集細(xì)胞，加入7-ADD抗體（購(gòu)自BD公司）進(jìn)行流式 檢測(cè)。
[0204] 實(shí)施例1FC-CD28-CD137-CD3 δ片段-慢病毒載體的構(gòu)建
[0205] 將人Fc胞外區(qū)序列（SEQ ID NO. : 2)，CD28跨膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)序列（SEQ ID N0. :4)，CD137 胞內(nèi)區(qū)序列（SEQ ID NO. :6)及 0)3δ 胞內(nèi)區(qū)序列（SEQ ID NO. :8)按Fc-CD28-CD137-CD3 δ的順序基因合成，兩端加 EcoRI和Notl的酶切 位點(diǎn)。Fc-⑶28-⑶137-⑶3 δ基因合成好后用EcoRI和Notl酶將片段酶切下來(lái)， cdh-cmv-efl-copgfp慢病毒載體（購(gòu)自Addgene公司，在EcoRI酶切位點(diǎn)前面還有兩個(gè) 酶切位點(diǎn)（乂&&1，他61))也用相同的酶進(jìn)行酶切，將？〇402840137403 3片段克隆到 cdh-cmv-efl-copgfp 慢病毒載體上，得到了 Fc_CD28-CD137_CD3 δ -cdh-cmv-efl-copgfp 慢病毒重組載體。
[0206] 因?yàn)閏dh-cmv-efl-copgfp慢病毒載體上EcoRI酶切位點(diǎn)前面還有兩個(gè)酶切位點(diǎn) (Xbal，Nhel)，這樣能夠方便地構(gòu)建針對(duì)不同免疫原的各種CAR載體，只需把需要的單鏈抗 體序列直接插入這其中的兩個(gè)酶切位點(diǎn)的位置就可以了。
[0207] 將上述Fc-CD28-CD137-CD3 δ -cdh-cmv-efl-copgfp慢病毒重組載體轉(zhuǎn)化到大腸 桿囷中，培養(yǎng)后囷檢。
[0208] 圖 1 為 Fc-CD28-CD137_CD3 δ 片段和 cdh-cmv-efl-copgfp 載體酶切圖（Ecorl/ Notl雙酶切）。其中泳道1和2代表Fc-⑶28-⑶137-⑶3 δ片段從T載體上切下來(lái)的酶切 圖，泳道3和4代表cdh-cmv-efl-copgfp載體的酶切圖。
[0209] 圖 2 為 Fc-CD28-CD137_CD3 δ 片段連接到 cdh-cmv-efl-copgfp 載體上的菌檢圖。 共挑了 10個(gè)克隆菌檢，菌檢到6個(gè)陽(yáng)性克隆，經(jīng)測(cè)序，序列與預(yù)期一致，說(shuō)明本實(shí)施例中成 功構(gòu)建了 Fc_CD28-CD137_CD3 δ -cdh-cmv-efl-copgfp 慢病毒載體。
[0210] 實(shí)施例2新一代⑶19-CAR載體的構(gòu)建
[0211] CD19單鏈抗體序列的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列來(lái)自于鼠抗人CD19單克隆抗體雜交 瘤細(xì)胞（PGC3D6H10單克隆抗體，中國(guó)專利申請(qǐng)：201510016959. 9)。將VH(CD19單抗重鏈 可變區(qū)序列），Linker序列，VL(⑶19單抗輕鏈可變區(qū)序列）按順序用overlap PCR方法 得到一條CD19單鏈抗體序列（引物兩端含有Xbal和Ecorl酶切位點(diǎn)，用于直接亞克隆到 Fc-CD28-CD137-CD3 δ片段-cdh-cmv-efl-copgfp慢病毒載體上），將CD19單鏈抗體片段 和 Fc_CD28-CD137_CD3 δ -cdh-cmv-efl-copgfp 慢病毒載體分被用 Xbal 和 Ecorl 酶切后， 進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化，菌檢，測(cè)序，⑶19-CAR-cdh-cmv-efl-copgfp慢病毒載體構(gòu)建完成。
[0212] 圖3為用overlap PCR擴(kuò)增得到的⑶19單鏈抗體序列（VH-1 inker-VL)。
[0213] 圖 4 為 CD19 單鏈抗體序列插入到 Fc_CD28-CD137_CD3 δ -cdh-cmv-efl-copgfp 慢 病毒載體的菌檢圖。挑選18個(gè)克隆進(jìn)行菌檢，共檢測(cè)到9個(gè)陽(yáng)性克隆，挑取三個(gè)送公司測(cè) 序，測(cè)序正確，新一代⑶19-CAR載體（第三代⑶19-CAR載體）構(gòu)建成功。
[0214] ⑶19單鏈抗體編碼序列如下：
[0216] 實(shí)施例3新一代⑶19-CAR-T細(xì)胞的制備及對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷檢測(cè)
[0217] 將得到的新一代⑶19-CAR-T慢病毒載體用三質(zhì)粒（Rev質(zhì)粒（購(gòu)自Addgene公 司）、VSV-G質(zhì)粒（購(gòu)自Addgene公司）和Λ R質(zhì)粒（購(gòu)自Addgene公司））包裝系統(tǒng)和 293T細(xì)胞（購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù)）進(jìn)行慢病毒的包裝。收獲病毒后濃縮，獲得濃縮過(guò)的新一代 CD19-CAR-cdh-cmv_ef Ι-copgfp 病毒液。
[0218] 病毒濃縮后進(jìn)行T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。利用Ficoll-Paque Plus試劑（購(gòu)自GE Healthcare公司）從外周血中分離得到PBMC。T細(xì)胞經(jīng)活化后，取出1X106個(gè)細(xì)胞，加入濃 縮過(guò)的新一代⑶19-CAR-cdh-cmv-efl-copgfp病毒液，混勻，Μ0Ι = 30。一周后對(duì)轉(zhuǎn)染的T 細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)目的蛋白的檢測(cè)。
[0219] 圖5為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的利用本發(fā)明構(gòu)建的新一代CD19-CAR載體在T細(xì)胞表面 上的表達(dá)情況。圖5中左圖顯示了未轉(zhuǎn)染新一代⑶19-CAR載體的T細(xì)胞的流式檢測(cè)圖；右 圖顯示了轉(zhuǎn)染了新一代CD19-CAR載體的T細(xì)胞流式檢測(cè)圖。結(jié)果表明有30%的細(xì)胞是Fc 與GFP(慢病毒載體本身表達(dá)GFP蛋白）雙陽(yáng)性，說(shuō)明利用本發(fā)明構(gòu)建的新一代CD19-CAR 能夠在T細(xì)胞表面表達(dá)，且轉(zhuǎn)染效率為30%。
[0220] 使用本發(fā)明的表達(dá)新一代⑶19-CAR的T細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。
[0221] 圖6為本發(fā)明構(gòu)建的新一代⑶19-CAR-T細(xì)胞對(duì)⑶19陽(yáng)性套式淋巴瘤細(xì)胞（細(xì)胞 株編號(hào)：CRL-3006?，CRL-3008?，購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)，）的殺傷結(jié)果。結(jié)果顯示未被基因 修飾的T細(xì)胞對(duì)Jeko-Ι和Maver-Ι細(xì)胞的殺傷效率分別為30%和32%。
[0222] 作為對(duì)照的第二代⑶19-CAR-T細(xì)胞（只含有⑶28 -個(gè)共刺激因子，沒(méi)有⑶137 共刺激因子，其余結(jié)構(gòu)同本發(fā)明的新一代CD19-CAR-T細(xì)胞，制備方法同上）對(duì)上述2種腫 瘤細(xì)胞的殺傷效率分別為50%和60%，而本發(fā)明中構(gòu)建的新一代⑶19-CAR-T細(xì)胞對(duì)上 述2種腫瘤細(xì)胞的殺傷效率分別高達(dá)78%和75%。而未被基因修飾的T細(xì)胞與第二代 ⑶19-CAR-T細(xì)胞及新一代⑶19-CAR-T細(xì)胞對(duì)293T細(xì)胞（⑶19陰性細(xì)胞系）的殺傷效率沒(méi) 有顯著差別（13%，25%，24%)。結(jié)果顯示利用本發(fā)明構(gòu)建的新一代⑶19-CAR-T細(xì)胞比第 二代⑶19-CAR-T細(xì)胞對(duì)⑶19陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺傷效果，與第二代⑶19-CAR-T細(xì) 胞對(duì)照組相比，殺傷效率提高了 50%以上。
[0223] 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范 圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種嵌合抗原受體（CAR)，其特征在于，所述嵌合抗原受體具有式la、或式lb所述結(jié) 構(gòu)： A_B_C_D(la)，或 A-C-B-D(Ib)， 其中， A為Fc來(lái)源的多肽元件； B為⑶28來(lái)源的多肽元件； C為⑶137來(lái)源的多肽元件； D為⑶3 δ來(lái)源的多肽元件； 表示連接上述各元件的肽鍵或肽接頭。2. 如權(quán)利要求1所述的嵌合抗原受體，其特征在于，所述多肽元件Α選自下組： (A) 具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽； (B) 具有與SEQ ID NO: 2中任一所示氨基酸序列彡80%同源性（優(yōu)選地，彡90%的同 源性；等優(yōu)選地彡95%的同源性；最優(yōu)選地，彡97%的同源性）的多肽； (C) 將SEQ ID N0:2中所示氨基酸序列經(jīng)過(guò)1-5個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形 成的衍生多肽；和/或 所述多肽元件B選自下組： (A) 具有SEQ ID N0:4所示氨基酸序列的多肽； (B) 具有與SEQ ID NO:4中任一所示氨基酸序列彡80%同源性（優(yōu)選地，彡90%的同 源性；等優(yōu)選地彡95%的同源性；最優(yōu)選地，彡97%的同源性）的多肽； (C) 將SEQ ID N0:4中任一所示氨基酸序列經(jīng)過(guò)1-5個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加 而形成的衍生多肽；和/或 所述多肽元件C選自下組： (A) 具有SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的多肽； (B) 具有與SEQ ID NO: 6所示氨基酸序列彡80%同源性（優(yōu)選地，彡90%的同源性； 等優(yōu)選地彡95%的同源性；最優(yōu)選地，彡97%的同源性）的多肽； (C) 將SEQ ID N0:6中所示氨基酸序列經(jīng)過(guò)1-5個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形 成的衍生多肽；和/或 所述多肽元件D選自下組： (A) 具有SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的多肽； (B) 具有與SEQ ID NO: 8所示氨基酸序列彡80%同源性（優(yōu)選地，彡90%的同源性； 等優(yōu)選地彡95%的同源性；最優(yōu)選地，彡97%的同源性）的多肽； (C) 將SEQ ID N0:8所示氨基酸序列經(jīng)過(guò)1-5個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成 的衍生多肽。3. 如權(quán)利要求1所述的嵌合抗原受體，其特征在于，所述嵌合抗原受體的氨基酸序列 如 SEQ ID NO. :10 所示。4. 如權(quán)利要求1所述的嵌合抗原受體，其特征在于，所述多肽元件A的外側(cè)還連接有單 克隆抗體；優(yōu)選地，所述單克隆抗體為抗CD19單克隆抗體。5. -種分離的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸編碼權(quán)利要求1所述的嵌合抗原 受體。6. -種載體，其特征在于，所述載體包含權(quán)利要求5所述的多核苷酸； 優(yōu)選地，所述載體選自：慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、和睡美人表達(dá)系統(tǒng)。7. -種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞表達(dá)權(quán)利要求1所述的嵌合抗原受體；和 /或 所述宿主細(xì)胞基因組中整合有權(quán)利要求5所述的多核苷酸；和/或 所述宿主細(xì)胞含有權(quán)利要求6所述的載體。8. -種制備嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞的方法，其特征在于，包括步驟： 在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)表達(dá)權(quán)利要求1所述的嵌合抗原受體的T細(xì)胞，從而制備出 所述嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞； 優(yōu)選地，所述方法包括步驟： (1) 構(gòu)建慢病毒載體 所述慢病毒載體包含式II所示的核苷酸序列： e-i II i為編碼權(quán)利要求1所述的CAR的核苷酸序列， e為編碼抗體的核苷酸序列， e連接于多肽元件A的編碼序列的外側(cè)； (2) 慢病毒包裝 將步驟（1)的慢病毒載體，用慢病毒包裝系統(tǒng)和293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝，收獲病毒 液， 所述慢病毒包裝系統(tǒng)包括質(zhì)粒：Rev質(zhì)粒、VSV-G質(zhì)粒、和Λ R質(zhì)粒； (3) Τ細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將步驟（2)獲得病毒液濃縮后轉(zhuǎn)染Τ細(xì)胞，即獲得所述嵌合抗原受體修飾的Τ細(xì)胞。9. 一種藥物組合物，其特征在于，所述組合物包含：權(quán)利要求1所述的嵌合抗原受體、 權(quán)利要求5所述的多核苷酸、權(quán)利要求6所述的載體、或者權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，以 及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。10. 權(quán)利要求1所述的嵌合抗原受體、權(quán)利要求2所述的分離的多核苷酸 的用途， (1) 用于制備治療腫瘤的藥物；和/或 (2) 用于制備嵌合抗原受體修飾的Τ細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK105985444SQ201510061635
【公開(kāi)日】2016年10月5日
【申請(qǐng)日】2015年2月5日
【發(fā)明人】楊林, 游鳳濤, 姜麗翠
【申請(qǐng)人】博生吉醫(yī)藥科技(蘇州)有限公司